병용요법은 임상 종양 치료에서 표준 전략이 되었습니다. 우리는 테트라드린(Tet)과 시스플라틴(CDDP)의 병용이 현저한 시너지 항암 활성을 나타냄을 입증했지만, 불가피한 부작용이 치료 농도를 제한합니다. 두 약물의 상이한 물리화학적 및 약동학적 특성을 고려하여 개선된 이중 유화법으로 이들을 나노전달체에 함께 탑재했습니다. 나노입자(NPs)는 폴리(에틸렌글리콜)-폴리카프로락톤(PEG-PCL)과 폴리카프로락톤(HO-PCL) 혼합물로 제조되어 CDDP와 Tet가 동시에 NP 내에 위치할 수 있게 하여 낮은 간섭 효과와 높은 안정성을 달성했습니다. 형광 현미경 이미지는 NP에 의해 전달된 친수성 및 소수성 약물 모두의 세포 흡수를 보여주었습니다. 다양한 종양 세포주와 종양 조직에 대한 체외 연구에서 종양 억제율과 세포자살률이 증가했습니다. 체내 연구에서는 NP 그룹에서 우수한 항종양 효능과 감소된 부작용이 관찰되었습니다. 또한 ¹⁸FDG-PET/CT 영상은 NP가 종양의 대사 활성을 더 현저히 감소시킴을 보여주었습니다. 우리의 결과는 PEG-PCL 블록 공중합체 NP가 고형 효능과 경미한 부작용으로 병용 화학요법을 위한 유망한 전달체임을 시사합니다.
종양 종합 치료의 발전과 함께 백금 화합물은 다양한 암 치료에서 중요한 역할을 하며, 그중 시스플라틴(CDDP)은 임상에서 널리 사용됩니다[1, 2]. 요즘 CDDP는 종양 면역요법과 결합했을 때 비소세포폐암(NSCLC) 같은 악성 종양에 유리한 효과를 보이며 여전히 중요합니다[3]. 그러나 이러한 화학요법제는 항상 바람직하지 않은 독성을 대가로 항종양 활성을 달성합니다[4], 따라서 화학요법의 독성을 줄이고 효능을 높일 수 있는 치료제의 탐색이 끊임없이 이어져 왔습니다[5, 6]. 테트라드린(Tet)은 비스-벤질아이소퀴놀린 알칼로이드 계열로 화학요법 감작에 만족스러운 효과를 보입니다[7]. 이전 연구에서 Tet과 CDDP 병용이 화학요법 관련 유전자 발현 억제(ERCC1, 티미딜레이트 신타아제(TS), β-튜불린 III 등)를 통해 현저한 시너지 항암 활성을 가짐을 입증했습니다[8]. 그러나 Tet의 임상 적용은 낮은 수용성과 낮은 경구 생체이용률로 어려움을 겪습니다[7]. 게다가 친수성 CDDP는 세포외 기질(ECM)에 가장 쉽게 분포하는 반면, 소수성 Tet은 지질막을 투과하여 세포를 통해 수송될 수 있어 두 약물이 실제로 함께 작용할 수 없습니다. 따라서 두 약물을 동시에 효과적으로 전달하여 부작용을 줄이면서 항종양 효과를 개선하는 방법을 찾는 것이 필수적입니다.
나노기술 분야의 최근 발전은 암 진단과 치료를 위한 새로운 접근법을 관리합니다[9, 10]. 특히 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 양친매성 공중합체로 구성된 나노입자(NPs)는 혈청 단백질 부착 감소와 망상내피계(RES)에 의한 섭취 방지 능력으로 알려져 있습니다[11]. 소수성 약물을 운반하는 데 사용되면 나노전달체는 용해도를 교묘하게 높이고 혈액 순환과 종양에서 약물 잔류 기간을 연장 및 증가시킵니다[12]. 공중합체 NP의 임상 사용으로 NP의 생체적합성이 점점 더 많은 주목을 받고 있습니다. 예를 들어 최근 연구에서 주입된 이산화 티타늄, 실리카, 금 나노입자가 동물 모델에서 암 세포의 혈관 내외 유출을 가속화함이 밝혀졌습니다[13]. 우수한 생체적합성과 안전성을 가진 나노소재, 특히 FDA 승인을 받은 소재로 제조된 NP가 더 나은 약물 전달체 후보입니다.
