자성 Fe3를 기반으로 하는 다목적 합성 경로 O4 포스폰산 단일층을 사용한 나노입자(MNP) 사전기능화는 나노입자 표면에 gH625 펩티드를 공유 결합하는 데 사용되었습니다. gH625는 인간의 대표적인 혈뇌장벽 성분을 포함하여 다양한 세포의 막을 쉽게 통과할 수 있는 멤브레인형 펩타이드입니다. 유사한 합성 경로를 사용하여 잘 알려진 표적 분자인 PEG, 로다민 및 엽산을 기반으로 하는 기능성 코팅을 가진 MNP의 또 다른 부류를 제조하여 두 세포 투과 시스템(즉, gH625 및 엽산)의 성능을 비교했습니다. 산). 우리의 결과는 24시간 후 불멸화된 인간 뇌 미세혈관 내피 세포에서 gH625로 장식된 MNP의 흡수가 공초점 레이저 스캐닝 현미경으로 입증된 바와 같이 엽산 기능화된 MNP에 비해 더 분명하다는 것을 보여줍니다. 한편, 두 기능화된 시스템 모두 뇌종양 세포주(즉, 교모세포종 A-172)에 내재화될 수 있는 것으로 입증되었습니다. 이러한 발견은 gH625를 사용한 MNP의 기능화가 내피 세포 내재화를 개선함을 나타내며, 이는 먼저 BBB를 통과한 다음 특정 종양 뇌 세포에 도달할 수 있는 기능적 나노구조를 설계하는 실행 가능한 전략을 제안합니다.
<섹션 데이터-제목="배경">혈액뇌장벽(BBB)은 중추신경계(CNS) 항상성의 유지에 중요한 역할을 하는 혈액과 뇌 사이의 동적 인터페이스입니다. BBB의 주요 구성요소는 뇌 미세혈관의 내부 표면을 덮는 연속 시트를 형성하는 내피 세포(즉, 성상세포 및 혈관주위세포)입니다. 그것들은 BBB 혈관 투과성 제어[1]와 다양한 순환 독소 및 기타 해로운 분자[2, 3]로부터 뇌를 보호하는 데 모두 중요한 긴밀한 접합부에 의해 상호 연결되어 있습니다. 다른 신경 혈관 단위 구성 요소인 뉴런과 미세아교세포는 BBB에서 다른 역할을 합니다[4, 5].
내피세포 연속시트로 인해 저분자 약물은 98%, 고분자 약물은 100%가 BBB를 통과하지 못해 뇌조직까지 약물을 전달하지 못한다[6]. 따라서 많은 뇌 질환의 치료를 위한 효율적인 전달 시스템을 개발하기 위해서는 보인자가 BBB를 통과하는 능력을 조사하는 것이 중요합니다[7].
지난 10년 동안, 나노입자 기반 시스템은 암 표적화 및 치료를 위한 효과적인 치료제로서 널리 연구되었습니다. 이러한 맥락에서 유기 기능화된 자성 철 나노 입자(MNP)는 표면 기능화의 다양성과 자기 특성 및 코어의 무독성 생체 적합성을 결합하기 때문에 많은 관심을 받았습니다. MNP는 단백질 및 세포 분류 및 조작[8, 9], 세포 라벨링[10, 11], 자기 제어 약물 전달[12, 13], 자기 공명 영상(MRI)과 같은 진단학적 응용(진단 및 치료)에 널리 채택됩니다. [14, 15] 및 온열 요법 [16,17,18,19]. 생물 의학 응용 분야에 효율적으로 사용되기 위해서는 MNP가 세포막을 통과할 수 있어야 하며 특히 다양한 생물학적 장벽을 통과할 수 있어야 합니다. 기능성 분자로 MNP 표면을 변형하는 것은 세포 내재화를 개선하는 데 자주 사용되지만 많은 경우 BBB의 교차가 문제로 남아 있습니다.
이러한 맥락에서, 세포 투과성 펩타이드(CPP)의 사용은 천연 공급원 또는 합성으로 설계된 구성물에서 유래한 비교적 짧은 펩타이드(아미노산 5~40개) 그룹으로, 멤브레인 이중층을 쉽게 통과할 수 있음을 볼 수 있습니다. 유망한 접근 방식으로. 이용 가능한 수많은 CPP 중에서, 단순 헤르페스 바이러스 1의 당단백질 H(gH)에서 유래한 20개 잔기의 펩타이드 gH625가 최근 개발되어 다양한 화물의 흡수를 향상시키기 위해 BBB를 통과하는 데 사용되었습니다[20, 21] 세포질 속으로.
