부팔린 로딩 PEG화 리포솜:항종양 효능, 급성 독성 및 조직 분포

결과 및 토론

BF/PEG-LP의 물리적 및 화학적 특성

투과전자현미경(TEM)은 추가 파일 1:그림 S1A에 표시된 것처럼 BF/PEG-LP가 균일한 구형 모양을 가짐을 보여주었습니다. BF/PEG-LP의 구조는 FT-IR로 확인하였다. 추가 파일 1:그림 S1B에서 볼 수 있듯이 특성은 3495 cm ⁻¹ 에서 피크입니다. 및 3436 cm ⁻¹ 아미드 결합의 NH 신축 진동을 나타내는 반면, 1079 cm ⁻¹ 에서 피크 BF/PEG-LP에서 에테르 결합의 CO-C 신축 진동을 나타냅니다. 시험관 내 제형의 안전성을 평가하기 위해, 블랭크 리포솜, BF 및 BF/PEG-LP의 용혈률을 RBC 용혈 시험으로 측정하고, 블랭크 리포솜을 처리한 HepG2 및 HCT116 세포의 세포 생존율을 CCK로 측정하였다. -8 분석. BF 그룹은 명백한 용혈을 나타냈습니다. 그러나 BF/PEG-LP 그룹의 용혈률은 동일한 농도에서 유의하게 낮았습니다(P <0.01). BF/PEG-LP의 농도를 200 μg/mL로 증가시켰을 때, 용혈률은 블랭크 리포좀보다 분명히 더 높았다(P <0.01, 그림 1a). CCK-8 분석 결과 빈 리포솜이 HepG2 및 HCT116 세포에 무독성인 것으로 나타났습니다(그림 1b).

BF/PEG-LP의 물리화학적 특성. 아 빈 리포솜, BF 및 BF/PEG-LP의 적혈구 용혈률. 데이터는 \( \overline{x} \)± s (n =3). **피 <0.01 대 . 동일한 농도의 BF/PEG-LP 그룹. ㄴ HepG2 및 HCT116 세포에서 빈 리포솜의 세포독성. 데이터는 \( \overline{x} \) ± s (n =6). ㄷ 다양한 pH 조건에서 BF/PEG-LP의 안정성. 데이터는 \( \overline{x} \) ± s (n =6). **피 <0.01 대 . 같은 시점에서 pH 7.4 그룹. 약어:BF, 부팔린; BF/PEG-LP, 부팔린 로딩 PEG화 리포솜

BF/PEG-LP의 안정성에 대한 환경 pH의 영향을 UV 분광광도법으로 평가했습니다. 그림 1c는 pH 5.0 그룹의 샘플의 흡광도가 보관 시간에 따라 증가함을 보여줍니다. 이는 BF/PEG-LP가 pH 7.4의 PBS에서 더 안정적임을 나타냅니다(P <0.01).

체외 종양 세포 사멸

BF/PEG-LP에 의해 유도된 HepG2, HCT116, A549 및 U251 세포의 세포자멸사는 CCK-8 분석에 의해 결정되었습니다. IC₅₀ 시험된 모든 세포에 대한 BF/PEG-LP 값은 표 1에 나와 있습니다. BF/PEG-LP는 용량 의존 방식으로 모든 세포 유형의 생존율을 유의하게 감소시켰습니다(그림 2). BF/PEG-LP의 억제 효과는 40 ng/mL를 초과하는 농도에서 DOX(양성 대조군, 50 μg/mL)의 억제 효과와 유사했습니다. 또한 IC₅₀ 기반 값, BF/PEG-LP에 대한 세포의 민감도는 HCT116> HepG2> U251> A549와 같이 순위가 매겨졌습니다.

