제어된 약물 방출을 위한 온도 및 pH 변화에 반응하는 이중 자극 트리거 나노겔

결과 및 토론

PNIPAM-co-AAc 나노겔의 제조

AAc의 3가지 함량(5, 10 및 20%)을 갖는 PNIPAM-co-AAc 나노겔은 라디칼 중합 방법으로 제조되었습니다. TEM 및 SEM을 사용하여 나노겔의 입자 크기, 형태 및 단분산성을 확인했습니다. 그림 1a 및 b에서 볼 수 있듯이 PNIPAM-co-AAc5 나노겔은 평균 입자 직경이 약 250nm로 비교적 균일한 크기 분포를 나타냅니다. 또한, PNIPAM 기반 나노겔의 졸-겔 전이는 온도가 증가함에 따라 관찰되었다. PNIPAM-co-AAc5의 수용액은 실온에서 졸상으로 유지되었지만 나노겔은 가열 시 겔상으로 전환되어 용액이 LCST 이상에서 탁해졌습니다(그림 1c). PNIPAM, PNIPAM-co-AAc5, PNIPAM-co-AAc10 및 PNIPAM-co-AAc20의 제타 전위는 − 13.56mV, − 16.61mV, − 21.87mV의 표면 증가 및 6 의 양으로 인해 − 13.56mV로 감소했습니다. AAc 함량에 의해 제공되는 카르복실기(그림 1d). 또한 PNIPAM-co-AAc의 유체역학적 직경은 물과의 수소 결합 증가 및 전자간 반발로 인해 AAc의 함량이 30°C로 증가함에 따라 217–442 nm 범위를 나타냄을 나타냅니다. 그러나 나노겔 직경은 소수성 상호작용으로 인해 50°C에서 감소했습니다(그림 1e). 이러한 결과는 PNIPAM-co-AAc가 PNIPAM에 연결된 AAc의 양과 온도에 따라 크기가 달라질 수 있음을 시사했습니다. 나노겔의 조성은 그림 2와 같이 FT-IR 분광법으로 더 특성화되었습니다. 1100cm ^-1 ~1200cm ⁻¹ 피크는 C-N 굽힘을 나타냅니다. 스펙트럼은 또한 -CH₂를 표시했습니다. 1300cm ⁻¹ 에서 최대 신축 진동 ~1400cm ⁻¹ . 1600cm의 추가 피크 ⁻¹ ~1700cm ⁻¹ NIPAM에 속한 C=O에 귀속되었습니다. 구체적으로, 1700cm ^-1 에서 카르복실산(-COOH) 신축이 나타났습니다. ~1800cm ⁻¹ PNIPAM 나노겔을 제외하고. 3200cm의 넓은 피크 ⁻¹ ~3300cm ⁻¹ N-H 스트레칭의 흡수를 보였다. 따라서 PNIPAM과 AAc의 다양한 혼합 비율로 구성된 PNIPAM 나노겔 유도체는 AAc 함량이 다르기 때문에 특성이 다릅니다.

아 TEM 및 b PNIPAM-co-AAc5 나노겔의 SEM 이미지. ㄷ PNIPAM-co-AAc5 나노겔의 물리적 외관. 눈금 막대는 500nm입니다. d 제타 전위 및 pH 7.4에서 0%, 5%, 10% 및 20% AAc 함량이 있는 PNIPAM용 DLS로 30°C 및 50°C에서 측정한 평균 직경

