시스플라틴-테트라드린 조합의 항종양 효능 향상을 위한 플랫폼으로서의 생체적합성 나노입자

초록

병용 요법은 임상 종양 치료의 표준 전략이었습니다. 우리는 Tetradrine(Tet)과 Cisplatin(CDDP)의 조합이 현저한 상승적인 항암 활성을 나타내지만 피할 수 없는 부작용이 치료 농도를 제한한다는 것을 입증했습니다. 두 약물의 서로 다른 물리화학적 및 약동학적 특성을 고려하여 개선된 이중 에멀젼 방법을 통해 두 약물을 함께 나노 차량에 탑재했습니다. 나노입자(NP)는 폴리(에틸렌글리콜)-폴리카프로락톤(PEG-PCL)과 폴리카프로락톤(HO-PCL)의 혼합물로부터 제조되어 CDDP와 Tet가 동시에 나노입자에 위치할 수 있어 간섭 효과가 낮고 안정성이 높습니다. . 형광 현미경의 이미지는 NP에 의해 전달되는 친수성 및 소수성 제제의 세포 흡수를 보여주었습니다. 다양한 종양 세포주와 종양 조직에 대한 시험관 내 연구에서 종양 억제 및 세포자멸사 비율이 증가한 것으로 나타났습니다. 생체 내 연구에서 나노입자군에서 우수한 항종양 효능과 부작용 감소가 관찰되었습니다. 또한 ¹⁸ FDG-PET/CT 영상화는 나노입자가 종양의 대사 활성을 더 현저하게 감소시키는 것을 보여주었다. 우리의 결과는 PEG-PCL 블록 공중합 NP가 확실한 효능과 경미한 부작용을 가진 복합 화학 요법에 대한 유망한 운반체가 될 수 있음을 시사합니다.

소개

종양종합치료제의 발달로 백금화합물은 다양한 암의 치료에 중요한 역할을 하고 있으며, 그 중 시스플라틴(CDDP)이 임상에서 널리 사용되고 있다[1, 2]. 오늘날 CDDP는 종양 면역 요법과 결합할 때 여전히 중요하여 비소세포폐암(NSCLC)과 같은 악성 종양에 유리한 효과를 보여줍니다[3]. 그러나 이러한 화학요법제는 항상 바람직하지 않은 독성을 희생시키면서 항종양 활성을 나타내므로[4], 독성을 감소시키고 화학요법의 효능을 향상시킬 수 있는 치료제가 끊임없이 연구되어 왔다[5, 6]. Tetrandrine(Tet)은 bis-benzylisoquinoline alkaloid[7]의 일원으로 화학요법에 대한 감작에 만족스러운 효과를 보인다. 우리의 이전 연구는 Tet와 CDDP의 조합이 절제 복구 교차 보완 그룹 1(ERCC1), Thymidylate Synthase(TS), β- 튜불린 III 등 [8]. 그러나 Tet의 임상 적용은 낮은 수용성과 낮은 경구 생체이용률로 인해 어려움을 겪고 있습니다[7]. 더욱이 친수성 CDDP는 세포외기질(ECM)에서 가장 쉽게 분포하는 반면, 소수성 Tet는 지질막을 관통하여 세포를 통해 운반될 수 있으므로 두 약물이 실제로 함께 작용할 수 없습니다. 따라서 두 가지 약물을 동시에 효과적으로 전달할 수 있는 방법을 찾는 것이 중요하며, 부작용을 줄이면서 항종양 효과를 향상시킬 수 있습니다.

나노기술 분야의 최근 발전은 암의 진단 및 치료를 위한 새로운 접근법을 관리합니다[9, 10]. 양친매성 공중합체, 특히 폴리에틸렌 글리콜(PEG)로 구성된 나노입자(NP)는 혈청 단백질의 부착을 감소시키고 세망내피계(RES)에 의한 흡수를 방지하는 능력으로 알려져 있습니다[11]. 소수성 약물을 운반하는 데 사용되는 경우 나노운반체는 재치 있게 용해도를 증가시키고 혈액 순환 및 종양에서 약물 잔류성을 증가시킬 뿐만 아니라 연장합니다[12]. 공중 합체 NP의 임상 사용으로 NP의 생체 적합성이 점점 더 주목을 받고 있습니다. 예를 들어, 최근 연구 결과에 따르면 일부 주입된 이산화티타늄, 실리카 및 금 나노입자가 동물 모델에서 암세포의 혈관 내 침투 및 유출을 촉진한다는 것이 밝혀졌습니다[13]. 생체 적합성과 안전성이 우수한 나노물질로 제조된 나노입자, 특히 FDA 승인을 받은 나노입자는 약물 운반체로 더 나은 후보입니다.

