자기 공명 영상 및 약물 전달을 위한 치료 물질로서 Fe3O4 나노클러스터를 기반으로 하는 하이브리드 나노구조의 제작

결과 및 토론

Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX 하이브리드 나노구조는 1차 산화철(Fe₃ O₄ ) 이전에 수정 [17, 47]으로 설명한 마이크로 에멀젼 자가 조립 기술을 통해 조밀하게 패킹된 구형 응집체를 생성한 NP와 LBL 정전기 흡착 방법. 그림 1은 Fe₃ 합성의 개략도를 보여줍니다. O₄ NC/PAH/PSS/DOX 하이브리드 나노구조. 소수성 올레산 코팅 마그네타이트 Fe₃ O₄ 나노입자는 처음에 유기용매에서 열분해 과정에 의해 생성되었다[46]. Fe₃ O₄ NP는 구형이고 평균 입자 크기가 약 15 nm인 균일한 크기입니다(추가 파일 1:그림 S1). 자기 NC 조립을 위해 OA 코팅된 Fe₃ O₄ 나노입자를 시클로헥산에 분산시킨 다음 SDBS를 함유하는 수용액에 적가하였다. 복합 용액을 초음파 처리하여 안정적인 수중유 에멀젼을 형성했습니다. 에멀젼에서 유기 용매의 증발 후, Fe₃ O₄ NP는 소수성 상호작용을 통해 구형 나노클러스터를 형성하기 위해 자가 조립되었다. 다음으로 Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX 하이브리드 나노구조는 정전기적 인력 상호작용을 통해 LBL 방법을 통해 제조되었으며, 이는 그림 1에 개략적으로 도시되어 있습니다.

Fe₃ 합성의 개략도 O₄ MRI 및 약물 전달을 위한 치료학적 제제로서의 NC/PAH/PSS/DOX 하이브리드 나노구조

Fe₃의 형태와 크기 O₄ NC와 Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS 하이브리드 나노구조는 각각 TEM과 DLS로 조사되었다. 도 2a 및 b에 도시된 바와 같이, Fe₃ O₄ NC는 준구형 클러스터를 보여줍니다. DLS로 측정한 평균 입자 크기는 약 57 nm입니다(그림 2e). 이전 보고서에서 양전하를 가진 PAH 또는 음전하를 가진 PSS는 우수한 정전기 특성으로 인해 템플릿 표면에 교대로 증착되었습니다[48,49,50,51]. Fe₃에 증착된 각 고분자 전해질 층의 형성을 연구하기 위해 O₄ NC, 제타 전위 실험을 수행했습니다. PSS/PAH 및 DOX 코팅용 고분자 전해질 층에 따른 제타 전위의 변화는 추가 파일 1:그림 S2에 나와 있습니다. 깨끗한 Fe₃ O₄ NC는 SDBS의 존재로 인해 - 19.7 mV의 음의 제타 전위를 갖습니다. Fe₃에서 양전하를 띤 PAH 단일층의 흡수 O₄ NC는 표면 전위를 - 19.7에서 + 32 mV로 반전시킵니다. 결과적으로, 음으로 하전된 PSS 층의 증착은 + 32에서 - 34 mV로의 또 다른 표면 전위 반전을 유발합니다. 이것은 자성 NC 하이브리드 나노구조의 제조 동안 단계적 층 성장을 나타낸다. 이러한 결과는 PAH 및 PSS 층이 Fe₃에 성공적으로 코팅되었음을 보여줍니다. O₄ NC. 마지막으로 DOX는 Fe₃ 표면에 성공적으로 흡착되었습니다. O₄ 양의 제타 전위(+ 1.91 mV)로 확인된 NC/PAH/PSS/DOX 하이브리드 나노구조(추가 파일 1:그림 S2). Fe₃ 배율이 다른 TEM 이미지 O₄ NC/PAH/PSS 하이브리드 나노구조는 그림 2c 및 d에 나와 있습니다. 고분자 전해질 코팅 후에는 구조적 및 형태적 차이가 크게 관찰되지 않습니다. Fig. 2a 및 b와 비교하여 밝은 콘트라스트를 관찰할 수 있으며 Fe₃의 크기는 O₄ NC/PAH/PSS 하이브리드 나노구조는 PAH 및 PSS 층의 코팅으로 인해 약간 증가합니다. 합성된 자기 하이브리드 나노구조는 DLS 측정 결과에 따라 평균 크기가 약 84 nm인 거의 단분산된 준구형을 나타냅니다(그림 2f).