0%, 5%, 10% 및 20% AAc 함량이 있는 PNIPAM의 FT-IR 스펙트럼

온도 반응 특성

온도 거동을 조사하기 위해 PNIPAM-co-AAc 나노겔의 크기 분포를 DLS로 평가했습니다. LCST를 결정하기 위해 30~50°C의 온도 범위에서 유체역학적 직경의 변화를 측정했습니다. AAc 함량이 5%, 10% 및 20%인 PNIPAM에는 두 가지 뚜렷한 전환 단계가 있습니다(그림 3). PNIPAM-co-AAc 파생 상품은 30°C에서 첫 번째 전환 단계를 시작한 다음 약 40°C에서 두 번째 전환 단계에 들어갔습니다. 또한, 두 번째 전이 온도는 PNIPAM의 AAc 함량이 증가함에 따라 증가하는 경향이 있었습니다. 따라서 PNIPAM-co-AAc20의 LCST는 45°C의 비교적 높은 온도인 반면 PNIPAM의 LCST는 32°C였습니다. LCST 값의 이러한 차이는 PNIPAM-co-AAc 유도체의 음전하 증가에 의해 유도될 수 있습니다. 그러나 PNIPAM-co-AAc5 및 PNIPAM-co-AAc10의 LCST 온도는 각각 37°C와 39°C에서 거의 동일했습니다. 따라서, PNIPAM-co-AAc10은 약물 방출 성능을 평가하는 데 더 이상 사용되지 않았습니다. PNIPAM-co-AAc 파생 상품에서 얻은 LCST 값은 이전 연구와 유사했습니다[37]. 이러한 결과는 PNIPAM-co-AAc 나노겔이 2개의 상전이를 갖고 AAc를 함유하는 PNIPAM의 LCST가 계면 PNIPAM 사슬의 소수성 상호작용과 AAc의 카르복실기를 통한 전자간 반발로 인해 더 높은 온도로 이동함을 입증했습니다.

a의 유체역학적 직경의 온도 의존성 PNIPAM, b PNIPAM-co-AAc5, c PNIPAM-co-AAc10 및 d pH 7.4에서 PNIPAM-co-AAc20 나노겔

이중 제어 약물 방출 성능

PNIPAM, PNIPAM-co-AAc5 및 PNIPAM-co-AAc20의 약물 방출 프로필을 비교하기 위해 PNIPAM-co-AAc 유도체에서 방출된 β-LP를 실온(24°C)에서 6시간 동안 측정했습니다. 체온(37°C). 처음에 PNIPAM-co-AAc20 및 β-LP를 포함한 PNIPAM-co-AAc20의 UV-Vis 흡수 스펙트럼을 측정했으며 β-LP에 해당하는 257nm에서 강한 흡수를 관찰했습니다(추가 파일 1:그림 S1). PNIPAM-co-AAc20-로딩된 β-LP의 약물 로딩 용량은 β-LP의 표준 농도-흡광도 보정 곡선을 사용하여 약 60%인 것으로 밝혀졌습니다(추가 파일 2:그림 S2)[38, 39]. 도 4에 나타난 바와 같이, PNIPAM-co-AAc 유도체로부터 방출되는 약물의 누적 백분율은 PNIPAM-co-AAc20에서 방출되는 β-LP의 양이 PNIPAM 및 PNIPAM에 비해 상대적으로 낮고 방출 효능이 현저히 감소되었음을 보여주었다. -co-AAc5는 두 온도 모두에서. 그러나 대부분의 PNIPAM-co-AAc 유도체의 포화 약물 방출 지점은 처리 후 2시간 이내에 관찰되었습니다. 특히, PNIPAM 나노겔의 약물 방출 효율은 반응 온도의 영향을 크게 받았다. PNIPAM-co-AAc 유도체는 실온에서보다 체온에서 개선된 약물 방출 효율을 나타냈다. 이 결과는 또한 반응 온도가 40°C 이상일 때 모든 PNIPAM 유도체의 상당히 더 높은 누적 약물 방출에 의해 뒷받침되었습니다(추가 파일 3:그림 S3).

a의 온도에서 PNIPAM, PNIPAM-co-AAc5 및 PNIPAM-co-AAc20 나노겔에서 β-LP의 누적 방출 실온(24°C) 및 b 체온(37 °C) 및 pH 7.4

그림 4 및 표 1에서 볼 수 있듯이 고온에서 PNIPAM-co-AAc 나노겔은 수축이 현저하기 때문에 약물을 쉽게 방출할 수 있습니다. 또한, 체온에서 가장 높은 약물 방출 효율은 PNIPAM에서 관찰되었으며 두 번째로 높은 효율은 PNIPAM-co-AAc5였습니다. 둘 다 상대적으로 낮은 AAc 함량을 가지므로 LCST 온도가 감소합니다. 특히, PNIPAM-co-AAc20의 β-LP는 체온에서 상대적으로 낮은 효율(61%)로 방출된 반면, 다른 나노겔에서는 동일한 온도에서 약 80%의 β-LP가 방출되었음을 관찰했습니다. 이러한 결과는 PNIPAM-co-AAc20이 PNIPAM 및 기타 PNIPAM-co-AAc5와 비교하여 가능한 한 많이 캡슐화하면서 체온에서 약물의 최소 방출을 나타냄을 나타냅니다. 또한, 이러한 결과는 LCST 값을 결정하기 위한 PNIPAM 파생물의 크기 측정에서 온도 의존적 ​​변화와도 일치했습니다.

