이 연구의 목적은 산화그래핀(GO)이 피부 복구의 맥락에서 메탈로프로테이나제-1(TIMP-1) 단백질의 조직 억제제 방출을 위한 적절한 매개체로 작용할 수 있다는 가설을 입증하는 것이었습니다. GO 특성은 주사전자현미경, 원자력현미경, 열중량분석으로 관찰하였다. TIMP-1이 GO를 흡수한 후, GO로부터 다양한 농도의 TIMP-1의 방출 프로파일을 비교했습니다. 섬유아세포 생존력과의 GO 생체적합성은 세포 주기와 세포자멸사를 측정하여 평가되었습니다. 생체 내 상처 치유 분석을 사용하여 피부 재생에 대한 TIMP-1-GO의 효과를 결정했습니다. GO의 최대 강도는 1140nm였고, 최대 강도 볼륨은 10,674.1nm(나노미터)였습니다. TIMP-1은 GO로부터 최소 40일 동안 지속적으로 출시되는 것으로 나타났습니다. TIMP-1-GO로 배양된 랫트 섬유아세포의 증식 및 생존율은 GO 또는 TIMP-1 단독으로 성장한 세포와 비교하여 유의하게 다르지 않았습니다(p> 0.05). TIMP-1 및 TIMP-1-GO로 처리된 쥐의 피부 결함은 조직학적 및 면역조직화학적 점수에서 유의한 차이를 보였습니다(p <0.05). GO는 캐리어 물질을 방출하도록 제어할 수 있습니다. TIMP-1과 GO의 조합은 피부 결손에서 피부 조직 재생의 진행을 촉진했습니다.
<섹션 데이터-제목="배경">피부 병변은 사고, 당뇨병 합병증, 화상 또는 표재성 수술과 같은 많은 요인에 의해 발생할 수 있습니다[1]. 자가 피부 이식 또는 인공 피부 제조에 사용되는 생체 고분자는 상처 봉합에 사용되는 가장 일반적인 접근 방식입니다[2]. 이러한 대체물에는 특히 심하게 화상을 입은 환자[3], 감염[4], 통증 및 피부 피판 괴사[5], 느린 치유 및 재료의 생체 적합성[5]에서 사용 가능한 기증 연조직의 제한이 포함될 수 있습니다.
금속단백분해효소-1의 조직 억제제(TIMP-1)는 기질 금속단백분해효소(MMP)와 억제 복합체를 형성하여 세포외 기질(ECM)이 분해되는 것을 방지합니다[6, 7]. TIMP 단백질은 또한 상처 복구 및 재생과 관련된 사이토카인뿐만 아니라 성장 인자의 MMP 주도 회전율 및 처리를 제어합니다[8]. TIMP와 MMP는 정상적인 상처 치유 동안 조절되며, 이들의 불균형은 피부 복구 결함, 켈로이드 및 섬유증과 관련이 있습니다[9]. 상피 유래 TIMP-1은 직간접적으로 다양한 단계에서 상피화를 조절할 수 있습니다. 절단 상처 복구 및 피부 재생의 중요한 단계는 외상 표면에 상피가 재성장하는 재상피화입니다[10]. 재상피화는 상처 가장자리에 있는 세포가 세포-세포 및 세포-ECM 접촉을 느슨하게 하고 상처를 가로질러 이동하기 시작할 때 발생합니다. 이러한 과정은 TIMP-1 생물학과 연결되어 있습니다[11].
피부 회복을 위한 최적의 지역 TIMP-1 투여 시스템은 사용되는 전달 수단에 따라 다릅니다. 사이토카인을 방출하도록 설계된 일부 전달 수단이 개발되었습니다[12]. 담체에는 PLGA(폴리(락트산-코-글리콜산))[13], 키토산[14], PLGA 나노구[15] 및 하이드로겔이 포함됩니다. 전달 비히클의 사용은 피부 재생을 위한 TIMP-1 투여량을 줄이는 데 도움이 되고 약제의 국소 전달을 허용합니다. 그래핀은 평평한 단층과 벌집 모양의 2차원 구조를 가진 탄소 원자로 구성됩니다[16]. 그래핀 옥사이드(GO)는 효율적인 로딩(흡수), 생체 적합성, 낮은 독성으로 인해 문헌에서 소분자 약물 전달 매개체로 사용되었습니다[17,18,19]. GO의 필수 특성은 소수성 π입니다. 가장자리를 따라 이온화된 영역이 있는 구조의 코어에 있는 도메인. 독특한 π –π 스태킹 상호 작용으로 인해 GO는 높은 적재 용량을 위한 큰 비표면적과 함께 수용성과 함께 효율적입니다[20, 21].
