온도 및 pH 반응성 PNIPAM 기반 나노젤의 β-라파촌 이중 자극 제어 전달

요약

폴리-N-이소프로필아크릴아마이드(PNIPAM) 나노젤을 아크릴산(AAc)과 공중합하여 하부 임계 용해 온도(LCST)를 조절했습니다. 그 결과 PNIPAM-co-AAc 나노젤은 두 가지 뚜렷한 부피 상전이 거동을 보이며, AAc 함량이 증가함에 따라 LCST가 상승합니다. β-라파촌(β-LP)을 탑재했을 때 약물 방출은 온도와 pH 양쪽 모두에 의해 제어되며, AAc 비율에 크게 영향을 받습니다. 특히 PNIPAM-co-AAc20 제형은 산성-중성 pH와 체온에서 약물 방출을 10% 미만으로 억제하면서, 염기성 pH에서 70% 이상 방출합니다. 이러한 결과는 온도 및 pH 반응성 PNIPAM 나노젤이 경구 투여를 통한 장 표적 약물 전달에 유망한 캐리어임을 입증합니다.

서론

자극 반응성 나노캐리어는 약물 전달, 영상, 진단 분야에서 점점 더 널리 활용되고 있습니다. 사용되는 자극(pH, 온도, 산화환원, 자기장, 빛) 중 온도와 pH가 제어 방출에 가장 널리 이용됩니다. PNIPAM은 열반응성 고분자로, 소수성 상호작용으로 인해 LCST(~32°C) 이상에서 붕괴됩니다. 반면 AAc의 탈양성자화 카복실기는 추가적인 정전기적 반발력을 도입하여 LCST를 상승시킵니다. 따라서 PNIPAM과 AAc의 공중합은 온도와 pH 양쪽에 반응하는 조절 가능한 플랫폼을 제공합니다. 천연 항암제인 β-라파촌은 빠른 대사와 표적 외 독성으로 치료 창이 제한적입니다. 반응성 나노젤에 캡슐화하면 이러한 단점을 완화할 수 있습니다. 본 연구에서는 다양한 AAc 함량의 PNIPAM-co-AAc 나노젤을 합성하고, 이들의 이중 자극 약물 방출 거동과 섬유아세포에서의 세포독성 효능을 보고합니다.

실험 방법

재료

NIPAM(97%, Sigma-Aldrich), N,N'-메틸렌비스아크릴아마이드(MBA), AAc, 증류수, EtOH, 과황산칼륨(KPS, 98%, Dae Jung), β-LP(천연물), PBS를 분석등급으로 구입하여 그대로 사용했습니다.

PNIPAM-co-AAc 나노젤 합성

500 mL 플라스크에 2.26 g NIPAM, 0.154 g MBA, 0-0.145 g AAc를 200 mL 물에 녹이고 75°C에서 질소 퍼징 후 37.5 mg KPS를 첨가, 10분간 환류하여 혼탁한 용액을 얻었습니다. 고분자를 투석(12-14 kDa, 7일), 액체질소 동결, 동결건조(3일)하여 건조 나노젤(PNIPAM, PNIPAM-co-AAc5, PNIPAM-co-AAc10, PNIPAM-co-AAc20)을 얻었습니다.

β-LP 탑재

건조 나노젤 1 mg을 1 mL EtOH에 녹이고 0.1 mg β-LP를 첨가했습니다. 혼합물을 암소에서 하룻밤 교반한 후 투석(6-8 kDa), 동결, 동결건조했습니다. β-LP 탑재 나노젤을 4°C에서 보관했습니다.

특성 분석

형태는 TEM(200 kV)과 FE-SEM(15 kV)으로 관찰했습니다. FT-IR 스펙트럼은 Nicolet 6700 분광계로 기록했습니다. 약물 탑재량과 방출량은 UV-Vis 분광법(200-800 nm)으로 정량했습니다. LCST는 동적 광산란(DLS)으로 30-50°C 범위에서 1°C 간격으로 측정했습니다.

약물 방출 실험

β-LP 탑재 나노젤 10 mL를 3.5 kDa 투석 튜브에 넣고 pH 2, 4, 7.4, 8.0의 PBS에서 24°C와 37°C로 배양했습니다. 정해진 시점(0-12시간)에 2 mL씩 채취하여 UV-Vis로 분석했습니다. 누적 방출량은 총 탑재된 β-LP 대비 비율로 계산했습니다.

세포 생존율 분석

NIH3T3 섬유아세포(2×10⁴ cells/well)를 무료 β-LP, PNIPAM-co-AAc5-β-LP, PNIPAM-co-AAc20-β-LP로 0-20 µg/mL 농도에서 처리했습니다. 3시간 후 MTT 분석(595 nm)과 LIVE/DEAD® 염색으로 세포독성을 평가했습니다.

결과 및 고찰

제조 및 형태

TEM과 SEM 이미지(Fig. 1)에서 PNIPAM-co-AAc5 나노젤의 평균 직경이 약 250 nm로 단분산됨을 확인했습니다. 제타 전위는 PNIPAM의 -13.6 mV에서 PNIPAM-co-AAc20의 -23.6 mV로 감소하여 표면 카복실기 증가를 반영했습니다.

온도 반응 거동

DLS 측정(Fig. 2) 결과 두 가지 뚜렷한 팽창-붕괴 전이가 나타났습니다. 첫 번째 전이는 ~30°C에서 시작되고, 두 번째는 ~40°C 근처에서 나타나 PNIPAM-co-AAc20에서는 45°C로 이동합니다. 따라서 LCST는 AAc 함량에 따라 상승하며, 이는 선행 연구와 일치합니다.

이중 자극 약물 방출

37°C에서 PNIPAM-co-AAc20은 6시간 내 β-LP의 약 61%만 방출한 반면, PNIPAM과 PNIPAM-co-AAc5는 약 80%를 방출했습니다. pH 8.0에서 PNIPAM-co-AAc20의 방출량은 중성 또는 산성 pH 대비 약 10% 증가했습니다(Fig. 3). 이는 약물 방출이 염기성 pH와 고온에서 상승적으로 촉진됨을 확인시켜줍니다.

체외 세포독성

무료 β-LP가 나노젤 제형보다 세포 생존율을 더 낮추었습니다. PNIPAM-co-AAc20은 20 µg/mL에서 더 높은 세포 생존율을 보였으며, 이는 37°C에서 약물 방출이 적기 때문으로 연관됩니다. Live/dead 염색(Fig. 4)에서 PNIPAM-co-AAc5-β-LP는 3시간 후 현저한 세포독성을 보인 반면, PNIPAM-co-AAc20-β-LP는 pH 8.0에서 6시간까지 크게 독성을 보이지 않다가 상승적 세포 사멸이 관찰되었습니다.

결론

AAc 함량으로 LCST를 조절 가능한 PNIPAM-co-AAc 나노젤을 성공적으로 개발했습니다. 고함량 AAc(20%) 제형은 생리적 온도에서 β-LP 방출을 최소화하면서 소장 환경인 염기성 pH에서 효율적으로 약물을 방출합니다. 이러한 이중 자극 반응성 나노젤은 경구 투여를 통한 장 표적 β-라파촌 전달을 위한 매력적인 플랫폼입니다.