현재 연구에서 MNP는 3-아미노프로필포스폰산(NH2 -아빠). NH2에 연결하여 두 코팅을 얻었습니다. -PA 수정 MNP(NH2 @MNPs) gH625(gH625@MNPs) 세포 투과 펩타이드 또는 PEG 및 엽산(PEG, FA@MNPs) 분자. 특히, 페길화된 나노입자에 엽산(FA)을 도입하는 것은 FA 수용체 매개 내재화[22]와 전체 나노시스템의 생체적합성[23]을 통해 종양 세포의 세포 흡수를 향상시키는 것을 목표로 합니다. 인간 뇌(HBMEC)의 1차 미세혈관 내피 세포로의 MNP 세포내 흡수에 대한 2개의 표면 코팅의 효과는 공초점 레이저 스캐닝 현미경으로 평가되었습니다. 이를 위해 발광 프로브가 두 시스템에 통합되었습니다. 특히, gH625는 4-클로로-7-니트로벤즈-2-옥사-1,3-디아졸(NBD) 프로브로 표지된 반면, 카르복시-X -로다민(rhod) 프로브가 PEG,FA@MNPs의 쉘에 추가되었습니다.
우리가 아는 한 내피 세포에서 gH625 변형 MNP의 세포 내 흡수 및 FA 변형 MNP와의 비교에 대한 연구는 이전에 보고된 적이 없습니다.
BBB를 가로지르는 능력 외에도 뇌종양 세포를 표적으로 하는 것은 뇌종양 치료제에 대한 또 다른 중요한 요구 사항입니다. 따라서 가장 흔한 인간 악성 신경교종 중 하나인 A-172 교모세포종에서 서로 다르게 코팅된 두 MNP의 세포 내재화도 평가되었습니다.
gH625 기능화된 철 나노입자는 최근 Perillo et al. [24], 현재 작업에서 우리는 매우 다양한 포스폰산 플랫폼을 기반으로 하는 다른 합성 전략을 보고합니다. 특히, 포스폰산 화학은 MNP와 안정성이 실란화된 MNP와 유사한 포스폰 단일층 사이에 강한 결합을 형성할 수 있도록 합니다. 또한 P-O-P 자체 축합이 무시할 수 있기 때문에 phosphonic linker를 사용하면 실란을 사용할 때 자주 발생하는 올리고머 형성 단점을 극복할 수 있습니다[25].
MNP 합성 및 기능화에 사용되는 모든 시약, FeCl2 ·4H2 O, FeCl3 ·6H2 O, 3-아미노프로필포스폰산, 메톡시폴리에틸렌 글리콜 아세트산 N -분자량이 5000Da인 숙신이미딜 에스테르(PEG-NHS), 엽산, N -히드록시숙신이미드(NHS), 및 카르복시-X -로다민 N -숙신이미딜 에스테르(Rhod-NHS)는 Sigma-Aldrich에서 구입하여 추가 정제 없이 사용했습니다. 펩티드 합성에 사용된 9-플루오레닐메톡시카르보닐(Fmoc) 보호 아미노산은 Romil Del Chimica, Chemicals에서 구입했으며 추가 정제 없이 사용했습니다. 물은 Milli-Q 등급(18.2 MO cm)이었고 0.22μm 필터를 통해 여과되었습니다.
철 산화물 MNP는 Fe 3+ 의 알칼리 공침에 의해 합성되었습니다. 및 Fe 2+ , 문헌 [26]에 설명된 프로토콜에 따라. 간단히 말해서, FeCl2 ·4H2 O 및 FeCl3 ·6H2 O(몰비 1:2)는 N2에서 물(50ml)에 용해되었습니다. 격렬하게 휘젓는 분위기. NH3 H2에서 25% 80°C에서 용액에 O(5ml)를 첨가하고 30분 동안 반응을 계속했습니다. 생성된 현탁액을 실온으로 냉각시키고 초순수로 세척하였다. 얻어진 자기 나노입자(MNP)를 자기 경사분리에 의해 용매로부터 분리하였다.
펩타이드는 표준 고체상 9-플루오레닐메톡시 카르보닐(Fmoc) 방법을 채택하여 이전에 보고된 바와 같이 제조되었습니다[27]. 간단히 말해서, 50μmol의 펩타이드가 Wang 수지(0.75mmol/g)에서 연속적인 탈보호 및 커플링 사이클에 의해 합성되었습니다. 그런 다음 수지 결합 펩티드를 4-클로로-7-니트로벤조푸라잔(NBD-Cl)과 반응시켰다. 반응은 DIPEA의 존재 하에 밤새 수행되었다. 펩타이드를 수지로부터 절단하고 트리플루오로아세트산(TFA) 및 스캐빈저의 혼합물로 처리하고 얼음처럼 차가운 에틸 에테르에 침전시켜 탈보호하였다. 펩타이드를 물에 녹여 동결건조시켰다. 조 펩타이드 특성화는 물(0.1% TFA) 중 아세토니트릴(0.1% TFA)의 선형 구배를 15분 내에 20%에서 80%로 채택하는 전기분무 이온화(ESI) LC-MS에 의해 수행되었습니다. 그런 다음 분취용 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC)로 정제했습니다.