본 연구에서 우리는 재조합 인간 TIMP-1 단백질이 피부 재생을 개선하기 위한 전달 매개체로서 GO와 짝을 이룰 수 있는지 조사했습니다. 피부 재생에 대한 효과를 조사하기 위해 TIMP-1을 GO 플레이크에 로드하고 이의 방출 및 독성을 시험관 내 쥐 섬유아세포를 통해 측정했습니다. 결과는 피부 상처 모델이 사용된 쥐에게 최종적으로 테스트되었습니다.
쥐 섬유아세포는 Institute of Biochemistry and Cell Biology, CAS(Shanghai, China)에서 구입하고 10%(v /v ) 소 태아 혈청(FBS, Gibco). 배지는 2일마다 변경되었습니다. 모든 세포는 37°C에서 보관되었습니다.
GO 플레이크는 Chengdu Organic Chemicals Co., Ltd. Chinese Academy of Science(Chengdu, China)에서 구입했으며 백금 코팅 후 주사 전자 현미경(SEM, JSM-6701F, JEOL, Tokyo, Japan)을 사용하여 특성화했습니다. 샘플은 15kV 가속 전압에서 주사형 전자 현미경(Hitachi S3000N)으로 스캔되었습니다. GO 플레이크의 크기 분포는 제타 전위 기반 분광 광도계(Zetasizer 3000 HSA, Malvern, UK)로 결정되었습니다. GO 플레이크의 형태는 도립 현미경(IX71 도립 현미경, Olympus, Tokyo, Japan)과 결합된 원자력 현미경(AFM, MultiMode, VEECO, USA)을 사용하여 결정되었습니다. TGA/DSC 열중량 분석기(Pyris 1 TGA, Perkin-Elmer, USA)를 사용하여 열 중량 분석 및 시차 주사 열량계를 수행했습니다. 샘플을 알루미나 팬에 놓고 10°C에서 25~1100°C의 가열 램프를 적용했습니다. 최소
GO 플레이크는 인간 재조합 TIMP-1(Huaan Co., Hangzhou, China) 흡착 전에 1,1-dioctadecyl-3,3,3,3-tetram-ethylindocarbocyanine perchlorate(DiI, red, Sigma)로 표지되었습니다. TIMP-1 흡착을 위해 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC, green, Thermo Scientific, Rockford, IL, USA)-컨쥬게이션된 TIMP-1(Huaan Co., Hangzhou, China) 및 DiI 표지된 GO를 인산완충식염수(PBS)에 첨가했습니다. ) 4°C에서 4시간 동안 배양했습니다. GO 대 재조합 TIMP-1의 비율은 중량 기준으로 1:1이었다. GO에 대한 TIMP-1 로딩을 확인하기 위해 TIMP-1(1μg)을 GO를 포함하는 PBS 20μl에 첨가하고 4°C에서 4시간 동안 인큐베이션했습니다. GO에 흡착된 TIMP-1은 레이저 주사 공초점 현미경(IX81-FV1000 도립현미경, Olympus)을 사용하여 가시화하였다. GO에 대한 TIMP-1 흡착을 확인하기 위해 2mg GO와 100mg을 혼합하여 제조된 펠릿(직경 10mm)에 Nicolet 5700 분광법(ThermoFisher Co., SGE, Australia)을 사용하여 푸리에 변환 적외선 분광법(FTIR)을 수행했습니다. KBr 및 압축하여 분석할 펠릿을 생성합니다. 스펙트럼은 소프트웨어 EZ OMNIC(Nicolet)에 의해 기준선 보정 후 분석되었습니다.
