나노입자 전달 아르테수네이트, 미토콘드리아 아폽토시스 활성화로 항종양 효능 향상

초록

아르테미시닌과 그 유도체는 광범위한 항암 활성을 가지며 종양 세포에서 유의미한 항암 효과를 나타낸다. 이들은 빠르게 흡수되고 광범위하게 분포하며 선택적으로 종양 세포를 사멸시킨다. 그러나 저농도 아르테수네이트(Ats)는 주로 온코시스(oncosis)에 의존해 종양 세포 사멸을 유도하므로 항종양 효과가 제한적이다. 본 연구에서는 새로운 나노기술을 활용해 소혈청 알부민(BSA) 나노입자에 아르테수네이트를 탑재한 신규 제제를 설계하여 아르테수네이트의 미토콘드리아 축적을 유도하고 미토콘드리아 매개 아폽토시스를 유발하였다. 그 결과, 자유 Ats가 온코시스성 사멸에 의존하는 것과 달리 Ats 탑재 BSA 나노입자는 더 높은 세포독성을 보였으며, 미토콘드리아 내 Ats 분포를 통해 유의미한 아폽토시스 효과를 유도하였다. 이는 Ats 탑재 BSA 나노입자가 미토콘드리아 무결성을 손상시키고 아폽토시스 관련 단백질 상향 조절 및 사이토크롬 C의 빠른 방출을 촉진해 미토콘드리아 매개 세포 아폽토시스를 활성화함을 시사한다.

배경

아르테미시닌과 그 유도체는 높은 항말라리아 활성과 낮은 독성으로 말라리아 치료에 널리 사용되어 왔다. 연구자들은 또한 이들이 적은 독성 부작용과 환자 내약성 덕분에 유의미한 항종양 활성을 가짐을 발견하였다 [1]. 아르테수네이트(Ats)가 종양 세포 성장을 확실하게 억제하고 종양 세포에서 유의미한 항암 효과를 유도함이 보고되었다 [2-4]. 일부 실험에서 Ats가 48시간 후 종양 세포에서 다양한 정도의 아폽토시스와 온코시스를 유도하며, 그 정도는 Ats 용량에 의존함이 밝혀졌다. 저농도에서 Ats는 명백한 아폽토시스를 유도하지 못하며 Ats 유도 세포 사멸은 온코시스 유사 사멸을 동반한다 [5-8]. 더 높은 Ats 용량을 적용해 더 큰 항종양 효과를 얻으려 했으나, 이는 심각한 독성과 골수 억제를 확인시켜 주었다. 따라서 Ats의 유효 용량을 줄여 항종양 효율을 높이는 효과적인 치료법 모색이 필요하다 [9-11]. 미토콘드리아가 Ats의 아폽토시스 및 온코시스 효과 조절에 중요한 역할을 하며, 다양한 아폽토시스 신호 전달 과정에도 관여함이 알려졌다 [12-17]. 약물에 의해 미토콘드리아가 공격받으면 투과성이 증가하고 막 전위가 감소해 미토콘드리아 막 내막 부종과 사이토크롬 C의 세포질로의 빠른 방출을 초래한다 [18-20]. 또한 카스파제 계열 단백질이 활성화되어 세포 아폽토시스 연쇄 반응이 유도된다.

Ats의 항종양 효과를 높이기 위해 약물의 종양 세포 내 분포를 늘리거나 세포 소기관으로의 표적 전달을 개선해 세포 사멸을 유도하는 많은 새로운 기술이 시도되었다 [21-23]. 나노입자(NP)는 표적 암 치료의 핵심 도구로 널리 연구되어 유망한 잠재력을 보였다. NP는 작은 입자 크기와 큰 비표면적 덕분에 모세혈관을 통해 혈액 순환에 진입하고 내피 세포 틈을 통과해 종양 부위로 이동, 약물 표적 분포를 달성하고 생체이용률을 높인다. 또한 생체재료 분해를 통해 약물 방출을 길고 부드럽게 제어해 제거 반감기 연장, 유효 혈중 농도 개선, 투여 빈도 감소가 가능하다. 무엇보다 약물 탑재 NP는 세포 내 특정 위치로 전달되어 치료 효율을 높일 수 있다 [24-26].

