자성 금 나노입자 표지 헤파라나제 단클론항체 및 종양 자기 공명 영상의 후속 응용

방법

세포주 및 마우스

이 연구에서는 7개의 세포주가 사용되었습니다. 간암 세포주 HepG2, 인간 위암 세포주 MKN45 및 SGC-7901, 결장암 세포주 SW480, 인간 골육종 세포주 U2OS를 포함한 헤파라나제 양성 세포주는 American Type Culture Collection에서 구입했습니다. Heparanase-음성 세포주, 인간 유방암 세포주 MCF-7 및 인간 1차 배아 섬유아세포 세포주 HF는 Dr. Liang(Burn Research Institute, Third Military Medical University, Chongqing, China)에 의해 제공되었습니다. HepG2 세포를 10% 소태아혈청을 함유하는 DMEM에서 배양하였다. SGC-7901, SW480, U2OS 및 HF 세포를 10% 소태아혈청을 함유하는 RPMI 1640에서 배양하였다. MKN45 및 MCF-7 세포를 15% 소태아혈청을 함유하는 RPMI 1640에서 배양하였다. 모든 세포는 5% CO₂에서 배양되었습니다. 37°C에서 배양하고 24~48시간마다 계대했습니다. 15마리의 BALB/c 누드 마우스(4~5주령)를 제3군사 의과대학 동물과에서 구입했습니다. 동물 연구는 제3군사대학교 지역윤리위원회와 협의하여 수행하였다. 모든 누드 마우스는 특정 병원체 없는 환경에서 유지되었습니다.

서부 얼룩

이전 연구에서 설명한 절차에 따라 Hpa 단백질 발현을 검출하기 위해 웨스턴 블롯을 수행했습니다[17]. 각 세포주는 M-PER 추출 시약(Pierce Co.)으로 용해시켰다. 단백질 농도는 BCA 분석(Bio-Rad, CA, USA)에 의해 결정되었습니다. 30마이크로그램의 단백질을 10% SDS-PAGE로 분획화한 다음 폴리비닐리덴디플루오라이드(PVDF) 멤브레인(Roche, Rotkreuz, Switzerland)으로 옮겼습니다. 멤브레인은 5%(w /v ) TBST(20mM Tris-HCl[pH 8.0], 150mM NaCl 및 0.1%[v)의 탈지유 /v ] Tween-20) 실온에서 2시간 동안 그런 다음 4°C에서 밤새 블로킹 버퍼에 항-HPA 항체(Insight, Israel)를 1:200으로 희석하여 멤브레인을 탐침했습니다. 막을 TBST로 4회 세척하고 마우스 IgG에 대한 양고추냉이 퍼옥시다제 결합 항체와 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션했습니다. 그런 다음 막을 TBST로 헹구고 단백질 밴드를 ECL Western Blotting Detection Reagents(GE Healthcare, NJ, USA)로 시각화했습니다. 이미지는 Quantity One 4.1 소프트웨어(Bio-Rad)로 분석되었습니다. 실험은 적어도 세 번 반복되었습니다.

면역조직화학 염색

상기 세포주에서의 Hpa 발현은 면역세포화학에 의해 검출되었다. 간단히 말해서, 위의 세포는 37°C, 5% CO₂의 멸균 커버슬립에서 배양되었습니다. 48시간 동안 인큐베이터 내인성 과산화효소 활성이 0.3% H₂ 처리에 의해 차단된 후 O₂ -메탄올 용액 20분, 세포를 4°C에서 밤새 Hpa 1차 항체(항체 희석액은 1:100)와 함께 인큐베이션했습니다. 0.1% Triton X-100이 포함된 PBS로 철저히 세척한 후 슬라이드를 20°C에서 20분 동안 2차 항체와 함께 인큐베이션했습니다. 마지막으로 슬라이드를 아비딘-비오틴 효소 시약과 함께 15분 동안 인큐베이션했습니다. 그런 다음 슬라이드를 3,3'-디아미노벤지딘/H2O2 용액에 담그었습니다. PBS는 음성 대조군으로 사용되었습니다.