사전에 우리는 생체 내 항종양 효과가 둘 다 입증된 폴리에틸렌 글리콜-폴리(카프로락톤)(PCL-PEG)[16]을 사용하여 CDDP가 탑재된 NP[14, 15]와 Tet가 탑재된 NP를 구성하는 데 성공했습니다. 이 연구에서 우리는 CDDP와 Tet의 공동 전달을 위해 PEG-PCL을 사용했습니다. 중성에 가까운 전하로 PEG는 나노입자의 친수성 껍질을 형성하여 항원성 에피토프를 숨기고 면역 반응을 방지합니다[14]. 형광 현미경의 이미지는 세포가 NP에 의해 전달되는 친수성 및 소수성 제제를 모두 흡수할 수 있음을 보여주었습니다. 다양한 종양 세포주뿐만 아니라 종양 조직에 대한 시험관 내 연구 결과, CDDP-Tet NP가 자유 약물보다 종양 성장을 더 효과적으로 억제한다는 것이 밝혀졌습니다. 생체 내 연구에서 NP 그룹에서 항종양 효능이 증가하고 부작용이 감소하는 것으로 관찰되었습니다. 또한 ¹⁸ FDG-PET/CT 영상은 NP 그룹에서 종양의 가장 낮은 대사율을 보여주었으며, 따라서 CDDP-Tet NP가 종양 성장을 지연시키는 능력을 나타냅니다.

방법

자료

시약 및 세포

CDDP(분자식 PtCl₂ (NH₃ )₂ )는 Shandong Boyuan Pharmaceutical Co. Ltd.(중국 제남)에서 구입했습니다[15]. 테트라드린(분자식 C₃₈ H₄₂ N₂ O₆ )는 Jiangxi Yibo Pharmaceutical Development Company(Jiangxi, China)에서 순도> 98%의 분말로 입수했습니다[16]. 메톡시폴리에틸렌글리콜[MePEG; 중량평균분자량(Mw =4 kDa; Nanjing Well Chemical Co. Ltd. China]을 톨루엔과 공비증류하여 탈수한 다음 사용하기 전에 50°C에서 12시간 동안 진공 건조했습니다. , USA)를 CaH₂로 건조하여 정제했습니다. 상온에서 감압증류하였다. 폴리비닐알코올(PVA; 중합도 =500, 알코올화도 =88%; Shanghai Dongcang International Trading Co. Ltd., China) 및 제1주석 옥토에이트(분자식 SnCl2)(Sigma)를 받은 그대로 사용했습니다. RPMI 1640 배지(Gibco, USA), 송아지 혈청(Lanzhou Minhai Bioengineering, China) 및 디메틸티아졸리-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드(MTT; Amersco, USA)를 받은 그대로 사용했습니다.

인간의 잘 분화된 위암 세포주 MKN₂₈ , 인간 결장직장 선암종 세포주 LoVo, 인간 자궁경부암 세포주 Hela 및 쥐 간암 세포주 H₂₂ Shanghai Institute of Cell Biology(중국 상하이)에서 입수했습니다. 모든 세포주는 10% 소 혈청, 페니실린(100U/mL)-스트렙토마이신(100g/mL), 피루베이트, 글루타민 및 인슐린이 보충된 RPMI 1640 배지에서 37°C의 수분 포화 분위기에서 증식되었습니다. 5% CO₂ .

공중합체 합성

우리가 이전에 [16, 17] 설명한 바와 같이 mPEG-PCL 및 HO-PCL 공중합체는 개환 공중합에 의해 합성되었습니다. 간단히 말해서, 미리 결정된 양의 ε-CL을 PEG와 소량의 제1주석 옥토에이트(0.1% wt/wt)를 함유하는 중합 튜브에 첨가하였다. 그런 다음 튜브를 진공 시스템에 연결하고 밀봉한 다음 130°C의 오일 배스에 48시간 동안 두었습니다. HO-PCL 공중합체의 합성을 위해 건조 없이 중합 튜브에 일정량의 ε-CL과 stannous octoate를 첨가하였다. 중합이 완료된 후 조 공중합체를 클로로포름으로 녹이고 과량의 찬 메탄올에 침전시켜 미반응 단량체와 올리고머를 제거하였다. 그런 다음 침전물을 여과하고 물로 여러 번 세척한 후 감압에서 완전히 건조했습니다.

CDDP-Tet-로딩된 나노입자의 준비

미리 결정된 양의 CDDP와 Tet가 로딩된 나노입자는 이중 에멀젼(DE) 방법으로 제조되었습니다[14, 18]. CDDP 및 Tet는 5mg의 mPEG-PCL과 15mg의 HO-PCL을 포함하는 1mL의 디클로로메탄(DCM) 용액으로 15초(15W) 동안 얼음 수조(용액 W1)에서 초음파 처리하여 유화되었습니다. 그런 다음, 4mL의 3%(w/v) PVA 용액 W2를 추가하고 30초 동안 초음파 처리하여 W1/O/W2 에멀젼을 만듭니다. 이중 에멀젼을 50mL의 0.3%(w/v) PVA 수용액으로 희석하고 DCM을 진공 하에 증발시켰다. 얻어진 나노입자를 채취하여 세척하고 동결건조하였다(Fig. 1).