다음으로, 우리는 PNIPAM-co-AAc20이 체온에서 약물의 최대 포획과 함께 PNIPAM이 반응하는 또 다른 인자인 pH를 통해 약물 방출을 제어할 수 있는지 여부를 평가했습니다. PNIPAM-co-AAc20은 약 70%의 누적 최대 방출 효율을 보여 산성 또는 중성 pH와 비교하여 pH 8에서 약 10% 증가했습니다. 한편, pH 7.4와 산성 pH에서는 유의한 차이가 관찰되지 않았다(Fig. 5 및 Table 2). 종합하면, 이러한 발견은 PNIPAM-co-AAc20의 약물 방출 프로파일이 AAc의 함량을 조절함으로써 영향을 받을 수 있고, 이 이중 조절 약물 방출 나노겔이 다음과 같이 알려진 기본 pH 값에서 약물 방출 속도를 효과적으로 조절할 수 있음을 나타냅니다. 소장의 일부에 존재[40].

다양한 pH 값에서 PNIPAM-co-AAc20 나노겔에서 β-LP의 누적 방출

약물 방출 특성 평가

시험관내 항증식성은 제어된 약물 전달 및 방출을 위해 설계된 나노물질의 핵심 기준을 수행하는 것으로 평가되었습니다. 도 6에 나타난 바와 같이, 유리 β-LP는 동등한 농도의 β-LP에 대해 β-LP가 로딩된 PNIPAM-co-AAc 나노겔보다 더 낮은 세포 생존력을 나타냈다. 더욱이, PNIPAM-co-AAc20 나노겔은 20μg/mL 농도에서 상대적으로 높은 세포 생존율을 나타냈는데, 이는 PNIPAM-co-AAc20 나노겔의 β-LP 방출이 37°C 또한, 이 결과는 누적 약물 방출 프로파일과도 일치했습니다. 그런 다음 형광 염색된 살아있는 세포와 죽은 세포를 사용하여 세포 생존력을 평가했습니다(그림 7). 살아있는/죽은 세포 염색 분석은 β-LP 및 β-LP를 포함하는 PNIPAM-co-AAc5 나노겔이 세포 생존율에서 유사한 반면, PNIPAM-co-AAc20은 20μg/mL의 용량에서 세포 생존율이 유의하게 증가함을 보여주었습니다. 3시간 동안 치료 후 그러나 PNIPAM-co-AAc20의 강화된 약물 방출은 pH 8.0에서 3시간 동안 인큐베이션한 후 관찰되기 시작했으며 처리 후 6시간 동안 동일한 pH에서 유의미하고 상승적인 항종양 활성이 나타났습니다. 이러한 발견은 온도 및 pH 이중 반응성 PNIPAM-co-AAc20 나노겔이 소장 말단에서 제어된 약물 로딩 및 방출에 대한 잠재적인 응용 프로그램이 있음을 의미합니다.

NIH3T3 섬유아세포에서 37°C에서 3시간 동안 다양한 농도의 β-LP가 로딩된 PNIPAM-co-AAc 나노겔의 항증식 활성

a가 있는 NIH3T3 세포의 세포독성 형광 이미지 미처리, b β-LP, c만 β-LP/PNIPAM-co-AAc5 및 d pH 7.4에서 3시간 동안 β-LP/PNIPAM-co-AAc20 처리 및 3시간 동안 β-LP/PNIPAM-co-AAc20 처리(e ) 및 6시간(f) ) pH 8.0에서. 살아있는 세포와 죽은 세포를 칼세인 AM(녹색)과 에티디움 동종이량체(빨간색)로 염색합니다. 눈금 막대는 100μm