예비적으로 우리는 CDDP 탑재 NP[14, 15]와 폴리에틸렌 글리콜-폴리(카프로락톤)(PCL-PEG)을 사용한 Tet 탑재 NP[16]를 구축했으며, 이들의 체내 항종양 효과가 모두 입증되었습니다. 본 연구에서는 PEG-PCL을 사용하여 CDDP와 Tet의 공동 전달에 활용했습니다. 근중성 전하를 가진 PEG는 나노입자의 친수성 껍질을 형성하여 항원성 에피토프를 숨기고 면역 반응을 방지합니다[14]. 형광 현미경 이미지는 NP에 의해 전달된 친수성 및 소수성 약물 모두를 세포가 흡수할 수 있음을 보여주었습니다. 체외 연구 결과는 다양한 종양 세포주뿐만 아니라 종양 조직에서도 CDDP-Tet NP가 자유 약물보다 종양 성장을 더 효과적으로 억제함을 보여주었습니다. 체내 연구에서 NP 그룹에서 향상된 항종양 효능과 감소된 부작용이 관찰되었습니다. 게다가 ¹⁸FDG-PET/CT 영상은 NP 그룹에서 종양의 가장 낮은 대사율을 보여주어 CDDP-Tet NP의 종양 성장 지연 능력을 나타냈습니다.
CDDP(분자식 PtCl₂(NH₃)₂)는 산동 보위안 제약 유한공사(중국 지난)에서 구입했습니다[15]. 테트라드린(분자식 C₃₈H₄₂N₂O₆)은 순도 >98%의 분말 형태로 강서 이보 제약 개발 회사(중국 강서)에서 얻었습니다[16]. 메톡시폴리에틸렌글리콜[MePEG; 중량 평균 분자량(Mw=4kDa; 남경 웰 화학 유한공사 중국]]은 톨루엔과의 아제로트롭 증류로 탈수한 후 50°C에서 12시간 진공 건조하여 사용했습니다. ε-카프로락톤(ε-CL; Aldrich, USA)은 실온에서 CaH₂로 건조한 후 감압 증류로 정제했습니다. 폴리비닐알코올(PVA; 중합도=500, 알코올화도=88%; 상하이 동창 국제무역 유한공사, 중국)과 주석 옥테이트(분자식 SnCl₂)(Sigma)는 수령한 그대로 사용했습니다. RPMI 1640 배지(Gibco, USA), 송아지 혈청(란저우 민하이 생물공학, 중국), 디메틸티아졸릴-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드(MTT; Amersco, USA)는 수령한 그대로 사용했습니다.
인간 고분화 위암 세포주 MKN₂₈, 인간 대장암 세포주 LoVo, 인간 자궁경부암 세포주 HeLa, 쥐 간암 세포주 H₂₂를 상하이 세포생물학연구소(중국 상하이)에서 얻었습니다. 모든 세포주는 10% 소 혈청, 페니실린(100U/mL)-스트렙토마이신(100g/mL), 피루브산, 글루타민, 인슐린을 첨가한 RPMI 1640 배지에서 37°C, 5% CO₂ 수포화 분위기에서 증식시켰습니다.
이전 연구에서 설명한 대로[16, 17], mPEG-PCL과 HO-PCL 공중합체는 고리 개방 공중합으로 합성했습니다. 간단히 말해, 미리 정해진 양의 ε-CL을 PEG와 소량의 주석 옥테이트(0.1% wt/wt)를 포함한 중합 튜브에 첨가했습니다. 튜브를 진공 시스템에 연결하고 밀봉한 후 130°C 오일 욕조에서 48시간 동안 두었습니다. HO-PCL 공중합체 합성을 위해 미리 정해진 양의 ε-CL과 주석 옥테이트를 건조 없이 중합 튜브에 첨가했습니다. 중합 완료 후 조잡한 공중합체를 클로로포름에 용해하고 과량의 냉메탄올에 침전시켜 미반응 단량체와 올리고머를 제거했습니다. 침전물을 여과하고 물로 여러 번 세척한 후 감압 하에서 완전히 건조했습니다.