<그림>

CDDP-Tet NP 준비 계획

약물 로딩 콘텐츠 및 캡슐화 효율성

약물 로딩 함량을 결정하기 위해 동결 건조된 CDDP-Tet-loaded NP 분말을 디메틸포름아미드(DMF)에 용해시키고 이 용액 30L에 2mmol/L HCL 30L를 혼합한 다음 2.94mL를 첨가했습니다. 0.2mmol/L SnCl₂ 2mmol/L HCL 용액. Shimadzu UV-1205 Spectrophotometer(Kyoto, Japan)를 사용하여 보정 곡선을 참조하여 403nm에서 흡광도를 1시간 후에 측정했습니다. 그런 다음 NP에 있는 약물의 총량을 계산할 수 있습니다. 약물 로딩 함량 및 캡슐화 효율은 각각 Eq. (1) 및 (2):

$${\text{Drug loading content}}\, (\% ) =\frac{{{\text{나노입자의 무게}}}}{{{\text{나노입자의 무게}}}} \times 100\,(\% )$$ (1) $${\text{Encapsulation efficiency }}\,(\% ) =\frac{{{\text{나노입자 내 약물의 무게}}}}{ {{\text{섭취 약의 무게}}}} \times 100\,(\% )$$ (2)

나노입자의 체외 세포독성 및 생체적합성 연구

세포 흡수 연구

우리의 이전 연구[15]를 기반으로 LoVo 세포는 약 5 × 10⁵ 의 6-포어 플레이트의 덮개에 배치되었습니다. 세포를 각 구멍에 넣고 24시간 동안 배양했습니다(37°C, 5% CO₂ ). 로다민 B(21μg/mL)가 포함된 NP를 모공에 추가했습니다. 2시간 동안 배양한 후 페이트를 4°C 및 37°C의 PBS로 각각 3~4회 세척했습니다. 그런 다음 표지에 있는 LoVo 세포를 형광 현미경으로 관찰했습니다.

세포독성 분석

약물의 시험관 내 세포독성은 MKN28 및 H₂₂를 사용하는 표준 MTT 분석에 의해 결정되었습니다. 세포주. 간단히 말해서, 세포를 분석 24시간 전에 웰당 5000개 세포의 밀도로 96웰 플레이트에 접종했습니다. 그런 다음 세포를 일련의 유리 CDDP, 유리 Tet, 유리 CDDP + Tet 및 CDDP-Tet-로딩된 나노입자에 노출시켰다. 인큐베이션 후 20μL의 5mg/mL MTT 용액을 각 웰에 첨가하고 플레이트를 4시간 동안 인큐베이션하여 생존 세포가 노란색 MTT를 진한 파란색 포르마잔 결정으로 변환하도록 하여 디메틸 200μL에 용해했습니다. 설폭사이드(DMSO). 각 웰의 광학 밀도(OD)는 각각 490 및 630 nm의 테스트 및 참조 파장을 사용하여 ELISA 판독기(ELX800 Biotek, USA)로 측정되었습니다. 세포 생존율은 다음 공식에 의해 결정되었습니다.

$${\text{세포 생존율}}\,(\% ) =\frac{{{\text{OD(테스트 웰)}}}}{{{\text{OD(참조 웰)}}}} \ 곱하기 100\,(\% )$$ (3)

블랭크 나노입자의 시험관 내 적합성은 MKN₂₈을 사용하는 MTT 분석에 의해 결정되었습니다. 및 H₂₂ 세포주. MTT 분석에서 얻은 모든 결과는 최소 3번의 독립적인 경우에 실험을 반복하고 매번 3번의 테스트를 통해 확인되었습니다.

아폽토시스 분석

Annexin V-FITC Kit(Bender MedSystem, USA)를 사용하여 세포 사멸 비율의 변화를 조사했습니다. MKN₂₈ 세포를 6cm 배양 접시에 24시간 동안 두었습니다. 배양 배지는 각각 1μg/mL 유리 CDDP, 1μg/mL CDDP 로딩 NP 및 200μg/mL 빈 NP로 교체되었습니다. 대조군은 약물이 없는 배양액으로 대체하였다. 48시간 배양 후 효소를 추가했습니다. 그런 다음 세포를 수집하고 PBS로 2회 세척하고 100μL 완충액에 재현탁했습니다. Annexin V 5μL과 PI 1μL을 차례로 첨가하고 혼합하고 빛에 노출되지 않고 실온에서 15분 동안 방치했습니다. 400mL 버퍼를 추가하고 세포 사멸률 분석을 위해 FCM(BD FACS CantoTM, USA) 과정을 거쳤습니다.