FA-NHS는 다음과 같은 공개된 방법으로 제조되었습니다[28]. 500mg의 엽산(FA)을 240ml의 트리에틸아민과 함께 10ml의 디메틸 설폭사이드(DMSO)에 용해했습니다. NHS(260mg) 및 N ,N -디시클로헥실카르보디이미드(470mg)를 첨가하고, 혼합물을 실온에서 암실에서 밤새 반응시켰다. 부산물인 디시클로헥실우레아를 여과에 의해 제거하였다. 그 다음, DMSO 용액을 감압하에 농축하고, FA-NHS를 디에틸 에테르에서 침전시켰다. 생성물을 무수 에테르로 여러 번 세척하고 공기 중에서 건조시켰다.
MNP(200mg)는 H2에 분산되었습니다. 30분 동안 초음파 수조를 사용하여 O(25ml) NH2 -PA(100mg)를 첨가하고 현탁액을 실온에서 2시간 동안 교반했습니다. 입자를 자기적으로 분리하고 H2로 4회 세척했습니다. O 다음 에탄올로 공기 중에서 건조합니다.
NH2 @MNPs(300mg) 및 gH625(1.2mg)는 DMSO(20ml)에 분산되었습니다. 용액을 25°C에서 밤새 혼합했습니다. 얻어진 입자를 자기적으로 분리하고; DMSO, H2로 세척 O, 그리고 에탄올; 공기 중에서 건조합니다.
NH2 @MNPs(300mg), PEG-NHS(30mg), FA-NHS(3mg), Rhod-NHS(3mg)를 DMSO(15ml)에 분산시키고 용액을 25°C에서 밤새 혼합했습니다. . 얻어진 입자를 자기적으로 분리하고; DMSO, H2로 세척 O, 그리고 에탄올; 공기 중에서 건조합니다.
X선 분말 회절(XRD) 측정은 θ –θ 40kV 및 30mA에서 작동하는 Cu Kα 방사선을 사용하는 5005 Bruker-AXS 회절계(Zeiss, Oberkochen, Germany). X선 광전자 분광법(XPS)은 표준 Al-Kα X선 소스가 있는 PHI 5600 다중 기술 ESCA-Auger 분광기로 수행되었습니다. 분석은 ± 7°의 수용각과 함께 45°(샘플 표면에 대해)의 광전자 각도로 수행되었습니다. XPS 결합 에너지(B.E.) 척도는 285.0eV에서 탄화수소 부분 및 외래 탄소로 인한 C 1s 피크를 중심에 둠으로써 보정되었습니다. UV/Vis 측정은 JASCO V-560 UV/Vis 분광 광도계로 수행되었으며 스펙트럼은 ± 0.2nm 분해능으로 기록되었습니다. MNP의 동적 광 산란(DLS) 및 제타 전위 측정은 He-Ne 레이저(633nm) 및 후방 산란 검출기(173°)가 장착된 Zetasizer Nano-ZS(Malvern Instruments, Malvern, UK)를 사용하여 25°C에서 수행되었습니다. ). 투과 FT-IR 측정은 KBr 펠릿 기술을 사용하여 JASCO FTIR 430 분광계로 기록되었으며 스펙트럼당 100개의 스캔이 수집되었습니다(스캔 범위 560–4000cm − 1 , 해상도 4cm − 1 ).
인간 뇌 미세혈관 내피 세포(HBMEC)와 인간 교모세포종 세포주 A-172를 보고된 방법에 따라 쥐꼬리 콜라겐 I형 코팅 조직 배양 플라스크에서 합류하도록 성장시켰다[29]. 간단히 말해서, HBMEC는 5% 소 태아 혈청(FBS) 및 1% 내피 세포 성장 보충제가 보충된 내피 세포 배지에서 성장되었습니다. A-172 세포주는 이전에 설명한 대로 2mM 글루타민 및 10% FBS를 포함하는 DMEM에서 성장했습니다[30]. 두 경우 모두 100U/ml 페니실린과 100μg/ml 스트렙토마이신도 배양액에 추가했습니다.