Fe₃의 TEM 이미지 O₄ NC(a , b ) 및 Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS(c , d ) 각각 더 낮은 배율과 더 높은 배율에서. Fe₃의 크기 분포 O₄ NC(e ) 및 Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS 하이브리드 나노구조(f )

Fe₃의 잠재적 적용을 평가하기 위해 O₄ MRI의 NC/PAH/PSS 하이브리드 나노구조, 양성자 가로 이완 속도(1/T ₂ ) Fe 이온 농도의 함수로서 Bruker AVANCE 500WB 분광계를 사용하여 11.7 T에서 측정했습니다. 이완 속도와 Fe 이온 농도 사이의 선형 관계는 그림 3b와 같이 관찰되었습니다. 또한 횡이완율(1/T ₂ ) Fe₃ 농도 증가에 따라 증가 O₄ Fe₃의 높은 응집도로 인한 NC O₄ 자기 NP 코어, 자기 하이브리드 나노구조가 효과적인 T ₂ - 가중 MRI 조영제(그림 3a). 그림 3b의 플롯의 기울기를 기준으로 가로 이완도 값(r ₂ )는 651.38 mM ⁻¹ 로 결정되었습니다. S ⁻¹ , 이는 보고된 작업보다 높다[22]. 상업용 T와 비교 ₂ 조영제를 사용하면 나노 클러스터는 집합적 효과를 기반으로 자기 NP가 자기 조립된 후 Fe의 대비 능력을 크게 향상시켜 혈관 조영 효과를 크게 향상시킬 수 있습니다. 이전 연구에서 조립된 자철광 나노결정은 자성 나노결정의 집합적 효과로 인해 개별 나노결정보다 높은 수준의 포화 자화를 나타냈다[43, 52].

아 티 ₂ -Fe₃의 가중 MRI 이미지 O₄ 물에서 다양한 농도의 NC/PAH/PSS 하이브리드 나노구조. ㄴ 이완율 도표 r ₂ 대 Fe₃의 Fe 농도 O₄ NC/PAH/PSS 하이브리드 나노구조. 이완 가치 r ₂ 실험 데이터의 선형 맞춤의 기울기에서 구했습니다.