HepG2에서 BF/PEG-LP의 세포독성(a ), HCT116(b ), A549(c ) 및 U251(d ) 세포. 데이터는 \( \overline{x} \) ± s (n =6). *P <0.05, **P <0.01 대 . 각 세포주에 대한 대조군. 약어:BF/PEG-LP, 부팔린 로딩 PEG화 리포솜; DOX, 독소루비신

일반 약리학적 평가

BF/PEG-LP 투여 후 마우스의 일반적인 행동은 빈 그룹의 행동과 달랐습니다. 특히, 고용량 BF/PEG-LP 그룹의 마우스는 떨림과 타액 분비를 나타냈다. 투여 후, 마우스를 10분 동안 오픈 필드 박스에 남겨두고 활성 그리드의 수를 기록하였다. 양성대조군(펜토바르비탈)에서 활성 그리드의 수는 342 ± 35개로 대조군(725 ± 127, P <0.05). 그림 3a에서 볼 수 있듯이 중용량 및 고용량 BF/PEG-LP 그룹의 활성 그리드 수는 대조군과 크게 달랐습니다. rod-climbing test는 BF/PEG-LP가 대조군과 비교하여 투여 1주일 후 마우스의 협응 운동에 일정한 촉진 효과가 있음을 보여주었다(P <0.01), 클로르프로마진은 양성 대조군에 유의한 촉진 효과가 있는 반면(P <0.05), 그림 3b와 같이

운동 활성에 대한 BF/PEG-LP의 약리학적 효과(a ) 및 조정된 운동(b ) 마우스에서. 데이터는 \( \overline{x} \) ± s (n =10). *P <0.05, * ^* 피 <0.01 대 . 각 시점의 대조군; ^# 피 <0.05 대 저용량 BF/PEG-LP 그룹. 약어:BF/PEG-LP, 부팔린 로딩 PEG화 리포솜

종양 이종이식 실험

장기간 투여하면 양성 대조군, BF 및 BF/PEG-LP 그룹의 마우스에서 정신 지체, 음식 섭취 감소, 느린 반응 및 둔한 모피가 나타났습니다. BF 및 BF/PEG-LP 그룹 모두에서 마우스 사망이 발생했습니다. 양성 대조군의 항종양율은 36.5%였다. 고용량 BF 그룹의 27.6%; 저용량, 중용량 및 고용량 BF/PEG-LP 그룹의 경우 각각 11.4%, 28.9% 및 38.7%였습니다. 저용량 BF 그룹을 ​​제외하고는 약물 치료 그룹과 음성 대조군의 항종양율 사이에 유의한 차이가 있었습니다(P <0.05), 그림 4a와 같이. 저용량 BF 그룹과 비교하여 고용량 BF/PEG-LP 그룹의 종양 억제율이 유의하게 더 높았습니다(P <0.01), 그림 4b와 같이

누드 마우스에서 신경교종 이종이식의 성장에 대한 BF 및 BF/PEG-LP의 억제 효과. 종양 무게 비교(a ) 및 종양 억제율(b ) 각 그룹에 있습니다. 데이터는 \( \overline{x} \) ± s (n =10). *P <0.05, **P <0.01 대 통제 그룹; ^# 피 <0.05, ^## 피 <0.01 대 . 고용량 BF/PEG-LP 그룹. ㄷ 종양 보유 마우스의 종양 조직의 H&E 염색. 약어:BF, 부팔린; BF/PEG-LP, 부팔린-로딩된 PEG화 리포솜; DPP, 시스플라틴; H&E, 헤마톡실린 및 에오신

종양이 있는 마우스의 이종이식편은 결절 모양이었습니다. H&E 염색은 대조군에서 종양 세포의 핵이 크고 세포질이 작으며 세포의 성장이 왕성한 것으로 나타났습니다. 고용량 BF/PEG-LP 그룹에서는 괴사 종양 조직의 넓은 영역이 관찰되었으며 괴사의 정도는 그림 4c와 같이 용량 의존적이었습니다.