다양한 GO 농도(10, 20 및 30μg/ml)에서 TIMP-1의 방출 프로필은 상업용 인간 TIMP-1 특이적 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISAs, R&D Systems Inc., Minneapolis, MN, 미국). 4°C에서 4시간 동안 배양한 후 상층액의 ELISA는 거의 모든 TIMP-1이 GO에 흡착되었음을 보여주었습니다. TIMP-1이 장착된 GO는 1.5ml PBS를 포함하는 60mm 배양 접시에 현탁되었습니다. 그런 다음 접시를 37°C에서 인큐베이션했습니다. 다양한 시점에서 연속 교반 후 상층액을 수집하고 새로운 완충액을 배양 접시에 첨가했습니다. 상층액에서 인간 TIMP-1의 농도는 ELISA에 의해 결정되었습니다.
20μg/ml 농도의 TIMP-1이 로딩된 20μg/ml GO 플레이크를 래트 섬유아세포 배양물에 첨가하고 세포를 6, 24, 48 및 72시간 동안 배양했습니다. 세포 생존력은 제조업체의 지침에 설명된 대로 세포 계수-8(CCK8) 분석을 사용하여 평가되었습니다. 샘플의 흡광도는 450nm(n =각 그룹당 5개).
섬유아세포를 트립신 처리하여 수확하고 Hoechst 33258 및 Annexin-V-FITC/PI로 표지했습니다. 세포주기 활성 및 세포 사멸은 유동 세포 계측법 분석 키트 (Lianke, Hangzhou, China)에 의해 후속적으로 결정되었습니다. 차단 시약(Lianke, Hangzhou, China)이 있는 상태에서 4°C에서 30분 동안 라벨링을 수행한 후 PBS를 사용하여 2단계 세척을 수행했습니다. 세탁 및 고정 후 최소 10 4 세포를 획득하고 분석했습니다. Becton Dickinson FACSCanto II를 사용하여 유세포 분석을 수행했습니다.
모든 실험 절차는 미국 NIH의 지침에 따라 수행되었습니다. 실험 절차를 위한 동물은 Zhejiang University Ethics Committee의 승인을 받았습니다. 4주 된 수컷 Sprague-Dawley 쥐에게 이전에 설명한 대로 피부 결손 수술(SDS)을 시행했습니다(그림 4a)[22]. 피부 결손의 크기는 10mm × 10mm였습니다. 수술 후, 동물은 개별 케이지로 되돌려졌습니다. SDS 14일 후, 동물을 무작위로 4개의 그룹으로 나누고 치료를 시작했습니다. 대조 제제(4ml PBS만 해당), GO 제제(PBS가 포함된 4ml GO, 1:20), TIMP-1 제제(4ml TIMP-1 및 PBS 1:20) 또는 TIMP-1-GO 제제의 국소 주사 (TIMP-1이 포함된 4ml GO, 1:1 v /와 ) 피하 투여하였다. 피부 결손 부위(총 4점, 각 1ml)를 중심으로 매주 2주 동안 총 2회에 걸쳐 주사하였다. 쥐는 수술 4주 후에 희생되었습니다(그림 4a). 재생된 피부를 절개하여 파라핀에 포매한 후 hematoxylin-eosin 염색과 Masson 염색으로 조사하였다.
재생된 피부는 72시간 동안 4% 포르말린에 고정되었습니다. 그런 다음 샘플을 실온에서 2주 동안 9% 포름산에서 석회질을 제거했습니다. 피부 샘플은 등급이 지정된 에탄올로 탈수되었습니다. 연속 섹션은 hematoxylin-eosin(HE) 및 Masson으로 염색되었습니다. 피부 결손 부위의 CD34 발현을 면역조직화학염색으로 분석하였다. 섹션은 크실렌에서 탈랍되고 등급이 지정된 알코올을 통해 수화되었습니다. 1% 염소 혈청(1:100 희석, Sigma)으로 차단한 후 섹션을 4°C에서 밤새 CD34(Abcam, Cambridge, UK)에 대한 1차 항체와 함께 인큐베이션했습니다. PBS로 3회 세척한 후 절편을 37°C에서 1시간 동안 이차 항체와 함께 인큐베이션했습니다. 염색은 3,3'-디아미노벤지딘(DAB) 용액으로 전개되었습니다(Dako, Hamburg, Germany). 세 명의 훈련된 관찰자가 재생된 피부를 관찰했습니다. 면역조직화학적 섹션은 DBA 비율을 사용하여 준비되었습니다.