Fe₃의 약물 로딩 용량을 평가하기 위해 O₄ NC/PAH/PSS/DOX 하이브리드 나노구조체를 약물전달체로, 수용성 항암제(DOX)를 모델 약물로 선택하였다. 고효율의 하이브리드 나노구조에서 DOX의 저장은 용액의 색 변화에 의해 처음으로 밝혀졌다. Fe₃ 용액의 색상 O₄ NC/PAH/PSS와 순수한 DOX 용액은 각각 황색과 적색이었다(그림 4a 및 b). Fe₃ 형성 후 O₄ NC/PAH/PSS/DOX 하이브리드 나노구조의 경우 용액의 색상이 주황색이 되었습니다(그림 4c). Fe₃의 존재로 인해 O₄ 현탁액에서 DOX가 로딩된 나노 구조인 NP는 외부 자석에 의해 분리될 수 있으며, 이는 자기 표적화된 약물 전달을 위해 얻어진 하이브리드 나노 구조의 큰 잠재력을 시사합니다(그림 4d). UV-vis 흡수 분광법은 효과적인 DOX 저장 용량을 결정하는 데 사용되었습니다. 그림 4e는 Fe₃와의 상호작용 전후에 DOX 수용액의 UV-vis 흡수 스펙트럼을 보여줍니다. O₄ NC/PAH/PSS 하이브리드 나노구조. 유리 DOX와 비교하여 유사한 흡수 피크 특성이 Fe₃에서 관찰되었습니다. O₄ Fe₃의 재조합 흡수 피크인 NC/PAH/PSS/DOX 하이브리드 나노구조 O₄ NC와 DOX. DOX가 없는 샘플은 Fe₃의 흡수 피크만 보여줍니다. O₄ NC. 이러한 데이터는 약물로서의 DOX가 하이브리드 나노구조의 표면에 성공적으로 흡수될 수 있음을 나타냅니다. 또한, 하이브리드 나노구조체의 표면에 로딩되는 DOX의 흡착 농도의 상한이 있음을 발견하였다. 그림 4f는 Fe₃의 PL 스펙트럼을 보여줍니다. O₄ 다른 농도의 DOX가 Fe₃에 추가되었을 때 원심분리 후 NC/PAH/PSS/DOX 하이브리드 나노구조 O₄ NC/PAH/PSS 솔루션. DOX의 발광 강도는 Fe₃ 농도로 상한(8 mg/mL)에 도달할 때까지 추가된 DOX가 증가함에 따라 증가합니다. O₄ NC/PAH/PSS(1.30 × 10 ⁻² mg/mL) 변동 없음. 이후 Fe₃ 표면에 흡착되지 않는 과잉 DOX로 인해 포획량이 감소합니다. O₄ NC/PAH/PSS/DOX 하이브리드 나노구조. DOX의 가장 강한 형광 강도는 8 mg/mL 농도에 해당하며 해당 샘플은 생의학 실험을 수행하기 위한 추가 연구에 사용됩니다. 하이브리드 나노구조의 확실한 약물 로딩 효율은 임상 적용에 매우 중요합니다. 로딩 효율은 DOX의 표준 곡선 방법을 사용하여 DOX 형광 강도의 면적 적분에 의해 계산되었습니다[53, 54]. 하중 효율은 Fe₃에 대해 최대 24.39%로 계산되었습니다. O₄ NC/PAH/PSS/DOX 하이브리드 나노구조. 따라서 Fe₃ 기반으로 theranostic 플랫폼이 구축되었습니다. O₄ 항암제 DOX의 효과적인 흡수로 인한 NC/PAH/PSS/DOX 하이브리드 나노구조.

사진(a –d ) Fe₃에서 DOX의 다양한 흡수 단계 O₄ NC/PAH/PSS 하이브리드 나노구조. UV-vis 흡수 스펙트럼(e )의 DOX, Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS 및 Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX 하이브리드 나노구조. 발광 스펙트럼(f )의 Fe₃ O₄ 다른 농도의 DOX가 Fe₃에 첨가되었을 때의 NC/PAH/PSS/DOX 하이브리드 나노구조 O₄ NC/PAH/PSS 하이브리드 나노구조 솔루션