세포 생존율은 [3-(4,5-디메틸-2-티아졸릴)-2,5-디페닐-2H -테트라졸륨 브로마이드](MTT) 테스트[31]. 모든 실험 조건에서 FBS 농도는 1%(기아 배지)로 감소되었습니다. 실험 전반에 걸쳐 최적의 세포 밀도를 얻기 위해 세포를 7000개 세포/웰로 96웰 플레이트에 시딩했습니다. 모든 분석에서 세포는 먼저 MTT와 함께 37°C에서 3시간 동안 배양되었습니다. 그런 다음 0.04M HCl이 포함된 이소프로판올을 첨가하고 570nm의 테스트 파장을 사용하여 플레이트 판독기(Synergy 2-BioTek)에서 1시간 후 흡광도를 측정했습니다[32].
24웰 플레이트에 놓인 현미경 커버 유리에서 성장한 HBMEC 및 A-172 교모세포종 세포 모두에 대해 공초점 현미경 검사를 수행했습니다. MNP 유무에 관계없이 배양 후 PBS에 4% 파라포름알데히드를 첨가하여 세포를 고정하고 초기에 설명한 대로 면역세포화학을 처리했습니다[33]. 공초점 현미경 분석은 다이오드 레이저(405nm), 멀티라인 Ar 레이저(457, 488, 515nm), HeNe(G) 레이저( 543nm) 및 HeNe(R) 레이저(633nm). Oil immersion 대물렌즈(60xO PLAPO)를 사용하였으며, 스펙트럼 필터링 시스템을 통해 순차적 모드로 방출된 빛을 검출하였다. 검출기 이득은 일정한 값으로 고정되었고 모든 샘플에 대해 웰 영역 전체에 걸쳐 임의의 위치에서 이미지가 촬영되었습니다. 다음 획득 매개변수가 사용되었습니다. λ ex/em =405/425 − 475nm(청색 채널, DAPI에 의한 핵 염색); λ ex/em =488/500 − 530nm(녹색 채널, NBD에 의한 gH625@MNPs 라벨링); 및 λ ex/em =633/650 − 700 nm(빨간색 채널, PEG, FA@MNPs 라벨링 rhod). 형광의 정량적 분석은 ImageJ 소프트웨어(1.50i 버전, NIH)를 사용하여 수행되었습니다.
Fe3에서 gH625@MNP 및 PEG,FA@MNP를 준비하기 위해 구현된 전체 전략 O4 공침에 의해 얻은 나노입자는 그림 1과 같이 두 단계를 포함합니다. 두 부류의 나노입자에 대해 동일한 첫 번째 단계는 아미노 그룹(NH2 -아빠). 두 번째 단계에서 NH2 -PA 사전 기능화된 MNP(NH2 @MNPs)는 NHS 커플링 반응을 통해 특정 기능 분자와 추가로 접합됩니다. 특히 N - NBD로 표지된 gH625의 히드록시숙신이미드 활성화 형태는 gH625@MNP의 제조에 사용되었으며 N -히드록시숙신이미드 활성화된 형태의 PEG, FA 및 Rhod를 사용하여 PEG, FA@MNP를 얻었다. 공초점 레이저 스캐닝 현미경 연구를 수행하기 위해 gH625@MNP와 PEG,FA@MNP 모두 발광 프로브(각각 NBD 및 Rhod)로 라벨이 지정되었습니다.
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반응 계획. 기능화된 MNP의 제조를 위한 반응 단계
공침 단계 이후에 얻은 순수한 MNP의 XRD(X-ray diffractometric) 특성화는 이전 논문에서 보고된 것과 유사합니다[34, 35]. 간단히 말해, 전형적인 패턴(그림 2a)은 4개의 회절 피크(2θ =30.16°, 35.48°, 43.10° 및 57.04°) 이는 자철광, 마그헤마이트 또는 두 상 사이의 중간 조성의 존재와 일치합니다. 격자 상수, a , 이는 벌크 마그네타이트(8.396 Å)의 격자 매개변수와 잘 일치하는 것으로 밝혀진 8.389(4) Å 뿐만 아니라 Debye-Scherrer의 방정식을 적용하여 결정된 11.2의 평균 결정 크기는 이전 값과 비슷합니다. 보고[34, 35].