급성 독성

단일 i.v.의 급성 독성 Kunming 마우스에서 제형의 용량이 결정되었습니다. LD₅₀ BF 및 BF/PEG-LP의 값은 각각 0.156 및 3.03 mg/kg이었습니다. BF와 비교하여 BF/PEG-LP의 급성 독성은 유의하게 낮았습니다(P <0.01); 이 효과는 혈액으로의 BF 방출을 제어하는 ​​리포솜 제형에 기인합니다.

i.v. 후 마우스의 병리학적 변화 광학현미경으로 투여를 관찰하였다(그림 5). 심장, 간, 신장과 같은 여러 기관에서 병리학적 변화가 관찰되었습니다. 출혈과 함께 심장 심근 섬유 용해 및 골절이 분명했습니다. 간세포와 폐내피세포에서 괴사가 관찰되었다.

1.0 mg/kg BF 및 4.0 mg/kg BF/PEG-LP의 정맥내 투여 후 죽은 마우스에서 관찰된 병리학적 변화. 조직 섹션을 H&E로 염색하고 광학 현미경으로 관찰했습니다. 참고:광학 현미경:NIKON Eclipse ci; 이미징 시스템:NIKON Digital Sight DS-FI2(도쿄, 일본); 배율:×200. 약어:BF, 부팔린; BF/PEG-LP, 부팔린-로딩된 PEG화 리포솜; H&E, 헤마톡실린 및 에오신

조직 분포 연구

추가 파일 1에 표시된 대로 BF 및 CBG(IS)의 머무름 시간에 상당한 간섭이 없음을 나타내는 빈 조직 균질액과 스파이크 균질액의 크로마토그램을 비교하여 분석법의 선택성을 분석했습니다. 그림 S2. 보정 곡선은 상관 계수 R를 사용하여 20 ~ 2000 ng/mL 범위의 조직 균질액 농도에 대한 BF 대 IS(Y)의 피크 면적 비율로 구성되었습니다. ² > 0.9977(표 2). 생물학적 시료에서 BF의 정밀도, 정확도 및 회수율 실험은 추가 파일 1:표 S1에 표시되었으며 안정성 실험 결과는 추가 파일 1:표 S2에 표시되었습니다.

조직 분포 실험의 원시 데이터는 추가 파일 1:표 S3에 나와 있습니다. i.v. 이후 BF/PEG-LP 주입 시 조직 분포는 조성, 입자 크기 및 제타 전위와 같은 여러 변수에 의해 영향을 받습니다[19]. 심장, 간, 비장, 폐, 신장 및 뇌를 포함한 다양한 조직에서 BF의 농도는 그림 6과 같이 5, 15, 45 및 90 min에서 정량화되었습니다. iv. 투여 시 심장, 간, 비장, 폐 및 신장과 같은 일부 조직에서 두 그룹 모두에서 BF의 농도가 매우 낮았으며, 이는 BF의 분포 및 제거가 빠르게 발생했음을 나타냅니다. 뇌의 BF 농도는 다른 조직은 아니지만 i.v 후 90분에서 여전히 감지될 수 있습니다. 두 그룹 모두에서 BF의 분포와 제거가 다른 조직보다 뇌에서 상대적으로 느리다는 것을 나타냅니다.

쥐 기관에서 BF의 조직 분포. A 부팔린의 분자식(a ) 및 시노부파긴(b , 이다). 나 0.5 mg/kg에서 BF/PEG-LP 또는 BF의 단일 정맥내 투여 후 쥐에서 BF의 조직 분포 프로필. 데이터는 \( \overline{x} \) ± s (n =6). 약어:BF, 부팔린; BF/PEG-LP, 부팔린-로딩된 PEG화 리포솜; IS, 내부 표준

한편, BF 그룹에 비해 BF/PEG-LP 그룹의 뇌 조직에서 1.20배 더 높은 BF(333 ± 92.5 ng/g at 5 min)가 검출되었습니다. 또한, BF/PEG-LP 그룹에서 간, 비장 및 뇌 조직에서 더 높은 농도의 BF가 발견되었습니다. 간에서 BF의 상당한 축적이 감지되었으며, 농도는 BF/PEG-LP 그룹에서 187 ± 31.0 ng/g, BF 그룹에서 163 ± 35.0 ng/g이었습니다(P <0.01). 대사 및 배설 전 혈액 내 BF의 급격한 증가에 의해 주로 발생하는 유사한 현상이 이전 연구에서 관찰되었습니다[20, 21].