Fe₃의 시험관 내 약물 방출 프로필 O₄ 다양한 환경 pH 값에서 NC/PAH/PSS/DOX 하이브리드 나노구조가 그림 5에 나와 있습니다. Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX 하이브리드 나노구조는 37 °C의 인산염 완충액에서 투석막을 통해 투석되었습니다. 하이브리드 나노구조체로부터 방출된 DOX를 수집한 후 DOX의 방출량을 상등액의 형광 강도로 계산하였다. 생리학적 pH .4에서 관찰된 약물 방출은 느린 방출 과정입니다. DOX의 약 20 wt%가 초기 5 h에 방출되었고 이후 느린 방출의 안정 단계에 진입하였다. pH 5.0에서 DOX의 약 80 wt%가 방출 안정기에 도달하기 전 초기 15 h에 하이브리드 나노구조에서 방출되었습니다. 30시간 동안 관찰된 DOX 방출의 안정기 백분율은 pH 5.0 및 7.4에서 각각 80 ± 3중량% 및 20 ± 3중량%였습니다. Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX 하이브리드 나노구조는 지속 방출 프로파일과 pH 7.4보다 pH 5.0에서 더 높은 DOX 방출 속도가 밝혀졌습니다. 낮은 환경 pH는 Fe₃에서 DOX 방출을 가속화합니다. O₄ NC/PAH/PSS/DOX 하이브리드 나노구조. 이는 –NH₂의 양성자화 때문입니다. 산성 조건에서 DOX 그룹은 낮은 pH 값에서 DOX와 PSS 폴리머 사이의 정전기적 상호작용을 감소시킵니다[55]. 약물 방출 연구는 보고된 연구와 유사하게 생리학적 pH에서 정전기적으로 결합된 약물 분자의 우수한 안정성과 산성 조건에서 촉발된 방출을 나타냅니다[56,57,58]. 따라서 얻어진 Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX 하이브리드 나노구조는 DOX 약물 전달을 위한 pH 반응성 시스템이며 고형 종양의 특정 치료에 적합합니다[59].

Fe₃에서 DOX 방출 플롯 O₄ pH 7.4 및 5.0에서 PBS 완충액의 NC/PAH/PSS/DOX 하이브리드 나노구조

세포 흡수와 세포 독성은 새로운 약물 전달 시스템의 잠재력을 평가하는 핵심 요소입니다. Fe₃의 세포 흡수 및 세포 독성 O₄ A549 세포주의 NC/PAH/PSS/DOX 하이브리드 나노구조를 연구했습니다. Fe₃의 세포간 흡수 O₄ NC/PAH/PSS/DOX 하이브리드 나노구조는 주로 DOX의 형광을 모니터링함으로써 실현되는 광학 및 형광 현미경을 사용하여 조사되었습니다. Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX 하이브리드 나노구조는 DOX를 암세포에 전달하는 데 효과적인 것으로 입증되었습니다. 도 6에 나타낸 바와 같이, DOX로부터의 강한 적색 형광은 24시간 배양 후 암세포에서 관찰되었다. 하이브리드 나노구조는 주로 엔도사이토시스를 통해 내재화되었다[60]. 세포 흡수 후, 하이브리드 나노구조는 엔도솜/리소좀 주변의 산성 환경에서 DOX를 방출했으며, 여기서 충분히 낮은 pH(4.3)는 효과적인 DOX 방출(pH 5.0, 그림 5)을 유발할 수 있습니다. Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX 하이브리드 나노구조는 그림 6과 같이 A549 암세포에서 시간 의존적 흡수를 나타냈습니다. 배양 후 0.5 h에서 세포 주변에서 적색 형광을 볼 수 있었습니다. 결과는 DOX를 포함하는 하이브리드 나노구조가 주로 A549 세포 주위에 머물렀음을 보여줍니다. 그러나 배양 시간이 24 h로 증가하면 A549 세포에서 세포간 형광 신호가 증가하였다. 분명히, 많은 하이브리드 나노구조가 시간이 지남에 따라 암세포에 들어갈 수 있습니다. 이 결과는 Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX 하이브리드 나노구조는 DOX를 A549 세포로 효율적으로 전달할 수 있습니다. 세포질의 하이브리드 나노구조에서 방출된 DOX는 핵막을 통과하여 결국 핵에 축적되어 DNA 형태의 변화를 일으켜 세포를 죽입니다[61].