조직 배양 약물 반응 분석(HDRA)

HDRA는 우리의 이전 연구[14, 19]에 따라 수행되었습니다. 간단히 말해서, 수컷 ICR 마우스는 4–6 × 10⁶ 의 양 겨드랑이 공간에 피하 주사되었습니다. H₂₂ 식염수에 있는 세포. 종양이 400–600 mm에 도달했을 때³ 체적으로, 마우스는 경추 탈구로 희생되었고, 신선한 표본을 샘플링하고, 식염수로 두 번 세척하고, 행크 용액에 담그고, 무게가 약 15mg인 조각으로 나눴습니다. 조직 샘플을 1cm 크기의 정사각형 젤라틴 스펀지가 유리 CDDP 또는 CDDP-를 함유하는 20% 소태아 혈청 및 아미카신 설페이트(100IU/mL)가 보충된 RPMI 1640 배지에 담근 24웰 플레이트에 넣었습니다. 두 가지 다른 농도에서 로드된 NP. 4개의 종양 표본을 대조군으로 약물 없이 인큐베이션했습니다. 그런 다음 조직을 37°C 5% CO₂에서 7일 동안 배양했습니다. . 유형 I 콜라게나제(100L, 0.6mg/mL) 및 MTT(100L, 5mg/mL)의 100mg/mL 숙신산나트륨 혼합 용액을 첨가했습니다. 24시간 더 배양한 후 MTT formazan을 1mL DMSO로 추출하고 각 웰의 용액 100L를 96웰 마이크로플레이트의 웰로 옮겼습니다. 마이크로플레이트에 있는 각 웰의 OD는 테스트 및 참조 파장이 각각 490 및 630nm인 ELISA 판독기를 사용하여 측정되었습니다. 조직의 생존력은 다음 공식 (4)에 따라 계산되었습니다.

$${\text{조직 생존율}}\,(\% ) =\frac{{{\text{OD(테스트)}}/{\text{무게(테스트)/mg}}}}{{{\ text{OD(대조군)}}/{\text{무게(대조군)/mg}}}} \times 100\,(\% )$$ (4)

체내 항종양 효능

종양 부피 측정

체중이 18~20g인 수컷 ICR 마우스에 쥐 간암 세포주 H₂₂를 이식했습니다. CDDP-Tet-loaded NPs의 상대적 효능을 검증하는 데 사용됩니다. 특정 무병원체(SPF) 환경에서 사육된 마우스는 Drum Tower Hospital의 동물 관리 위원회에서 승인한 지침에 따라 수행되었습니다. 4–6 × 10⁶ 을 포함하는 세포 현탁액 0.2mL H₂₂ 세포를 마우스의 왼쪽 겨드랑이 공간에 피하 주사하였다. 마우스를 6개 그룹으로 나누었습니다:대조군(식염수), 빈 NP 그룹, 유리 CDDP(3 mg/kg) 그룹, 유리 CDDP + Tet(CDDP 3 mg/kg + Tet 7.2 mg/kg) 그룹 및 CDDP- Tet 부하 NP(CDDP 3mg/kg + Tet 7.2mg/kg) 그룹. 각 그룹은 6마리의 마우스로 구성되었습니다. 이식 후 7~8일 후에 치료를 시작했으며 그 날을 '0일'로 지정했습니다. 보고된 mg/kg 투여량을 달성하기 위해 투여량을 조정할 수 있도록 처리 시 각 동물의 무게를 쟀다. 실험 내내 동물의 체중도 격일로 쟀습니다.

면역형광 분석

대조군 마우스의 종양 조직과 유리 CDDP + Tet 및 CDDP-Tet NP를 받은 종양 조직은 처리 후 21일째에 조직학 관찰을 위해 선택되었습니다. 종양을 절개하고 10% 중성 완충 포르말린에 고정하고 일상적으로 파라핀으로 가공하고 5mm 두께로 절편했습니다. 샘플을 (40,6-diamidino-2-phenylindole)(DAPI, 파란색) 및 말단 deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling(TUNEL, 녹색)으로 염색한 후 Zeiss LSM510 Meta 공초점 현미경으로 조직 절편을 관찰했습니다. [20] .

¹⁸ FDG-PET/CT 이미징

유리 CDDP + Tet 그룹 및 CDDP-Tet-loaded NP 그룹의 마우스는 처리 후 6일째에 PET/CT 영상을 받았습니다. 추적자 주입 전에 4시간의 금식을 수행했습니다. ¹⁸ 중 14.8MBq(400lCi) F-FDG는 방사성 추적자로서 꼬리 정맥을 통해 주입되었습니다. 이미지는 결합된 PET/CT 스캐너(Jemini JXL, Philips, USA)로 생성되었습니다. ¹⁸ 투여 45분 후 마우스로 고해상도 PET 이미지 및 동일한 CT 시야 획득 F-FDG. PET 이미지는 CT 데이터를 기반으로 감쇠 및 산란에 대해 보정되었습니다. 이미지 융합은 벤더 제공 소프트웨어를 사용하여 자동 이미지 융합 시스템에 의해 수행되었습니다. 종양에서 최대 FDG 흡수 값은 표준 흡수 값(SUV) 계산을 위해 얻어졌으며 체중과 주사된 활성에 대한 보정을 적용했습니다.