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MNP의 일반적인 XRD 및 XPS 스펙트럼. a) 베어 MNP 및 고해상도 Fe 2p3/2의 XRD 패턴 b) 베어 MNP 및 c) NH2의 XPS 스펙트럼 영역 @MNP
Fe3의 결정 구조가 O4 자철광은 γ-Fe2와 매우 유사합니다. O3 마그헤마이트, XRD로 두 단계를 구별하는 것은 매우 어렵습니다. 이러한 이유로 X선 광전자 분광법(XPS)을 사용하여 MNP를 추가로 분석했습니다. 그림 2b는 Fe 2p3/2를 보여줍니다. 베어 MNP의 고해상도 XPS 스펙트럼. 710.9eV에서 관찰된 밴드의 중심은 Fe 2p3/2에 해당합니다. 정점. 이 값은 Fe 3+ 에 대해 보고된 것보다 낮습니다. α-Fe2의 팔면체 구멍 중 하나 O3 (711.6 eV) [36, 37] 또는 γ-Fe2의 혼합 사면체 및 팔면체 구멍 O3 (711.4 eV)이며 Fe3에서 Fe의 혼합 산화 상태와 일치합니다. O4 [37, 38].
마지막으로 유사한 MNP의 자세한 자기 특성은 이전 논문[34, 35]에 보고되어 있습니다.
기능화 과정은 FT-IR 및 XPS에 의해 평가되었습니다. 포스폰 단일층으로 기능화한 후 Fe 2p3/2 밴드(그림 2c)에는 관련 수정 사항이 표시되지 않으므로 Fe3 O4 단계가 유지됩니다. 그러나 Fe 2p3/2의 약간의 이동(0.4 eV) 낮은 결합 에너지(B.E)를 향한 중심이 관찰되었으며, 이는 포스폰 단일층의 고정과 관련되었습니다. 사실, 다양한 산화철의 인산염 흡착에서 유사한 이동이 관찰되었으며[39] 흡착물에서 Fe 원자로의 일부 전하 이동에 기인할 수 있습니다. Fe 2p3/2 710.5eV의 위치는 PEG 및 FA 고정을 위한 모든 기능화 단계 후에도 유지되었습니다.
그림 3은 NH2의 P2p, N1s 및 C1s 스펙트럼 영역의 비교를 보고합니다. @MNPs, PEG, FA@MNPs 및 gH625@MNPs. NH2의 P2p 피크 위치(133.2 eV) @MNP는 일반적으로 두자리 방식으로 표면에 고정된 포스폰산의 존재와 관련이 있습니다[40,41,42,43]. gH625@MNPs 및 PEG,FA@MNPs의 스펙트럼에서 P2p 밴드 위치는 NH2에서 관찰된 것과 동일합니다. @MNPs 스펙트럼, 따라서 펩타이드와 엽산 고정화에 대한 커플링 반응 동안 포스폰 분자가 제거되지 않음을 보여줍니다.
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기능화된 MNP의 XPS 특성화. a) NH2의 고해상도 P 2p, C 1s 및 N 1s XPS 스펙트럼 영역 @MNPs, b) PEG,FA@MNPs 및 c) gH625@MNPs
NH2의 N1s 스펙트럼의 모양과 피크 위치 @MNP는 고정된 NH2의 존재와 일치합니다. -아빠. 밴드는 두 가지 별개의 구성요소로 구성됩니다. 399.9eV의 첫 번째 구성요소는 고정된 아미노프로필포스페이트의 -NH 그룹과 연관되고, 401.5eV의 중심에 있는 두 번째 구성요소는 Fe3의 표면과 상호작용하는 아미노 그룹으로 인한 것입니다. O4 -H 결합의 양성자화 또는 형성을 통해.
gH625 펩티드 또는 FA, PEG 및 Rhod의 고정 후 NH2의 양성자화된 아미노 부분과 관련된 401.8 eV의 구성요소와 비교하여 399.8 eV에서 N1s 구성요소가 증가합니다. @MNPs. 이 증가는 고정된 아미노프로필포스페이트와 접합된 분자(예:gh625, FA, PEG, Rhod) 사이의 아미드 결합(400.2eV)에 관여하는 N 원자와 gh625의 N 원자의 중첩 신호 때문입니다. 및 FA(399.1 및 400.6 eV에서).
NH2의 C 1s 밴드 @MNPs 스펙트럼은 이전에 보고된 바와 같이 지방족 탄소에 할당된 285.0eV의 단일 피크로 구성됩니다[40].
gH625@MNPs 및 PEG,FA@MNPs의 C1s 스펙트럼에서 288.3eV에서 C1s 성분의 존재는 gh625, FA 및 Rhod 분자의 카르복실기 및 아미드기 때문입니다.