HPA&GoldMag 분자 프로브 및 원자력 현미경 사진의 건설

분자 프로브의 구성은 작동 지침에 따라 GoldMagTM-CS 키트(Xi'an Gold magnetic nano biotechnology company, GNK0202, Xi'an, China)를 사용하여 수행되었습니다. HPA 항체의 농도는 1mg/ml입니다. 원자간력 현미경 사진(AFM)을 사용하여 나노입자의 모양, 크기 및 표면 모양을 평가했습니다. 표지되지 않은 자성 금 나노입자 또는 표지된 자성 금 나노입자를 커버슬립 위에 놓고 실온에서 24시간 동안 공기 건조했습니다. 건조된 샘플은 원자력 현미경(AFM, Nanoscope, Digital Instruments, Santa Barbara, CA)을 사용하여 분석되었습니다.

면역형광

간단히 말해서, 세포는 5% CO₂에서 37°C의 멸균 커버슬립에서 배양되었습니다. 48시간 동안 인큐베이터 그런 다음 4%(w /v ) 포름알데히드를 PBS에 30분 동안 담그고 0.2%(v /v ) Triton X-100을 실온에서 5분 동안 커버슬립을 10%(v /v ) PBS에서 30분 동안 염소 혈청. 그런 다음, 세포를 1:50 희석의 HPA&GoldMag 분자 프로브 또는 일반 마우스 IgG&GoldMag 프로브로 염색한 다음 1:100 희석의 Cy3 표지된 염소 항-마우스 IgG로 염색했습니다. 그런 다음 세포를 실온에서 10분 동안 0.4mg/mL DAPI(Sigma-Aldrich)로 염색했습니다. 레이저 공초점 현미경을 사용하여 현미경 이미지를 획득했습니다. 일반 마우스 IgG&GoldMag 프로브를 음성 대조군으로 사용했습니다.

유세포분석

HPA&GoldMag 프로브의 활성은 유세포 분석에 의해 결정되었습니다. 세포를 염소 혈청으로 1시간 동안 차단했습니다. 그런 다음, 세포를 4°C에서 밤새 10μg HPA&GoldMag 프로브 또는 일반 마우스 IgG&GoldMag로 염색하고 PBS로 4회 세척한 다음 마우스 IgG에 대한 FITC 표지 항체와 함께 37°C에서 1시간 동안 인큐베이션했습니다. 세포를 PBS로 세척하고 유세포 분석기(Becton Dickinson)로 형광 강도를 측정했습니다.

MR 이미징을 위한 자성 금 나노입자의 체외 연구

자성 금 나노입자 용액(5mg/ml)을 1% 아가로스 용액을 사용하여 2배(1:20–1:1280) 연속 희석했습니다. 용액은 EP 튜브에서 고형화되었습니다. MR 스캐닝은 블랭크 대조군으로 1% 아가로스 겔을 사용하여 수행되었습니다. 스캐닝 매개변수는 다음과 같았다:T1WI; TR600ms/TE12ms; 두께, 2.0mm; FOV, 150mm 및 T2WI; TR6000ms/TE92ms; 두께, 2.0mm; FOV, 150mm HPA&GoldMag MR 분자 프로브는 30nm 자성 금 입자로 표지된 HPA mAbs를 사용하여 구성되었습니다. 세포를 100mm 배양 접시에서 일상적으로 배양한 다음, HPA&GoldMag 프로브 또는 음성 IgG&GoldMag 프로브를 세포 배양에 추가하고 37°C에서 90분 동안 배양했습니다. 적절한 양의 염소 혈청을 첨가하여 결합되지 않은 프로브를 차단했습니다. PBS로 3회 세척한 후 세포를 트립신으로 분해하였다. 그런 다음 세포를 수집하고 1% 아가로스 용액과 혼합하고 1.5ml EP 튜브로 옮겼습니다. 동물용 특정 자기 공명 코일을 사용하여 3.0T MRI 스캐너(스캐닝 매개변수는 위에서 설명한 것과 동일)를 사용하여 MR 스캔을 수행했습니다. 스캔하기 전에 마우스를 1% 펜토바르비탈로 마취하고 스캔 베드에 눕혔습니다.