Fe₃와 함께 배양된 A549 세포의 공초점 형광 현미경 이미지 O₄ a에 대해 37 °C에서 NC/PAH/PSS/DOX 하이브리드 나노구조 0.5 h 및 b 24 시간. 스케일 바, 20 μm

Fe₃의 약리학적 활성을 평가하기 위해 O₄ NC/PAH/PSS/DOX 하이브리드 나노구조체, 시험관내 A549 세포에 대한 세포독성을 MTT 방법으로 측정하였다. 그림 7은 유리 DOX인 Fe₃의 세포 활동을 보여줍니다. O₄ NC/PAH/PSS 및 Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures with different concentrations after incubation with A549 cells for 24 h. The material amounts were calculated according to the concentration of DOX. The free DOX concentration was the same as the DOX concentration in Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures, and the concentration of Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS hybrid nanostructure was the same as the Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS concentration in the Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures. Each sample was cultured with A549 cells for 24 h. The concentration of Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS ranged from 0.1 to 2.0 μΜ, and the cell survival rate exceeded 85%. This indicated that Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS hybrid nanostructures had no obvious cytotoxicity to cancer cells and had good biocompatibility. After incubating with cancer cells for 24 h, however, the free DOX and Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures showed obvious cytotoxicity. The cellular viability progressively decreased with increasing effective DOX concentration. As shown in Fig. 7, when the effective DOX concentration was increased from 0.1 up to 2.0 μM, the relative cell viability decreased from about 92% to about 50% for free DOX, and from about 89% to about 40 % for Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures, respectively.

Relative viability of A549 cells incubated with free DOX, Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS, and Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures at different concentrations for 24 h. Error bars were based on triplicate samples

These results indicate that both free DOX and Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures have dose-dependent cytotoxicity to cancer cells. The cytotoxicity originates from the loaded DOX rather than Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS hybrid nanostructures. Cell uptake of free DOX is faster than that of DOX-loaded hybrid nanostructures. This reason is that small DOX molecules can quickly spread into cells, while Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures must be endocytosis in order to enter cancer cells. Because of the hypoxia-induced coordinated upregulation of glycolysis, the acidic extracellular environment of solid tumors is stronger than that of normal tissues [62]. At the cellular level, the internalization of most of the hybrid nanostructures will take place through endocytosis. With the increase of DOX concentration, more and more hybrid nanostructures loaded with DOX are endocytosed into cancer cells. After cellular endocytosis, the DOX-loaded hybrid nanostructures usually enter the early endosomes, then enter the late endosomes/lysosomes, and finally fused with lysosomes. Furthermore, both endosomes (pH 5.0–6.0) and lysosomes (pH 4.5–5.0) have an acidic microenvironment. In our study, the pH-responsive Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures were more likely to decompose and release drugs in acidic environments, thus effectively reducing side effects, prolonging half-life of drugs, and providing more effective and lasting treatment. Due to the main target of DOX being cell nucleus, DOX can bind to double-stranded DNA to form DNA adducts, inhibit the activity of topoisomerase and induce cell death (apoptosis) [63]. As a result, the released DOX molecules were located in the cell nucleus. Therefore, the obtained Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures may have good potential for cancer chemotherapy.

As discussed above, the Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures exhibit high relaxivity in aqueous solution and can be uptaken efficiently by A549 cells. The intracellular MRI of the Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures were then investigated by incubation of A549 cells with the hybrid nanostructures with different Fe₃ O₄ 농도. Figure 8 presents the T ₂ -weighted MRI of A549 cells. With the increase of Fe₃ O₄ concentration in Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures, the cellular MRI signal increased gradually (Fig. 8). Currently, cell labeling is mainly accomplished by the endocytosis of Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures as T ₂ -negative contrast agents. These results demonstrate that the Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures can be internalized into cells and exhibit good T ₂ -weighted MRI contrast for cellular imaging. Our current research is limited to the cellular level. Future in vivo studies would be necessary for the practical application of the Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures. To specially target a specific site in animal studies, small ligands such as lactic acid and folic acid (both containing carboxyl groups) would require to be used to conjugate amino-terminated Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures.

티 ₂ -weighted cellular MR images of A549 cells incubated with the Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures at a Fe concentration of 2.2, 4.5, 9.0, and 13.5 μM, respectively