NH2의 FT-IR 스펙트럼 @MNPs, gH625@MNPs 및 PEG,FA@MNPs는 그림 4에 보고되어 있습니다. 모든 샘플에서 스펙트럼은 1250cm − 1 에서 밴드를 표시하지 않습니다. P=O 및 900–1050cm − 1 의 날카로운 피크로 인해 P–O–H 스트레칭으로 인한 범위[44,45,46], 그러나 1040cm − 1 에서 넓고 강한 밴드 , 이는 PO3의 진동과 관련이 있습니다. 2− 철 표면에 결합된 그룹. XPS 결과에 따르면 이 밴드는 이전에 보고된 바와 같이 포스폰산이 탈양성자화되고 P-O-Fe 결합을 통해 표면에 고정됨을 나타냅니다[34, 40, 41]. 1500~1700cm − 1 사이의 IR 스펙트럼 영역 gH625 및 FA의 아미노 및 아미드 그룹에 속하는 밴드를 보여줍니다. 특히 NH2의 스펙트럼은 @MNPs는 약 1650cm − 1 에서 급격한 피크를 나타냅니다. NH2에 연결됨 굽힘[47]. PEG, Rhod 및 FA 고정 후, 1700–1500cm − 1 PEG,FA@MNPs의 영역은 미반응 NH2의 진동의 회선으로 인해 더 넓은 대역을 나타냅니다. , 아미드기, FA 및 Rhod의 벤젠 고리(1630–1600cm − 1 ) [35]. 유사하게, 펩타이드 고정 후 약 1650–1600cm − 1 의 광대역 반응하지 않은 NH2로 인한 여러 진동의 기여 때문일 수 있습니다. 및 펩타이드 측쇄의 아민 부분과 펩타이드 아미드 결합의 C=O 스트레치[48]. 또한 약 1540cm − 1 의 구성 요소 결합된 δ로 인해 펩타이드[48]의 (N–H)/ν(C–N) 진동도 존재합니다.
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기능화된 MNP의 FT-IR 특성화. 850–1900cm의 FT-IR 스펙트럼 영역 −1 a) NH2의 범위 @MNPs, b) gH625@MNPs, c) PEG,FA@MNPs
MNP에 대한 FA 고정은 PEG,FA@MNPs 콜로이드 용액의 UV/Vis 스펙트럼으로도 입증되었습니다. 그림 5는 NH2의 스펙트럼을 비교합니다. @MNPs 및 PEG,FA@MNPs 콜로이드 분산. 참고로 FA 용액(5μM)의 스펙트럼이 추가되었습니다. FA의 전형적인 274nm에서 명백한 밴드는 참조 및 PEG,FA@MNPs 콜로이드 용액 모두에서 명확하게 볼 수 있으므로 MNP에서 FA의 존재를 확인합니다. 고정 후 280nm에서 FA-NHS 흡수에서 274nm 값으로 약간의 이동은 자유 FA-NHS 및 나노입자 고정 FA에서 환경 변화로 인한 것일 수 있습니다. FA 표면 고정 또는 다른 분자와의 접합 후 280nm에서 흡수 밴드의 다양한 이동의 존재는 이미 문헌에서 관찰되었습니다[49,50,51].
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기능화된 MNP의 UV/Vis 특성화. 5μM FA-NHS 용액 및 NH2의 UV/Vis 스펙트럼 @MNPs 및 PEG,FA@MNPs 콜로이드 분산. NH2 스펙트럼에서 높은 배경이 관찰됨을 주목하십시오. @MNPs 및 PEG,FA@MNPs는 나노입자 콜로이드 분산의 산란으로 인한 것입니다.
평균 유체역학적 직경, 다분산 지수(PDI) 및 기능화된 MNP의 제타 전위는 제조된 MNP 분산액에 대해 pH 7.4의 PBS 완충액 중 DLS 및 72시간 숙성 후 결정되었습니다(표 1). NH2의 유체역학적 직경 -PA@MNPs, gH625@MNPs, PEG,FA@MNPs는 각각 73.0 ± 3.0 nm, 104.0 ± 4.0 nm, 51 ± 2 nm로 PDI 값은 입도 분포가 충분히 좁음을 나타낸다. 예상대로 gH625와의 접합은 나노입자의 크기를 증가시켰지만 PEG,FA@MNP의 크기 감소는 NH2보다 더 나은 분산으로 인한 것입니다. PEG 사슬의 존재와 관련된 @MNPs.