통계 방법

데이터의 통계적 분석은 학생의 t 테스트. 데이터는 평균 ± SD로 나열되며 값은 P <0.05는 통계적으로 유의한 차이로 인정되었습니다.

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결과

공중합체 합성 및 특성화

우리의 이전 연구에 따르면 PEG-PCL 및 HO-PCL을 사용하여 NP를 합성했습니다(최적 비율은 1:3임) [14]. 최적의 PEG-PCL 공중 합체 NP의 직경, 다분산도, 수 평균 분자량(Mn) 및 중량 평균 분자량(Mw)은 추가 파일 1:표 S1에 나와 있습니다. CDDP 및 Tet가 로드된 경우 약물 로드 함량 및 캡슐화 효율도 측정되었으며(추가 파일 1:표 S2), 이는 CDDP가 로드된 PEG-PCL 공중합 NP의 것과 유사합니다. 그러나 Tet의 약물 로딩 함량과 로딩 효율은 HO-PCL 성분과 관련이 있을 수 있는 Tet 로딩된 PEG-PCL 공중합 NP보다 낮습니다.

동적 광산란(DLS)을 통해 CDDP-Tet-loaded PEG-PCL 공중합 NP의 직경은 359.1 ± 5.3 nm였으며 다분산도는 약 0.231이었습니다. TEM 및 AFM(추가 파일 1:그림 S1a 및 S1b)으로 관찰할 때 NP는 DLS의 데이터와 일치하는 규칙적인 구형 및 유사한 크기를 나타냅니다. 또한, 나노 입자에 작은 방울이 분산되어 있어 나노 입자가 실제로 이중 에멀젼 구조임을 확인시켜줍니다.

CDDP-Tet-Loaded NP의 세포 흡수

형광 염료가 로딩된 입자는 시각적 및 실시간 감지를 실현하는 세포 흡수를 탐색하는 일반적인 방법으로 적용되었습니다. 우리는 염료가 로드된 NP가 세포내이입을 통해 세포에 들어갈 수 있음을 입증했습니다. 이 연구에서 로다민-B는 친수성이며 CDDP를 시뮬레이션하는 데 사용되는 PI 형광 채널에서 검출될 수 있습니다. Tet의 시뮬레이션으로 coumarin-6은 소수성이며 FITC 형광 채널에서 신호를 수신할 수 있습니다. 2시간 동안 쿠마린-6 및 로다민-B가 로딩된 NP와 공동 인큐베이션한 후 LoVo 세포는 형광 현미경 및 광학 렌즈(200 ×)를 통해 검출되었습니다. 그림 2에서 볼 수 있듯이 형광 신호는 PI 형광 채널, FITC 형광 채널 및 PI/FITC 이중 형광 채널에서 감지할 수 있습니다. 결과는 NP가 coumarin-6과 rhodamine-B를 동시에 종양 세포로 운반할 수 있음을 확인했으며, 이를 기반으로 CDDP와 Tet가 NP에 로드되고 종양 세포에 동시에 흡수될 수 있음을 추론할 수 있습니다.

<그림>

로다민 B 및 쿠마린-6(200 × , 막대:50 um)이 로딩된 NP로 염색 2시간 후 LoVo 세포의 사진. 아 광학현미경하에서 세포 형태, b 형광현미경하에서 세포 형태(PI 형광 채널), c 형광 현미경(FITC 형광 채널) 하에서 세포 형태, 및 d 형광현미경하의 세포형태(PI/FITC 이중형광채널)

나노입자의 시험관 세포독성

유리 CDDP, 유리 Tet, 유리 CDDP + Tet 및 CDDP-Tet-로딩된 NP의 세포독성을 위 세포주 MKN28에서 비교하였다. Tet의 농도는 CDDP의 농도의 2.4배였다. 도 3에 나타난 바와 같이 CDDP-Tet-loaded NP의 세포독성은 4개 그룹 중에서 가장 강력하였다. 유리 Tet와 NPs 그룹과 3개의 다른 자유 약물 그룹 사이의 세포 독성 차이는 농도가 증가함에 따라 두드러졌습니다. 인간 자궁경부암 세포 Hela와 간세포암 세포 H₂₂에서도 유사한 결과가 관찰되었습니다. (추가 파일 1:그림 S2a, S2b).