저농도에서 Ats의 항종양 효과를 높이기 위해 새로운 Ats 탑재 BSA NP를 설계하였다. 종양 세포 내 낮은 pH로 인해 외측 미토콘드리아 막 또는 막간 공간에 다량의 수소 양성자가 축적되는 반면, 미토콘드리아 내막은 화학적 조성과 미토콘드리아 기질 분비로 인해 음전하가 풍부해 양전하 밖-음전하 안 막전위를 형성, BSA 전달에 유리하다. 이에 따라 미토콘드리아 내 대량 Ats 축적이 미토콘드리아 매개 아폽토시스를 효과적으로 유발할 수 있다. 결과적으로 자유 Ats가 유도하는 전형적인 온코시스 사멸과 달리, Ats가 BSA NP 매개로 미토콘드리아로 특이적으로 전달되어 아폽토시스 관련 카스파제 단백질의 미토콘드리아 매개 활성화를 촉진하였다. 이는 유의미한 세포 아폽토시스를 유발해 더 높은 세포독성을 강조한다.

실험 방법

재료

BSA는 Sigma-Aldrich(미국), Ats는 Guilin Pharmaceutical(중국)에서 구입하였다. SMMC-7721 세포와 Plc 세포는 중국과학원 상하이 생화학 및 세포생물학 연구소에서 분양받았다. 기타 시약은 분석급으로 다양한 공급업체에서 구입하였다.

Ats 탑재 BSA NP 제조 및 특성 분석

기존 문헌 [27]에 따라 탈용매법으로 Ats 탑재 BSA NP를 제조하였다. 간단히, 37 °C에서 0.5 mL BSA 용액에 일정량의 Ats를 함유한 1.0 mL 무수 알코올을 급속히 떨어뜨려 유백색이 될 때까지 섞었다. 회전 증발로 에탄올을 제거한 후, 8% 글루타르알데히드 수용액(BSA mg당 0.5 μL)을 현탁액에 가해 24시간 교반하며 입자 가교를 유도하였다. 마지막으로 NP를 수집하고 탈염수로 3회 세척한 후 Brookhaven Zetasizer와 투과 전자 현미경(JEM-1200EX)으로 입자 크기, 분산도 지수(PDI), 제타 전위, 형태 등 물리적 특성을 분석하였다. Ats의 BSA NP 내 포집 효율은 기존 방법 [27]으로 측정하였다.

MTT 분석

SMMC-7721 세포와 Plc 세포를 20% 태아 소 혈청(FBS)으로 배양하고 세포 밀도를 1×10⁶ cells/mL로 조정한 후 1×10⁵ cells/mL로 희석하였다. 96웰 플레이트에 웰당 100 μL(약 1×10⁴ 세포)로 분주해 37 °C, 5% CO₂, 95% O₂ 조건에서 24시간 배양하였다. 배지를 무혈청 배지로 교체하고 자유 Ats 또는 다양한 농도의 Ats 탑재 BSA NP를 처리 후 24시간 배양하였다. 웰당 50 μL MTT(5 mg/mL)를 가해 4시간 배양 후 원심분리(1000 rpm, 5분)하여 상층액을 제거하고 DMSO 150 μL로 포르마잔 결정을 용해시켰다. 마이크로플레이트 리더(Syneray-2)로 490 nm에서 흡광도를 측정하였다.

세포 내 BSA NP 분포 관찰

대수 증식기 SMMC-7721 및 Plc 세포를 트립신 처리 후 1×10⁶ cells/mL로 조절해 6웰 플레이트에 부착시켰다. 배지 제거 후 로다민 B 표지 BSA NP를 첨가하였다. 핵은 Hoechst(청색)로 15분 염색(37 °C), 미토콘드리아는 Mitotracker Green FM으로 염색하였다. 공초점 레이저 주사 현미경(FluoView FV10i, Olympus)으로 세포 내 BSA NP 위치를 추적하였다.