어쨌든 모든 시스템에서 매우 음의 제타 전위(<− 30mV)가 관찰되었습니다. 이러한 음의 제타 전위 값은 장기적인 안정성을 보장하고 광범위한 입자 응집을 방지합니다[52, 53]. 실제로, 음의 표면 전하는 코팅에 약간만 의존하지만 주로 Fe3의 음으로 하전된 코어의 조합에 기인합니다. O4 나노 입자 [54] 및 유사한 시스템에서 관찰된 포스폰산 기의 효과 [52, 34]. 따라서 MNP를 기능화하는 데 사용되는 다른 합성 전략과 비교하여 링커로 포스폰산 단일층을 사용하면 표면과 기능 그룹 사이에 안정적인 결합이 형성될 뿐만 아니라 매우 부정적인 제타 전위를 유도합니다. 72시간의 숙성 후 NH2의 크기와 제타 전위 -PA@MNPs, gH625@MNPs 및 PEG,FA@MNPs는 거의 동일하게 유지되어 모든 장식된 표면이 시간이 지남에 따라 안정적임을 시사합니다.
gH625@MNPs 및 FA,PEG@MNPs와 함께 인큐베이션된 HBMEC 및 A-172 세포의 생존력은 다양한 인큐베이션 시간과 다양한 농도의 나노입자(10 및 20μg/ml)의 존재 하에 MTT 분석을 사용하여 평가되었습니다. 그림 6에서 볼 수 있듯이 HBMEC 및 A-172 세포에 대한 장식된 시스템의 농도 및/또는 시간 의존적(24–48–72 h) 세포독성 효과는 관찰되지 않았습니다.
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세포 생존력. a의 세포 생존율 HBMEC 및 b A-172 세포를 gH625@MNPs 10μg/ml(검은색 막대), gH625@MNPs 20μg/ml(빨간색 막대), PEG, FA@MNPs 10μg/ml(파란색 막대)와 함께 24시간, 48시간 및 72시간 동안 배양 ) 및 PEG,FA@MNPs 20μg/ml(자홍색 막대)
gH625 펩타이드의 세포 투과 능력이 나노 입자 표면에 고정된 후에도 유지되는지 확인하고, gH625와 BBB를 가로지르는 FA 능력을 비교하기 위해, NBD로 표지된 gH625@MNPs의 인간 뇌 내피 세포 내로 내재화 및 Rhod-labeled PEG,FA@MNPs는 공초점 레이저 스캐닝 현미경으로 조사되었습니다.
배양 24시간 후, PEG-FA@MNPs의 흡수는 분명하지 않은 반면, gH625@MNPs 내재화는 명확하게 보입니다(그림 7). gH625와의 접합은 세포내 형광의 더 빠른 흡수와 거의 2배 더 높은 강도로 이어집니다(그림 8).
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HBMEC의 LSM 형광 현미경 사진. 24시간 동안 배양된 HBMEC의 LSM 형광 현미경 사진(b , f ) 및 72시간(d) , h ) NBD 라벨 gH625@MNPs 15μg/ml(b , d ) 및 해당 컨트롤(a , ㄷ ) 또는 rhod 라벨이 붙은 PEG,FA@MNPs 15μg/ml(f , h ) 및 해당 컨트롤(e , 지 ). 스케일 바 =20μm
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세포내 형광의 정규화된 강도. NBD 표지 gH625@MNP 및 Rhod 표지 FA,PEG@MNP를 사용한 24시간 및 72시간의 HBMEC 배양 후 세포내 형광의 정량적 분석
배양 시간(72시간)이 길수록 두 시스템의 내면화 차이가 줄어듭니다. 긴 배양 시간 동안 FA,PEG@MNPs의 비특이적 내재화 과정이 발생할 수 있고 우리의 결과는 기능화 및 기능화되지 않은 폴리스티렌 나노입자의 흡수에 대해 이전에 보고한 내용을 추가로 확인하기 때문에 이러한 동작은 예상치 못한 일이 아닙니다[55].
뇌종양 치료제로 gH625@MNP를 사용할 가능성을 추가로 조사하기 위해 A-172 교모세포종 세포주를 사용하여 gH625@MNP 및 FA,PEG@MNP의 세포 흡수를 조사했습니다. 교모세포종은 가장 흔한 원발성 뇌종양 중 하나이자 가장 치명적인 암 중 하나입니다.
24시간 배양 후 gH625@MNPs 및 FA,PEG@MNPs의 세포 흡수는 그림 9에서 볼 수 있듯이 비슷합니다.
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교모세포종 세포의 LSM 형광 현미경 사진. 교모세포종 세포의 LSM 형광 현미경 사진. 병합된 청록색 이미지:대조 세포(a ) 및 15μg/ml의 NBD 표지 gH625@MNP와 함께 배양된 세포(b ). 병합된 청-적색 이미지:대조 세포(c ) 및 15μg/ml rhod-labeled PEG,FA@MNPs(d)와 함께 배양된 세포 ). 스케일 바 =20μm
이러한 행동은 gH625가 더 자주 채택되는 FA 표적화 장치와 동일한 효율성으로 뇌종양을 표적화할 수 있음을 시사합니다.