조직 분포 실험의 결과에 따르면, BF 자체가 BBB를 횡단할 수 있는 것은 높은 지질 용해도, 낮은 분자량(386.52 g/mol) 및 콜레스테롤과 유사한 화학 구조로 인해 가능성이 있습니다. 동일한 모핵 구조를 공유합니다. 그러나 BF의 높은 지용성 및 낮은 수용성으로 인해 BF의 임상 적용은 제한적입니다. 대체 형태로 투여하지 않으면 BF의 생체이용률이 낮습니다. 이전 연구[6]에서 우리는 BF/PEG-LP 제형이 수용성을 개선하고, 혈액 순환 기간을 연장하고, 반감기를 연장하고, i.v.를 포함하여 BF의 적용 범위를 확장할 수 있음을 보여주었습니다. 화학 요법. 현재 연구에서 BF/PEG-LP 투여는 뇌에서 BF 농도를 증가시켰고, 이는 더 긴 기간(90분) 동안 지속되었습니다. 더욱이, 45분에서 BF와 BF/PEG-LP 그룹 사이에 BF 농도에 상당한 차이가 있었습니다(167.59 ± 54.52 vs. 71.52 ± 48.35 ng/g, P <0.01).

이전 연구에서 BF는 심장에 디지털과 같은 효과를 발휘하여 쥐의 심장 박동수와 심근 수축력을 증가시키는 것으로 나타났습니다[22]. 따라서 고용량에서 BF의 심장 독성은 심장에 축적되어 발생할 수 있습니다. 이 연구의 생체 분포 실험은 심장 내 BF 축적이 BF 그룹보다 BF/PEG-LP 그룹에서 더 낮음을 보여주었습니다(95.0 ± 18.5 vs . 134 ± 17.8 ng/g at 5 min, P <0.01; 15.32 ± 5.56 vs. 63.79 ± 28.21 ng/g at 15 min, P <0.01). Whether cardiac toxicity can be attenuated with a lower dose of BF requires further verification. Nevertheless, the antitumor effect of BF was sufficiently strong in this study (the IC₅₀ values for glioma cells were nanomolar). For in vivo application, it is critical to decrease the toxicity (especially heart toxicity) and increase the water solubility of BF, which was our focus in this study.

In general, PEGylated liposomes are considered to have no or low immunogenicity. However, according to recent studies, when PEGylated liposomes were repeatedly injected into the same animal, an immune response was triggered [23]. In fact, a second injection of PEGylated liposomes resulted in reduced blood circulation time and increased hepatic and splenic accumulation, which is known as the accelerated blood clearance (ABC) phenomenon. Such immunogenicity of PEGylated liposomes presents major challenges in the research of liposomal formulations and their clinical application. However, liposomal formulations that do not display the ABC phenomenon have been reported, such as a long-circulating DOX-loaded liposomal formulation (Doxil, Sequus pharmaceuticals, Inc., San Francisco, CA, USA), which has been commercialized. DOX was released from the liposomes and entered the spleen, damaging spleen cells and thereby reducing the production of anti-PEG IgM, which could selectively bind with PEG on the surface of the liposomes administered at the second injection. Whether BF/PEG-LP exhibits the ABC phenomenon remains unknown and requires further study. If so, mitigating the ABC phenomenon will require in-depth investigation.