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나노입자의 시험관내 세포독성. 아 48시간 동안 약물과 공동 배양한 후 MKN28의 세포 생존율. Tet의 농도는 CDDP의 농도의 2.4배였다. ㄴ 48시간 동안 약물과 공동 배양한 후 광학 현미경(200 ×) 하에서 MKN28 세포의 사진

빈 NP의 독성 연구는 이전 작업에서 수행되었습니다. 이전 연구에서 NP의 공백은 종양 세포주에 대한 독성이 거의 없었으며 이는 공백 NP가 만족스러운 생체 적합성을 나타냄을 나타냅니다[14, 16].

CDDP-Tet-Loaded NP의 체외 세포자멸사 분석

우리는 1μg/mL 유리 CDDP, 2.4μg/mL 유리 Tet, 유리 CDDP와 Tet(1μg/mL + 2.4μg/mL), CDDP-Tet-로딩된 NP(1μg/mL + 2.4μg)의 영향을 측정했습니다. /mL) 48시간 동안 공동 배양한 후 MKN28 세포의 세포자멸사 비율. 세포 사멸률은 Q2 + Q4로 계산되었습니다(그림 4 참조). 세포 사멸 속도의 변경은 유리 CDDP + Tet, 유리 CDDP 및 유리 Tet 그룹 간에 유사했습니다(그림 4a-c). 그러나 CDDP-Tet-loaded NP에 의해 유도된 MKN28 세포의 세포자멸사 비율은 다른 3개 그룹보다 유의하게 높았다(그림 4d).

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유세포 분석에 의한 시험관 내 세포자멸사 분석 a 무료 CDDP, b 무료 Tet, c 무료 CDDP + Tet 및 d CDDP-Tet NPs

조직 배양 약물 반응 분석(HDRA)

NP의 항종양 효과를 보다 종합적으로 평가하기 위해 H₂₂에서 유리 CDDP, 유리 CDDP + Tet 및 CDDP-Tet-로딩된 NP의 항종양 효과를 평가했습니다. HDRA를 사용하는 세포주. 화학감수성을 예측하기 위한 임상적 방법으로서 HDRA는 세포학적 실험[19]보다 더 확실하게 종양 조직의 실제 조건을 모사하는데, 그 결과는 약물의 침투, 세포외 pH 값, 간질과 같은 종양 조직의 미세 환경 및 미세 구조에 의해 영향을 받을 수 있습니다. 유체 압력 등

Tet의 농도는 CDDP 농도의 2.4배입니다. 그림 5에서 보는 바와 같이 가장 낮은 농도에서 유리 CDDP와 Tet 그룹의 항종양 효과는 CDDP보다 더 좋았으나 약물 농도 증가와 유사한 효과를 보였다. 세포 사멸 분석에 따르면 CDDP-Tet-loaded NP는 모든 테스트 농도에서 세 그룹 사이에서 상당히 더 나은 항종양 효과를 보였습니다.

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조직배양 약물 반응 분석

체내 항종양 효능 분석

효능 및 부작용 평가

H₂₂에 의해 형성된 쥐 모델 세포주 생착은 3mg/kg의 유리 CDDP, Tet(CDDP 3mg/kg + Tet 7.2mg/kg), CDDP-Tet-로딩된 NP(CDDP 3mg/kg + Tet 7.2mg/)와 함께 유리 CDDP로 처리되었습니다. kg), 각각. 약물 치료 12일 후에 종양이 얻어졌습니다. 약물 전달의 최적 함량을 결정하기 위해 종양 크기를 2일마다 감지했습니다. 종양 성장 곡선(그림 6)에서 볼 수 있듯이 대조군과 블랭크 나노입자 그룹의 종양 성장 경향은 유사했지만 약물 전달이 있는 다른 3개 그룹에서 현저한 종양 억제가 존재했습니다. 무료 CDDP 그룹과 비교하여 무료 CDDP와 Tet 그룹은 처음 6일 동안 더 나은 항종양 효능을 나타냈습니다. 그러나 6일 후에는 두 그룹 간의 종양 억제율의 차이가 줄어들기 시작했고 10일 후에는 free CDDP와 Tet가 더 나쁜 항종양 효과를 보였습니다.

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확립된 H₂₂의 종양 부피 다른 치료 하에서 치료 중 ICR 마우스의 이종이식. 마우스는 그림에 표시된 것처럼 0일째에 다양한 전략으로 처리되었습니다. 3mg/kg의 유리 CDDP, Tet와 함께 유리 CDDP(CDDP 3mg/kg + Tet 7.2mg/kg), CDDP-Tet-loaded NPs( CDDP 3mg/kg + Tet 7.2mg/kg). 평균 ± SD(n =6) 각 그룹의 측정