미토콘드리아 막 전위 변화 측정

JC-1 염색으로 미토콘드리아 막 전위 변화를 측정하였다. 막 전위가 높으면 JC-1이 미토콘드리아 내 응집체 형성(적색 형광, 여기 525 nm/방출 590 nm), 낮으면 세포질로 이동해 녹색 형광 단량체 형성(여기 490 nm/방출 530 nm). SMMC-7721 및 Plc 세포를 공초점 접시에 1×10⁶ cells/mL로 파종해 12시간 배양 후, 자유 Ats 또는 Ats 탑재 BSA NP 분산액을 포함한 무혈청 배지로 교체하였다. 9시간 후 PBS로 2회 세척하고 2 μmol/L JC-1 2 mL를 가해 37 °C 암실에서 30분 배양하였다. 레이저 공초점 현미경(FluoView FV10i)으로 미토콘드리아 막 이미지 변화를 관찰하였다.

ROS 생성 측정 및 소포체(ER) 염색

세포를 20% FBS로 배양, 밀도 조절 후 96웰 플레이트에 웰당 100 μL(약 1×10⁴ 세포)로 분주해 24시간 배양하였다. 자유 Ats와 Ats 탑재 BSA NP를 세포와 6, 12, 24시간 배양 후 10 μM DCFH-DA(Sigma-Aldrich)로 30분 추가 배양하였다. 얼음 찬 PBS로 3회 세척해 미내재화 NP를 제거하고, 마이크로플레이트 리더(Synergy-2)로 DCF 형광 강도(여기 485 nm/방출 530 nm)를 측정해 산화 스트레스 정도를 조사하였다. 24시간 처리 후 ER-Tracker Blue-White DPX 프로브(Molecular Probes)를 가해 30분 배양, PBS 세척 후 공초점 현미경으로 ER 형태 변화를 관찰하였다.

유세포 분석으로 세포 온코시스 및 아폽토시스 평가

기존 연구 프로토콜 [28]에 따라 Annexin V-FITC/PI 염색법으로 자유 Ats와 Ats 탑재 BSA NP 유도 세포 온코시스와 아폽토시스를 평가하였다. 세포를 트립신 처리 후 6웰 플레이트에 1×10⁶ cells/mL로 파종해 24시간 배양, 자유 Ats와 Ats 탑재 BSA NP 함유 무혈청 배지로 처리하였다. 처리 후 Nicoletti 버퍼(PI 및 AV-FITC 포함)에 현탁해 공초점 현미경으로 세포 형태 변화를 관찰하고, 유세포 분석으로 초기 아폽토시스(Q4), 온코시스(Q2), 괴사(Q1), 생존 세포(Q3) 비율을 정량화하였다.

아폽토시스 관련 단백질 및 사이토크롬 C 웨스턴 블롯 분석

자유 Ats 또는 Ats 탑재 NP를 SMMC-7721 세포와 24시간 배양 후 웨스턴 블롯으로 상대 단백질 수준을 측정하였다. 세포를 프로테아제 억제제 칵테일과 인산화효소 억제제(Roche)를 함유한 얼음 찬 RIPA 버퍼로 용해시켰다. 단백질 농도는 변형 BSA 분석 키트(Thermo Fisher)로 측정 후 정규화하여 10% SDS-PAGE에 로딩하였다. 표적 단백질 수준을 UVP 겔 분석 시스템(iBox Scientia 600)으로 촬영 분석하였다.

결과

Ats 탑재 BSA NP 특성 및 세포 생존율 연구

그림 1a, b에서 Ats 탑재 BSA NP는 구형으로 균일 분산되며 PDI 0.016로 낮았다. 평균 입자 크기 약 99.9±2.3 nm, 제타 전위 약 -25.6±4.3 mV(음성). 방출 프로파일(그림 1c)은 부드럽고 지속적인 방출을 보였다. 자유 Ats가 배지에서 6시간 내 85% 이상 급속 방출되는 반면, BSA NP 핵심에 포집된 Ats는 BSA의 지속적 분해로 48시간 동안 78.9%만 누적 방출되었다. 이는 NP가 생체재료 분해를 통해 약물 방출을 장기간 부드럽게 제어해 제거 반감기 연장, 유효 혈중 농도 개선, 투여 빈도 감소 효과가 있음을 나타낸다.