MR 이미징을 위한 자성 금 나노입자의 생체 내 연구

4~6주 된 수컷 누드 마우스(26~30g)에 200μl의 MKN45 세포를 엉덩이에 피하 주사했습니다. 각 누드 마우스에 약 2.0 × 10 ⁶ 세포. 2주 후에 종양이 보이고 MR 영상에 사용됩니다. 주사 전과 주사 후 2시간에 3.0T MRI 스캐너를 사용하여 MR 스캔을 수행했습니다. 매개변수는 T2WI, TR6000ms/TE92ms였습니다. 두께, 1.5mm; 및 FOV, 120mm 이후 종양, 비장, 간, 신장, 비장, 심장, 폐 조직을 채취하여 Prussian blue Fe 염색을 시행하였다.

통계 분석

모든 데이터는 평균 ± 표준편차로 표시됩니다. ANOVA 분석은 SPSS13.0 소프트웨어를 사용하여 수행되었습니다. 피 value <0.05는 차이가 유의함을 나타냅니다.

결과

HPA는 다양한 암세포에서 다르게 발현되었습니다

HepG2, SGC-7901, MKN45, MCF-7, SW480 및 U2OS 세포에서 Hpa의 발현을 테스트하기 위해 웨스턴 블롯 및 면역조직화학 염색 분석이 모두 사용되었습니다. 그 결과 Hpa의 발현은 HepG2, SGC-7901, MKN45, SW480, U2OS 세포에서 훨씬 높았으나 MCF-7 세포에서는 훨씬 낮은 Hpa 발현이 검출되었다(그림 1).

다양한 세포주에서 Hpa 단백질의 발현. 아 다양한 종양 세포주에서 HPA 단백질 발현(65kDa)을 검출하기 위해 웨스턴 블롯이 사용되었습니다. 레인 1, HepG2; 레인 2, SGC-7901; 레인 3, MKN45; 레인 4, MCF-7; 레인 5, SW480; 레인 5, U2OS. ㄴ HepG2, SGC-7901, MKN45, MCF-7, SW480 및 U2OS 세포주에서 HPA 발현의 면역조직화학 분석

HPA&GoldMag 분자 프로브의 구성 및 검출

HPA&GoldMag 분자 프로브는 자성 금 나노 입자의 표면 사이의 결합 반응을 사용하여 HPA mAb와 자성 금 나노 입자를 결합하여 제조되었습니다. AFM(Atomic Force Microscopy)을 사용하여 프로브의 표면 구조를 직접 관찰했습니다. 우리는 자성 금 나노 입자의 평균 직경이 HPA mAbs로 표지되지 않은 경우 13.78nm임을 보여주었습니다(그림 2a). 입자 크기는 균질했다. HPA mAbs로 라벨링된 후 평균 직경은 약 24.80nm였습니다(그림 2b). 이러한 결과는 자성 금 나노입자가 HPA mAbs와의 결합에 적합함을 시사했습니다.

아 자성 금 나노 입자와 HPA mAbs의 결합 모델. ㄴ 자성 금 나노 입자의 원자력 스캐닝

HPA&GoldMag 분자 프로브는 HPA에 구체적으로 결합할 수 있음

먼저, 분자 프로브와 HPA 간의 결합 특이성을 면역형광법으로 평가하였다. 그 결과 HepG2, MKN45, SW480, U2OS 세포의 세포질에서 다량의 적색형광이 검출된 반면, MCF-7 세포에서는 소량의 적색형광만이 검출되었고 HF 세포에서는 형광이 검출되지 않았다. . 그러나 음성 마우스 IgG&GoldMag는 어떤 세포주에서도 HPA와의 상호작용을 나타내지 않았습니다(그림 3). HPA&GoldMag 분자 프로브의 특이성을 테스트하기 위해 유세포 분석을 추가로 사용했습니다. 우리는 HF 세포에서 음성 반응을 보였고 MCF-7 세포에서 40%의 양성률을, HepG2, SW480, U2OS 및 MKN45 세포에서 95%의 양성률을 관찰했습니다. 이러한 결과는 프로브가 종양 세포에서 발현되는 HPA에 특이적으로 결합할 수 있음을 나타냅니다.