처음 6일 동안 유리 CDDP + Tet 및 CDDP Tet 로딩 NP 그룹의 항종양 효과는 유사했습니다. 따라서, CDDP-Tet-loaded NP를 받은 쥐는 치료 후 6일째부터 더 나은 항종양 효능을 보여주었다. 추가 파일 1:그림 S3a는 각 그룹의 다른 종양 크기를 표시합니다. CDDP-Tet-loaded NPs군의 종양 부피가 가장 작았고, 이는 현저한 항종양 효과의 직접적인 반영으로 간주될 수 있었다. 종양 억제 능력 외에도 유리 CDDP 또는 유리 CDDP + Tet 그룹과 비교하여 종양 표면에 위치한 혈관이 더 적었습니다. 유사하게, 추가 파일 1:그림 S3b에서 볼 수 있듯이 혈관 밀도는 대조군 및 유리 CDDP + Tet 그룹에 비해 NPs 그룹에서 가장 낮았습니다.

생체 내 종양 조직에서 세포 사멸 세포의 비율을 추가로 조사하기 위해 세포 사멸 세포의 검출을 위해 TUNEL 분석을 수행했습니다. 그림 7에서 볼 수 있듯이 종양의 세포 사멸 세포는 녹색 형광으로 염색되어 세포 사멸을 나타낼 수 있습니다. 병합된 이미지는 대조군과 Free CDDP + Tet 그룹에서 더 적은 수의 녹색 형광 영역을 보여 더 적은 수의 세포자멸사 세포의 존재를 나타냅니다. 또한, CDDP-Tet NPs 처리군에서 많은 수의 녹색 형광 영역이 관찰되어 많은 양의 세포 사멸 세포를 나타냅니다. 결과는 CDDP-Tet NP가 생체 내에서 종양 세포자멸사를 촉진할 수 있음을 확인했습니다.

<그림>

아폽토시스 세포는 TUNEL 분석(녹색)에 의해 검출되었고 핵 염색 DAPI(파란색)에 의해 공동 염색되었습니다.

유리 CDDP 및 유리 CDDP + Tet 그룹보다 더 나은 항종양 효능 외에도 CDDP-Tet이 장착된 NP는 부작용도 적었습니다. 도 8a에 나타난 바와 같이, 유리 CDDP 및 유리 CDDP + Tet는 대조군에 비해 상당한 체중 감소를 일으켰으며, 이는 직접 약물 전달에 대한 독성을 나타냅니다. 빈 나노입자군의 무게 변화 곡선은 대조군과 유사하여 바탕 나노입자의 독성을 무시할 수 있음을 시사한다. CDDP-Tet이 로드된 NP와 대조군으로 인한 체중 감소는 처음 6일 동안 비슷했습니다. 6일부터 12일까지 NP 그룹의 쥐 체중 수준은 대조군보다 약간 낮았지만 유리 CDDP 또는 유리 CDDP + Tet 그룹보다 높았습니다. 유리 CDDP + Tet 그룹이 처음 4일 동안 마우스의 명백한 체중 감소 및 식욕 감소에 기여했다는 점은 주목할 만합니다. 이는 약물 흡수가 전신에 해롭다는 것을 나타냅니다. 대조적으로, CDDP-Tet-loaded NPs는 조직에서 천천히 방출될 수 있고 안정적인 정도로 농도를 유지할 수 있습니다. 따라서 직접 약물 전달에 비해 부작용이 분명히 낮았습니다. 그런 다음 간 생검으로 치료의 부작용도 평가했습니다(그림 8b). 대조군과 비교하여 이중약물 나체약물군의 간세포 경계가 흐릿하고 일부 간세포는 팽창 변화, 세포체 축소, 핵비축, 호산구증가(노란색 화살표)가 있는 반면, 이중약물 나노입자군. 줄기세포의 구조는 정상이고 세포간 공간이 명확하며 뚜렷한 병리학적 변화가 없습니다. 이러한 결과는 NP 전달로 인한 손상이 거의 없음을 시사했습니다.

<사진>

부작용 평가 a 확립된 H₂₂의 체중 다른 치료 하에서 치료 중 ICR 마우스의 이종이식. ㄴ HE로 염색된 간 표본은 광학 현미경 관찰(400 ×)에 있었습니다.

PET–CT

각 그룹의 생체 내 치료 효과를 더 잘 비교하기 위해 마우스는 치료 후 6일째에 CT, PET/CT 스캔을 받았습니다. CT와 PET 스캔의 융합 이미지는 그림 9에 나와 있습니다. PET/CT는 ¹⁸ 을 통해 대사 변화를 반영하는 효율적인 방법입니다. FDG 섭취 감지 [21]. As shown in CT scan (Fig. 9), the tumor volume of free CDDP plus Tet group and CDDP-Tet-loaded NPs group were comparable (Fig. 9a) but the tumor metabolic rate in free CDDP plus Tet group was significantly higher than NPs group (Fig. 9b). The decreased intensity at the tumor site of the murine received CDDP-Tet-loaded NPs symbolized poor metabolism rate of the tumor, and thereby indicating the capability of NPs to retard tumor growth.