그림 1. Ats 탑재 BSA NP 특성. (a) TEM 이미지, (b) DLS 분석, (c) 인산완충식염수(pH 7.4, 37 °C)에서 48시간 in vitro 방출 프로파일. SMMC-7721 세포(d)와 Plc 세포(e)의 생존율(자유 Ats 및 Ats 탑재 BSA NP 다양한 농도 24시간 처리). 데이터는 평균±SD (n=3). # P<0.05 vs 해당 자유 Ats.

MTT 분석으로 자유 Ats와 Ats 탑재 BSA NP의 SMMC-7721 및 Plc 세포 억제 효과를 시간별로 조사하였다(그림 1d, e). 자유 Ats 세포독성은 농도 의존적으로 증가했으며, Ats 탑재 BSA NP도 점진적으로 세포독성이 증가하였다. 두 제제 모두 종양 세포 성장을 억제하며 억제율은 Ats 용량 의존적이었다. 자유 Ats 대비 Ats 탑재 BSA NP가 두 세포주에서 더 높은 세포독성과 감도를 보였고 더 큰 세포 억제를 유도하였다. 24시간 처리 시 Ats 탑재 BSA NP 처리군에서 세포 생존율이 자유 Ats 대비 유의미하게 감소하였다. SMMC-7721 세포와 Plc 세포에서 Ats 탑재 BSA NP의 IC50 값은 각각 50.1, 44.9 μg/mL(24시간)로 자유 Ats(69.2, 74.9 μg/mL)보다 낮았다. 이는 Ats가 BSA NP에 탑재되면 NP 매개로 세포 내 위치가 변해 더 많은 세포를 사멸시킴을 시사한다.

BSA NP의 세포 내 섭취 관찰

공초점 현미경으로 두 종양 세포에서 BSA NP의 세포 내 분포와 위치를 관찰하였다(그림 2). 로다민 B 표지 NP를 세포와 3시간 공배양 후 세포질에서 적색 형광이 명확히 관찰되었으며, 시간이 지남에 따라 대부분 NP가 세포 내로 내부화되어 세포질로 확산되며 시의적 적색 형광이 강화되었다. 또한 세포질 내 BSA NP가 미토콘드리아와 공위치함이 황색 형광(로다민 B 적색 + Mitotracker Green FM 녹색 합성)으로 확인되었다. 이는 내부화된 BSA NP가 미토콘드리아 내 특이적으로 축적될 수 있음을 입증하며, Ats가 BSA NP 매개로 미토콘드리아에 전달될 가능성을 시사한다.

그림 2. 다양한 종양 세포와 배양 후 BSA NP의 세포 내 분포. SMMC-7721 세포(a), Plc 세포(b) 형광 이미지. 척도 막대 100 μm.

미토콘드리아 막 전위 분석

Ats 탑재 BSA NP가 미토콘드리아로 Ats를 전달한 후 미토콘드리아 기능에 간섭하는지 확인하기 위해 막 전위 변화를 측정하였다(그림 3). 자유 Ats 처리 세포에서는 JC-1 염색 시 대부분 미토콘드리아가 강한 적색 형광과 약한 녹색 형광을 보여 JC-1 응집체 우세, 막 전위 높음, 막 무결성 유지를 나타냈다. 반면 Ats 탑재 BSA NP 처리 세포에서는 두 세포주 모두 미토콘드리아가 더 강한 녹색 형광을 보여 막 전위 유의적 감소 및 막 손상 심각함을 입증하였다. 종합하면 Ats가 BSA NP 매개로 미토콘드리아에 성공적으로 전달되어 미토콘드리아 막 탈분극을 유도함을 확인하였다.

그림 3. 자유 Ats 및 Ats 탑재 BSA NP 배양 후 SMMC-7721 및 Plc 세포 미토콘드리아 막 전위 이미지 변화. 척도 막대 100 μm.

ROS 생성 측정 및 ER 염색

대량 ROS 생성은 미토콘드리아 내막 인지질 과산화 및 막 전위 감소, 사이토크롬 C 빠른 방출을 유발하는 것으로 널리 알려져 있다. DCFH-DA 형광 프로브로 ROS 변화를 측정하였다. DCFH-DA가 세포막 투과 후 에스테라아제 가수분해로 DCFH가 되어 세포 내 잔류, 세포 내 ROS가 비형광 DCFH를 녹색 형광 DCF로 산화시킴을 이용한다.