면역형광 및 유세포 분석에 의해 검출된 프로브의 특이성 및 결합 활성. 아 표시된 대로 프로브를 사용하여 면역형광을 수행했습니다. ㄴ HPA&GoldMag 분자 프로브의 특이성을 테스트하기 위해 유세포 분석기를 사용했습니다.

시험관 내 HPA&GoldMag 프로브의 MR 이미징

1% agarose를 이용한 연속 희석 후 T2WI sequence를 이용한 자성 금 나노입자의 MR 영상은 다른 신호 감소를 보였다. 1:640 희석의 T2WI 신호는 1% 아가로스 겔 대조군의 신호보다 훨씬 낮았습니다(P <0.05) (그림 4a, b). 결과는 자성 금 나노 입자가 낮은 농도에서도 효과적으로 MR 신호를 감소시킬 수 있음을 보여 주었으며, 이는 자성 금 나노 입자가 분자 이미징에 적합할 수 있음을 시사합니다. 그런 다음 HPA&GoldMag 분자 프로브를 사용하여 HepG2, SGC7901, MKN45, SW480, U2OS, HF 및 MCF-7 세포에 라벨을 붙인 다음 1% 아가로스와 혼합하고 3.0T 자기 공명(MR) 하에 두었습니다(그림 4c). 축 및 관상 스캔을 위한 T1WI(그림 4c, d) 또는 T2WI(그림 4c, e) 시퀀스를 사용한 MR 스캔. 결과는 T1WI 시퀀스와 비교하여 MR 스캐닝의 T2WI 시퀀스를 사용한 신호가 유의하게 감소되었음을 보여줍니다(P <0.05) 라벨링 후 HF 세포의 신호는 크게 변경되지 않았지만(P> 0.05), 표지 후 MCF-7 세포의 신호는 최소한으로 감소했습니다(P <0.05).

아 두 번의 연속 희석 후 자성 금 나노 입자의 MR 영상. ㄴ 2개의 연속 희석 자성 금 나노 입자의 MR 영상 신호 강도의 통계 결과 다이어그램. ㄷ 프로브로 라벨링한 후 모든 세포의 MR 영상. 레인 1, HF; 레인 2, MCF-7; 레인 3, HepG2; 레인 4, SGC-7901; 레인 5, MKN45; 레인 5, SW480; 레인 6, U2OS. d HPA&GoldMag 프로브로 표지된 세포에서 T1WI 시퀀스를 사용한 MR 영상의 신호 강도를 비교한 통계 결과. 이 HPA&GoldMag 프로브로 표지된 세포에서 T2WI 시퀀스를 사용하여 MR 영상으로 감지된 신호 강도에 대한 통계 결과

누드 마우스에서 HPA&GoldMag 프로브의 MR 이미징

모든 누드 마우스는 50mg/kg 용량의 펜토바르비탈 나트륨으로 마취되었습니다. 분자 프로브를 누드 마우스의 꼬리 정맥에 주입하고 투여 전과 투여 2시간 후에 MR 스캔을 수행했습니다. 프로브는 폐와 간의 대식세포에 의해 흡수되고 신장으로 배설될 수 있기 때문에 스캐닝 결과는 주사 후 누드 마우스의 종양, 간, 신장 및 폐 조직이 신호에 비해 현저히 감소된 신호를 나타냄을 보여주었습니다. 주사 전에 검출된 것(P < 0.05) (그림 5).

아 대조군 또는 HPA&GoldMag 프로브 주입 전과 주입 후 2시간 후 누드 마우스의 MR 영상. 화살표는 마우스의 종양을 나타냅니다. ㄴ 누드 마우스에 대조군 또는 HPA&GoldMag 프로브를 주입하기 전과 후에 T2WI를 사용한 MR 이미지의 신호 강도 비교. ^* 피 <0.01