Fe3 O4 nanoparticles have been functionalized with the gH625 viral cell penetrating peptide adopting a versatile route based on MNP prefunctionalization with a monolayer consisting of a bifunctional phosphonic linker, 3-aminopropylphosphonic acid. The cell internalization capabilities of this system have been evaluated by comparing them with those of a reference system based on MNPs functionalized with PEG, rhodamine, and folic acid, obtained adopting the same NH2 -PA-based platform. The uptake of the two differently decorated MNPs was assessed in primary microvascular endothelial cells from human brain, which are the main components of the BBB and simulate an in vitro model of the BBB. These surface modifications influence the internalization of MNPs in HBMEC and, therefore, their capability to cross the BBB. In fact, conjugation with the gH625 peptide upgraded the delivery of nanoparticles across the in vitro BBB, leading to significant higher cell uptake in HBMEC after 24 h compared with that of FA bearing MNPs (FA,PEG@MNPs). Note that also other strategies have been used to enhance nanoparticle uptake across the BBB. A common approach is to attach targeting ligands in order to activate receptor-mediated endocytosis. As examples, transferrin-coupling nanoparticles can penetrate into the BBB through a transferrin receptor-mediated process [56]. Analogously, the linkage of the apolipoprotein E to the nanoparticles enhances the BBB penetration [57]. Besides, nanoparticles having a surface charges modified with polyethylenimine (PEI) has been reported to cross the BBB by absorptive-mediated transcytosis [58]. Finally, the ability of MNPs to pass through human brain microvascular endothelial cells, used as an in vitro BBB model, can be also facilitated by an external magnet [59]. In our work, we studied a different approach which use a cell penetrating peptide, the gh625, to improve internalization capabilities of Fe3 O4 나노 입자. These results are in accordance with those previously obtained by D. Guarnieri et al. using different kinds of MNPs [55, 60] confirming that the gH625-decorated magnetic nanoparticle has a relevant role in crossing the BBB and could be used as a safe and effective drug delivery system.
Human glioblastoma cell line
Binding energy
Blood-brain barrier
Central nervous system
Cell-penetrating peptides
아니 ,N -Diisopropylethylamine
Dynamic light scattering
Dulbecco’s modified Eagle’s medium
4′,6-Diamidino-2-phenylindole
Dimethyl sulfoxide
Folic acid
Activated form of FA with NHS
Fetal bovine serum
9-Fluorenylmethoxycarbonyl
푸리에 변환 적외선 분광기
20-Residue peptide derived from the glycoprotein H (gH) of the Herpes simplex virus 1
NH2 @MNPs functionalized with gh625
Microvascular endothelial cells from human brain
Magnetic iron nanoparticles
3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H -tetrazolium bromide
4-Chloro-7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazole
MNPs modified with NH2 -PA
3-Aminopropylphosphonic acid
아니 -Hydroxysuccinimide
Phosphate-buffered saline
다분산 지수
폴리에틸렌 글리콜
NH2 @MNPs functionalized with FA, Rhod and PEG
Methoxypolyethylene glycol acetic acid N -succinimidyl ester
Polyethylenimine
Carboxy-X -rhodamine
Carboxy-X -rhodamine N -succinimidyl ester
Trifluoroacetic acid
X선 광전자 분광법
X-ray powder diffraction
나노물질
초록 폴리(락트산-코-글리콜산)(PLGA) 기반 나노의약품의 임상 번역은 부분적으로는 식세포에 의한 비특이적 식세포 작용으로 인한 낮은 전달 효율로 인해 제한적입니다. 암세포와 면역 세포 사이의 나노입자 상호작용을 이해하는 것은 여전히 어려운 일입니다. 이 연구에서는 단일 배양 또는 공동 배양 시스템에서 단핵구/대식세포가 있거나 없는 후두 암종 세포에 대한 형광 PLGA 입자(100 nm, 500 nm 및 1 µm)의 세포 내재화에 대한 정량적 조사가 먼저 수행되었습니다. 5~20µg/mL 농도의 PLGA 입자는 500nm 및
초록 파킨슨병(PD)은 중뇌에서 도파민성 뉴런의 점진적인 소실을 특징으로 하며, 줄기 세포 이식 방법은 치료를 위한 유망한 전략을 제공합니다. 이러한 연구에서 생체 내 이식된 세포의 생물학적 행동을 추적하는 것은 줄기 세포 기능에 대한 기본 이해와 임상 효과 평가에 필수적입니다. 본 연구에서 우리는 열분해 방법과 2단계 개질을 통해 폴리아크릴산(PAA)과 메톡시폴리에틸렌글리콜아민(PEG)으로 코팅된 새로운 초소형 초상자성 산화철 나노입자를 개발했습니다. USPIO-PAA/PEG NP는 TEM 및 FTIR에서 볼 수 있듯이 10.0