두 세포주를 자유 Ats와 Ats 탑재 BSA NP로 일정 시간 처리 시 세포 내 ROS 양도 시간 의존적으로 증가하였다. 자유 Ats 대비 Ats 탑재 BSA NP 처리군에서 SMMC-7721과 Plc 세포의 ROS 생성이 유의미하게 증가하였다. 그림 4a에서 48시간 처리 시 Ats 탑재 BSA NP군 ROS 수준이 자유 Ats군 대비 각각 1.53배, 1.28배 증가하였다. 이는 NP가 세포 내 ROS 생성을 가속화함을 지지한다. 대조군 및 자유 Ats 대비 Ats 탑재 BSA NP 처리 후 ER-Tracker Blue-White DPX 형광 강도가 유의미하게 증가해 ER 스트레스도 유발됨을 보였다. 이는 BSA NP 매개로 Ats가 미토콘드리아에 특이적으로 위치해 세포 내 산소 유리기 수준을 크게 증가시키고, ER 스트레스 유발 및 미토콘드리아 경로 활성화를 통해 카스파제 의존적 세포 아폽토시스를 유도함을 시사한다.

그림 4. 자유 Ats 및 Ats 탑재 BSA NP 처리 세포에서 시간별 ROS 생성 정량(a). ER-Tracker Blue-White DPX 프로브로 ER 염색(b). 척도 막대 100 μm. 데이터 평균±SD (n=3). + P<0.05 vs 대조군 12h, * P<0.05 vs 대조군 24h, # P<0.05 vs 대조군 24h.

세포 아폽토시스 및 괴사 평가

Annexin V-FITC/PI 염색법으로 세포를 처리하였다. 생존 세포는 Annexin V-FITC/PI에 결합하지 않아 무형광. 아폽토시스 세포는 PI 결합 안 함, Annexin V-FITC 결합으로 녹색 형광. 온코시스 세포는 세포막 손상 및 핵 파편화로 녹색+적색 형광 동시 발현. 그림 5a에서 대조군 대비 자유 Ats와 Ats 탑재 NP 24시간 처리 시 강한 녹색+적색 형광 관찰되어 두 제제 모두 종양 세포 온코시스와 아폽토시스 유도함을 확인. 특히 Ats 탑재 BSA NP 처리군에서 Annexin V-FITC와 PI 형광 강도가 유의미하게 증가해 온코시스와 아폽토시스 정도가 크게 향상됨.

그림 5. 자유 Ats 및 Ats 탑재 BSA NP 처리 세포 초미세 구조 형태 변화 Annexin V-FITC/PI 염색(a). 척도 막대 100 μm. 자유 Ats 및 Ats 탑재 BSA NP 각각 24시간 배양 후 유세포 분석으로 세포 아폽토시스 및 온코시스 분석(b).

그림 5b에 초기 아폽토시스(Q4), 온코시스(Q2), 괴사(Q1), 생존 세포(Q3) 비율 제시. 자유 Ats 처리 시 온코시스율은 SMMC-7721 24.4%, Plc 4.6%로 점진 증가, 아폽토시스율은 각각 4.9%, 7.1%로 유지되어 자유 Ats가 온코시스와 아폽토시스로 세포 사멸 유도함. 반면 Ats 탑재 BSA NP는 세포 아폽토시스율과 온코시스율을 유의미하게 향상시켰다. 아폽토시스율은 SMMC-7721 10.9%, Plc 11.5%로 유의적 증가, 온코시스율은 각각 29.0%, 21.6%로 증가. 이는 BSA NP 매개 미토콘드리아 Ats 전달이 온코시스와 아폽토시스 효과 강화로 종양 세포 사멸을 가속화함을 나타낸다. Ats 탑재 BSA NP가 아폽토시스 신호 전달 과정을 촉발하고 미토콘드리아 매개 세포 아폽토시스 연쇄 반응을 촉진함.