모든 실험은 3회 반복되었으며 데이터는 평균 ± 표준편차로 표시되었습니다. 일원 분산 분석 및 Student-Newman-Keuls 사후 검정은 유의 수준을 결정했습니다. 피 0.05 및 0.01보다 작은 값은 각각 유의미한 값과 매우 유의한 것으로 간주되었습니다. 통계 분석은 SPSS 17.0(SPSS Inc., Chicago, USA)으로 수행되었습니다.
<섹션 데이터-제목="결과">GO 이미지의 2D 표현은 AFM에 표시됩니다(그림 1a). SEM은 GO 플레이크가 불규칙한 모양의 시트임을 보여주었습니다(그림 1b). GO 플레이크의 크기 분포는 전위 기반 분광 광도계로 측정하였다. 크기 분포의 최대 강도는 1140nm였으며, GO의 최대 강도 부피는 10,674.1nm였습니다(그림 2a).
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GO 흡수. 아 AFM에서 보여준 GO 이미지의 2D 표현. ㄴ SEM은 GO 플레이크가 불규칙한 모양의 시트임을 보여줍니다. GO 플레이크는 불규칙한 모양의 시트였습니다. ㄷ GO 플레이크의 크기 분포. 최대 강도는 1140nm이고 최대 강도 볼륨은 10,674.1nm입니다.
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GO 및 TIMP-1-GO 특성화. 아 TIMP-1은 GO에 흡수되었습니다. 분석 결과 75±1.2%의 GO가 TIMP-1에 흡수된 것으로 나타났습니다. ㄴ TIMP-1의 누적 방출 프로파일이 기록되었습니다. GO에 내장된 TIMP-1은 약 40일의 장기간 TIMP-1 출시에 적합한 시스템을 나타냅니다. ㄷ GO와 TIMP-1-GO 사이의 화학 조성은 FTIR 분광기를 사용하여 조사되었습니다. GO의 파형 및 파형 피크는 TIMP-1-GO의 파형과 크게 다릅니다. d 열중량 분석 곡선은 50~800°C에서 GO와 TIMP-1-GO 사이에 큰 차이가 없음을 보여줍니다. 열중량 분석 곡선은 대조군 GO와 TIMP-1-GO 사이에 눈에 띄는 차이가 없음을 보여주었습니다.
다음은 PBS에서 4시간 동안 FITC 결합 TIMP-1(녹색) 및 DiI 표지된 GO(빨간색)를 배양한 것입니다. TIMP-1은 GO에 흡착되었습니다. 분석 결과 75±1.2%의 GO가 4시간 후 TIMP-1에 흡수되었으며, 이는 GO가 TIMP-1 단백질에 효율적으로 결합함을 시사합니다(그림 1c). 우리는 FTIR 분광법을 사용하여 TIMP-1-GO의 화학적 조성을 조사했습니다(그림 2b). GO의 파형 및 파형 피크는 TIMP-1-GO의 파형과 크게 다릅니다. 우리는 대조군 GO와 TIMP-1-GO 사이의 열 중량 분석을 추가로 조사했습니다(그림 2d). 열중량 분석 곡선은 대조군 GO와 TIMP-1-GO 사이에 눈에 띄는 차이를 보이지 않았습니다.
다양한 농도의 TIMP-1(그룹 1 3μg/ml, 그룹 2 2μg/ml 및 그룹 3 10μg/ml)을 GO에 로드했습니다. TIMP-1의 누적 방출 프로필은 그림 2c에 나와 있습니다. 2μg/ml TIMP-1-GO 방출은 10 및 30μg/ml TIMP-1 용량에 비해 더 빠르게 50% 누적 방출에 도달했습니다. TIMP-1은 약 40일 동안 지속적으로 출시되었습니다. 이것은 GO에 내장된 TIMP-1의 적용이 장기간의 TIMP-1 방출에 적합한 시스템을 나타낼 수 있음을 시사합니다(그림 2c).