미리 정해진 양의 CDDP와 Tet 탑재 나노입자를 이중 유화법(DE)으로 제조했습니다[14, 18]. CDDP와 Tet를 5mg mPEG-PCL과 15mg HO-PCL을 함유한 1mL 디클로로메탄(DCM) 용액과 15초(15W) 초음파 처리하여 얼음 욕조에서 유화했습니다(용액 W1). 그런 다음 3%(w/v) PVA 용액 W2 4mL를 첨가하고 30초간 초음파 처리하여 W1/O/W2 유화를 만들었습니다. 이중 유화를 0.3%(w/v) PVA 수용액 50mL에 희석하고 진공 하에서 DCM을 증발시켰습니다. 얻어진 나노입자를 수집, 세척, 동결건조했습니다(그림 1).
약물 탑재량을 결정하기 위해 동결건조된 CDDP-Tet 탑재 NP 분말을 디메틸포름아마이드(DMF)에 용해하고, 이 용액 30L에 30L의 2mmol/L HCl을 혼합한 후 2mmol/L HCl 중 2.94mL의 0.2mmol/L SnCl₂ 용액을 첨가했습니다. 교정 곡선을 참조하여 1시간 후 403nm에서 흡광도를 시마즈 UV-1205 분광광도계(일본 교토)로 측정했습니다. NP 내 총 약물 양을 계산할 수 있었습니다. 약물 탑재량과 포장 효율은 각각 식 (1)과 (2)로 얻었습니다:
약물 탑재량(%) = (나노입자 내 약물 중량) / (나노입자 중량) × 100(%) (1)
포장 효율(%) = (나노입자 내 약물 중량) / (투입 약물 중량) × 100(%) (2)
이전 연구[15]를 기반으로 LoVo 세포를 6공 플레이트 커버에 공당 약 5×10⁵개 세포로 파종하고 24시간 배양했습니다(37°C, 5% CO₂). 로다민 B(21µg/mL)를 탑재한 NP를 공에 첨가했습니다. 2시간 배양 후 플레이트를 4°C와 37°C PBS로 3-4회씩 세척했습니다. 커버슬립 위의 LoVo 세포를 형광 현미경으로 관찰했습니다.
약물의 체외 세포독성은 MKN28과 H₂₂ 세포주를 사용한 표준 MTT 분석으로 결정했습니다. 간단히 세포를 96웰 플레이트에 웰당 5000개 세포 밀도로 파종하고 분석 전 24시간 배양했습니다. 그런 다음 세포를 자유 CDDP, 자유 Tet, 자유 CDDP+Tet, CDDP-Tet 탑재 나노입자의 일련의 용량에 노출시켰습니다. 배양 후 각 웰에 5mg/mL MTT 용액 20µL를 첨가하고 4시간 배양하여 생존 세포가 노란 MTT를 짙은 파란 포르마잔 결정으로 변환하게 했으며, 이를 200µL 디메틸 설폭사이드(DMSO)에 용해했습니다. 각 웰의 광학 밀도(OD)를 ELISA 리더(ELX800 Biotek, USA)로 테스트 및 참조 파장 490nm와 630nm에서 측정했습니다. 세포 생존율은 다음 공식으로 결정했습니다:
세포 생존율(%) = OD(시험 웰) / OD(참조 웰) × 100(%) (3)
빈 나노입자의 체외 적합성도 MKN₂₈과 H₂₂ 세포주를 사용한 MTT 분석으로 결정했습니다. MTT 분석에서 얻은 모든 결과는 최소 3회 독립적인 실험에서 반복하고 각각 3중으로 테스트하여 확인했습니다.