Male ICR mice bearing a subcutaneous H₂₂ tumor at the left axillary (arrows). CT, PET and fused PET/CT images are arranged in the figure from left to right. Tumor metabolic rate in free CDDP plus Tet group (blue arrow) was significantly higher than NPs group (yellow arrow)

토론

Considering the heterogeneity and complexity of tumor, combination therapy has become a standard strategy in the clinical treatment of tumor [22]. Nevertheless, simple combination of two individual therapeutics can't necessarily reach anticipated effect because of the different physicochemical and pharmacokinetic properties of the two drugs [23]. To deliver different drugs to tumor cells in a synergistic ratio, a combination therapy vehicle has been designed in this study. CDDP is hydrophilic while Tet is hydrophobic, which cause problems for the loading method. In this study, we used the amphiphilic copolymer with PCL as the hydrophobic core and PEG as the hydrophilic corona [14]. By the improved double emulsion method, Tet located in the oil layer and CDDP located in the water layer, the unique structure imparts the NPs with the capacity to simultaneous encapsulation of Tet and CDDP to form NPs. CDDP and Tet are located in different layers of NPs, resulting in low interfering effect and high stability [24].

The combination therapy vehicle loaded with CDDP and Tet can enhance the efficacy of CDDP-Tet combination. Not only in the cellular experiments, CDDP-Tet NPs also significantly inhibit tumor tissue viabilities in the HDRA assays, validating the anti-tumor effect of the NPs in the model which take into account of tumor microenvironment [19]. As to in vivo study, antitumor efficacy was observed in tumor volume change, which demonstrated that CDDP-Tet NPs effectively suppressed tumor growth with lower proliferation level. ¹⁸ FDG-PET/CT imaging revealed that the glucose metabolism of the tumors in the CDDP-Tet group was inhibited more prominently and early by inducing higher apoptosis level of tumors, which was confirmed in the immunofluorescence assays [21]. Compared with free CDDP plus Tet, CDDP-Tet NPs are faster and safer to take effect, which can be explained by the three mechanisms as follows.

Firstly, as a lipid-soluble drug, Tet can hardly distribute in the ECM and therefore rarely diffuse around tumor cells [9]. Located in the oil phase of NPs, Tet is endowed with better solubility and bioavailability, reaching the tumor sites in the same synergistic ratio as CDDP. Furthermore, CDDP, which used to have systemic side effect, once carried by the nanoparticle, can easily reach the interstitium of tumor tissues from leaky tumor blood vessels and be held within the tumor on account of pressure made by destitute lymphatic drainage [25]. The more CDDP tumor tissues hold, the less damage will be done to normal organs. As a result of passive targeting strategies, CDDP-Tet NPs are much safer than free CDDP plus Tet, which can be observed in the murine body weight changes and liver biopsies.

Drug resistance is regarded as one of the greatest challenges in cancer treatment, not only because of genetic changes at the level of a single cell, but also due to tumor tissues and microenvironment [26]. On one hand, Tet is alkaline, so it will be protonated in the acidic tumor microenvironment and thus can’t cross the electronegative tumor cytomembranes, which is called pH-induced physiological drug resistance [27]. On the other hand, large distances between blood vessels in solid tumors and high interstitial fluid pressure contribute to limited distribution of CDDP and Tet [28]. Carried by the nanovehicle, Tet can enter tumor cells via endocytosis without influence of tumor microenvironment, overcoming the pH-induced physiological drug resistance. The small size of nanocarriers allows them to enter tumor vasculature and preferentially accumulating at the tumor site in vivo [29, 30].

In summary, this study represents an example of delivering a chemotherapeutic drug along with a chemosensitizer simultaneously. Carried by the NPs, both drugs are targeted to tumor site passively, reducing systemic toxicity. Besides, NPs offer a solution to physiological drug resistance by helping the chemosensitizer enter tumor cells more and faster, which play an important role in improving the efficacy of tumor chemotherapy. Therefore, we believed that this PEG–PCL block copolymeric NPs could be a promising carrier for combined chemotherapy.

Conclusions

Based on our previous studies [8, 14, 16], this paper investigated the application of PEG–PCL/HO-PCL NPs for delivery of the combination of two drugs with different physicochemical properties. For in vitro studies, NPs exhibited superior antitumor effect with great biocompatibility. Enhanced antitumor efficacy was observed in tumor volume change and ¹⁸ FDG-PET/CT Imaging as to in vivo study in murine model. The mice in NPs group also exhibited reduced side effects. Additionally, the apoptosis rate of tumor cells was promoted by NPs in both in vitro and in vivo studies. In summary, this block copolymeric NPs could be a promising carrier for the delivery of Cisplatin–Tetradrine combinations and other combinations, with enhanced antitumor effect and reduced toxicity, for the treatment of cancer.