대조군인 GO 및 TIMP-1에서 배양된 랫트 섬유아세포의 증식 및 생존율은 TIMP-1-GO의 다른 샘플에서 성장한 세포의 증식 및 생존율과 눈에 띄게 다르지 않았습니다(p> 0.05). 대조군, GO 및 TIMP-1에서 배양된 섬유아세포의 세포 주기 및 세포자멸사는 TIMP-1-GO 샘플에서 성장한 세포의 세포 주기와 눈에 띄게 다르지 않았습니다(p> 0.05) (그림 3a–c).
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TIMP-1-GO가 쥐의 섬유아세포 증식과 생존력에 미치는 영향. 아 다른 그룹에서 배양된 섬유아세포의 생존력은 다른 시점에서 유의한 차이를 나타내지 않습니다(p> 0.05). ㄴ 섬유아세포의 세포주기는 다른 그룹에서 성장한 세포의 세포주기와 크게 다르지 않았습니다(p> 0.05). ㄷ 섬유아세포의 세포 사멸은 다른 그룹에서 성장한 세포의 세포 사멸과 크게 다르지 않았습니다(p> 0.05)
TIMP-1-GO는 실험 상처의 치유를 촉진할 수 있는지 여부를 확인하기 위해 쥐에게 피하 투여되었습니다. 수술 4주 후, 대조군과 비교하여 TIMP-1-GO로 치료한 피부 결손은 종말점에서 유의한 차이를 보였다(p <0.05), TIMP-1로 치료한 피부 결손은 대조군과 GO군에서 종말점에서 유의한 차이를 보였다(p <0.05). 또한, TIMP-1-GO 그룹은 모낭 재생에서 향상된 치료 효과를 나타냈습니다(p <0.05). TIMP-1로 치료한 피부결함은 대조군과 GO군에 종말점에서 유의한 차이를 보였다(p <0.05) (그림 4b).
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생체 내 실험. 아 계획과 SDS 및 모델. ㄴ 생체 내(1cm) 조직학적 및 면역조직화학적 분석. 연속 콜라겐 섬유는 TIMP-1-GO 그룹에서 볼 수 있습니다. ㄷ 정량적 평가는 TIMP-1 및 TIMP-1-GO와 비교하여 대조군과 GO 사이에 상당한 차이가 있음을 보여주었습니다(p <0.05). 다른 그룹의 모낭은 유의하게 달랐습니다(p <0.05). TIMP-1로 치료한 피부 결손은 반정량적으로 대조군과 GO군에 유의한 차이를 보였다(p <0.05)
PBS 처리 후 피부 재생의 조직학적 특징은 그림 4b에 나와 있습니다. 피부 결손 후 대조군의 특징은 처리 4주 후 표본에서 볼 수 있는 끊어진 콜라겐 섬유를 보여줍니다. 대조적으로, 연속적인 콜라겐 섬유는 TIMP-1-GO 그룹에서 동일한 시점에서 가시적으로 대조군과 비교하여 통계적 차이를 나타낸다. TIMP-1-GO 처리 후 혈관 형성의 면역 조직 화학적 특징은 그림 3c에 나와 있습니다. CD34+ 피하 세포는 TIMP-1-GO 처리 그룹에서 4주 후 표본에서 볼 수 있습니다. 정량적 평가는 대조군과 TIMP-1-GO 처리군 사이에 유의한 차이를 나타냈다(p <0.05) (그림 4c).
현재 연구에서 우리는 재조합 TIMP-1 단백질을 GO에서 제어된 방출과 결합하여 절제 상처 복구를 향상시키기 위한 잠재적인 새로운 접근 방식을 분석했습니다. GO는 시험관 내에서 우수한 생체 적합성을 보여주었습니다. 그리고 TIMP-1은 최대 40일 동안 GO 차량에서 지속적으로 방출되는 것으로 나타났습니다. TIMP-1과 GO의 조합은 실험적인 피부 결함 모델에서 혈관 생성 및 콜라겐 재생을 촉진하는 것으로 나타났습니다.