웨스턴 블롯 분석

자유 Ats와 Ats 탑재 NP 유도 세포 사멸의 아폽토시스 의존성 탐구를 위해 웨스턴 블롯으로 아폽토시스 단백질 발현 측정. Ats 탑재 NP 처리 SMMC-7721 세포에서 Bax 단백질 세포 내 발현 수준이 유의미하게 증가함(그림 6). 이는 BSA NP 도움으로 Ats가 미토콘드리아에 축적되어 미토콘드리아 기능 장애 유발함을 시사. 세포질 Bax 단량체 단백질이 미토콘드리아 외막으로 전이해 올리고머화, 단백질 채널 형성, 막 투과성 증가. 세포질 사이토크롬 C 발현도 특이적으로 유의미하게 증가, caspase-3과 caspase-9 발현도 상승 추세. 따라서 미토콘드리아 막 투과성 증가로 사이토크롬 C가 세포질로 빠르게 방출되어 세포 사멸 신호 단백질(카스파제) 활성화, 세포 아폽토시스 연쇄 반응 촉진. 반면 자유 Ats는 아폽토시스 관련 단백질과 사이토크롬 C 발현에 유의미한 차이 없어 미토콘드리아 매개 아폽토시스 유도 안 하고 주로 온코시스에 의존함. BSA NP가 약물 미토콘드리아 축적을 증진하고 미토콘드리아 매개 아폽토시스 효과 활성화해 유의미한 아폽토시스 유도 및 주요 아폽토시스 관련 단백질 발현 증가시킴을 웨스턴 블롯 분석이 확인함.

그림 6. SMMC-7721 세포에서 cleaved caspase-3, caspase-9, Bax, 사이토크롬 C 발현 수준 웨스턴 블롯 분석. * P<0.05 vs 대조군 Bax; # P<0.05 vs 대조군 cleaved caspase-3; + P<0.05 vs 대조군 caspase-9; x P<0.05 vs 대조군 사이토크롬 C. 데이터 평균±SD (n=3).

논의

온코시스와 아폽토시스는 세포 사멸의 두 가지 다른 방식이다. 아폽토시스는 다세포 생물에서 일어나는 능동적 프로그램 세포 사멸 과정. 온코시스는 카스파제 비의존적 세포 사멸로 부종, 투과성 증가, 막 파열 특징, 흔히 괴사로 불림. 우발적 비제어적 사멸로 여겨짐. 본 연구에서 Ats가 종양 세포 성장 억제, 억제율은 Ats 용량 의존적임 확인. Ats는 주로 온코시스 정도에 의존해 세포 사멸 유도, 카스파제 비의존적 온코시스 형태 활성화. 반면 Ats 탑재 BSA NP 처리 시 NP가 세포질로 내부화되어 미토콘드리아 내 빠르게 위치, NP 매개로 Ats 방출. 미토콘드리아 내 Ats가 ROS 생성, ER 스트레스 유발, 미토콘드리아 막 전위 감소, 사이토크롬 C 방출, Bax, cleaved caspase-3, caspase-9 단백질 발현 촉진으로 미토콘드리아 매개 카스파제 의존적 아폽토시스 경로 활성화. 종합하면 Ats 탑재 BSA NP가 Ats 미토콘드리아 전달 증가, 온코시스와 아폽토시스 정도 향상으로 세포 사멸 유도, 약물 세포독성 증가 및 유의미한 세포 사멸 유도.

결론

요약하면, 종양 세포 내 자유 Ats는 온코시스 정도에 강하게 의존해 온코시스 유사 사멸 형태로 종양 세포 증식 억제, 약물 세포독성이 제한적이고 바람직하지 않음. 반면 Ats 탑재 BSA NP는 미토콘드리아 아폽토시스 경로 활성화와 동시에 온코시스 효과 유발, 두 효과가 시너지적으로 Ats 항종양 효능 향상. 본 연구 결과는 Ats 탑재 BSA NP가 Ats의 세포독성 및 아폽토시스 효과 강화에 중요한 의의가 있으며, BSA NP가 Ats 유도 세포 사멸 경로 다변화에 기여함을 강조. 자유 Ats 대비 Ats 탑재 BSA NP가 종양 세포에서 더 큰 세포독성과 유의미한 아폽토시스 효과 유도.