다양한 생의학 재료가 조직 재생에서 약제 전달을 위한 치료 수단으로 평가되었습니다. 콜라겐, 실크, 티타늄, 인산칼슘 시멘트, 폴리락트산-폴리글리콜산과 같은 매개체는 일부 치료 환경에서 바람직하지 않을 수 있는 생물학적 제제의 빠른 방출을 생성하는 경향이 있습니다[23]. 따라서 생물학적 분자의 느린 연속 방출을 제공하는 생물 의학 벡터의 능력은 중요한 특징으로 볼 수 있습니다. 이 품질에 대한 요구 사항은 전하의 도움으로 약물을 로드하는 데 사용되는 유연성입니다[24]. 그래핀 옥사이드(GO)는 시험관 내 및 생체 내에서 다양한 생물학적 제제의 느린 방출에 대한 유용성을 보여주는 "오프 스타트" 효과를 제공합니다[25,26,27]. 여기에서 우리는 GO가 재조합 인간 TIMP-1 단백질의 지속 방출을 발휘하는 데 사용될 수 있음을 보여주었습니다. 소수성 π 사이의 상호작용 GO의 도메인과 정전기적 상호작용은 GO의 음으로 하전된 도메인을 활성화할 수 있고 내부 소수성 영역을 통해 GO에 대한 효율적인 TIMP-1 단백질 흡수를 허용합니다. GO의 TIMP-1 장기 방출은 피부 상처 복구에 필요한 혈관 재생에 이상적으로 적합합니다.
50mg/ml 이상의 농도를 가진 탄소 입자가 조직에 침착될 수 있다고 제안됩니다[28]. Wang et al. 이것은 직경이 매우 작지만 GO의 기능적 표면적이 넓기 때문에 염증 반응을 일으킬 수 있다고 제안했습니다[29]. 이전 연구와 달리 GO 증착은 우리 연구에서 감지되지 않았습니다. 여기에서 볼 수 있는 명백한 부작용이 없다는 점을 감안할 때 GO 나노입자의 잠재적인 부정적인 것은 지지될 수 없습니다. 생물학적 반응 및 안전성 테스트를 포함하여 그래핀에 대한 추가 연구가 제안되었습니다[30].
그래핀 옥사이드의 상호작용이 세포에 미치는 영향에 대한 연구는 중요한 문제입니다. 그래핀은 많은 생물학적 응용 분야에서 그 용도를 시사하는 특성을 가진 새로 개발된 생의학 재료입니다. 그러나 2차원 탄소 구조/그래핀 독성학의 잠재적 생물학과 일반적인 생물학적 상호 작용은 완전히 이해되지 않았으므로 광범위한 추가 연구가 필요할 것입니다.
그래핀 옥사이드(GO)는 재조합 TIMP-1의 느린 전달을 위한 매개체로 사용될 때 지속적인 생체 적합성을 나타냅니다. TIMP-1은 최대 40일 동안 GO에서 지속적으로 방출되는 것으로 나타났으며, TIMP-1과 GO의 조합은 피부 재생 모델에서 혈관 재생 및 콜라겐 재생을 촉진하는 것으로 나타났습니다.
나노물질
초록 더 나은 항종양 효능을 얻기 위해서는 암세포를 표적으로 하는 항암제 전달 효율을 높이는 것이 시급하다. 이 연구에서, 키토산 기능화된 산화 그래핀(ChrGO) 나노시트는 마이크로파 보조 환원을 통해 제작되었으며, 이는 유방암 세포의 항암제용 세포내 전달 나노시스템에 사용되었습니다. 약물 로딩 및 방출 연구는 아드리아마이신이 ChrGO 나노시트에 효율적으로 로딩되고 방출될 수 있음을 나타냅니다. 전달 중 약물 방출이 적고 ChrGO/adriamycin의 생체 적합성이 향상되어 HER2 과발현 BT-474 세포에서 안전성과 치료
초록 최근에, 암 약물을 위한 나노캐리어 시스템, 특히 GO 기반 약물 전달 시스템은 암 환자에게 혜택이 되고 있습니다. 이 연구에서 우리는 생체 적합성을 향상시키기 위해 GO 표면을 기능화하기 위해 타우를 선택합니다. 첫째, 변형된 Hummer의 방법과 초음파 스트리핑 방법으로 나노크기의 GO를 합성하였다. 타우린으로 변형된 산화 그래핀 담체(Tau-GO)는 제타 전위가 − .8 mV이고 입자 크기가 242 nm인 물에 대한 분산성과 안정성이 좋은 Tau-GO를 얻기 위해 화학적 방법으로 합성되었습니다. 캡슐화 효율 평가 기준에