Annexin V-FITC 키트(Bender MedSystem, USA)를 사용하여 세포자살률 변화를 조사했습니다. MKN₂₈ 세포를 6cm 배양 접시에 24시간 배양했습니다. 배양 배지를 1µg/mL 자유 CDDP, 1µg/mL CDDP 탑재 NP, 200µg/mL 빈 NP로 각각 교체했습니다. 대조군은 약물 없는 배양 배지로 교체했습니다. 48시간 배양 후 효소를 첨가했습니다. 세포를 수집하고 PBS로 2회 세척한 후 100µL 버퍼에 재현탁했습니다. Annexin V 5µL와 PI 1µL를 순차적으로 첨가하고 혼합한 후 실온에서 빛을 피하여 15분간 방치했습니다. 400mL 버퍼를 첨가하고 FCM(BD FACS CantoTM, USA) 공정으로 세포자살률을 분석했습니다.
HDRA는 이전 연구[14, 19]에 따라 수행했습니다. 간단히 수컷 ICR 쥐를 양쪽 액와부에 4-6×10⁶ H₂₂ 세포를 생리식염수로 피하 주입했습니다. 종양이 400-600mm³ 부피에 도달하면 경부 탈구로 쥐를 안락사시키고 신선한 시료를 채취하여 생리식염수로 두 번 세척한 후 Hank's 용액에 담그고 약 15mg 무게의 조각으로 나누었습니다. 조직 시료를 24웰 플레이트에 놓고 1cm 크기의 정사각형 젤라틴 스펀지를 20% 태아 소 혈청과 아미카신 황산염(100IU/mL)이 첨가된 RPMI 1640 배지에 담근 후 자유 CDDP 또는 두 가지 다른 농도의 CDDP 탑재 NP를 포함시켰습니다. 네 개의 종양 시료를 약물 없이 배양하여 대조군으로 했습니다. 조직을 37°C, 5% CO₂에서 7일간 배양했습니다. 제1형 콜라게나아제(100L, 0.6mg/mL)와 MTT(100L, 5mg/mL)를 100mg/mL 숙신산 나트륨에 혼합한 용액을 첨가했습니다. 추가 24시간 배양 후 MTT 포르마잔을 1mL DMSO로 추출하고 각 웰에서 100L 용액을 96웰 마이크로플레이트 웰로 옮겼습니다. 마이크로플레이트 각 웰의 OD를 테스트 및 참조 파장 490nm와 630nm로 ELISA 리더로 측정했습니다. 조직 생존율은 다음 공식(4)에 따라 계산했습니다:
조직 생존율(%) = (OD(시험)/중량(시험,mg)) / (OD(대조)/중량(대조,mg)) × 100(%) (4)
18-20g 체중의 수컷 ICR 쥐에 쥐 간암 세포주 H₂₂를 이식하여 CDDP-Tet 탑재 NP의 상대적 효능을 평가했습니다. 특정 병원체 없는(SPF) 환경에서 사육되었으며, 드럼타워 병원 동물 관리 위원회 승인 지침에 따라 수행되었습니다. 4-6×10⁶ H₂₂ 세포를 함유한 0.2mL 세포 현탁액을 쥐 왼쪽 액와부에 피하 주입했습니다. 쥐를 6개 그룹으로 나누었습니다: 대조군(생리식염수), 빈 NP군, 자유 CDDP(3mg/kg)군, 자유 CDDP+Tet(CDDP 3mg/kg + Tet 7.2mg/kg)군, CDDP-Tet 탑재 NP(CDDP 3mg/kg + Tet 7.2mg/kg)군. 각 그룹은 6마리 쥐로 구성되었습니다. 이식 후 7-8일 후 치료를 시작하고 그 날을 'Day 0'으로 지정했습니다. 각 동물을 치료 시점에 체중 측정하여 보고된 mg/kg 용량을 달성하도록 용량을 조정했습니다. 실험 기간 동안 격일로 체중을 측정했습니다.
치료 후 21일째 대조군, 자유 CDDP+Tet군, CDDP-Tet NP군의 종양 조직을 조직학 관찰용으로 선택했습니다. 종양을 절제하고 10% 중성 완충 포르말린에 고정하고 통상적으로 파라핀 처리하여 5mm 두께로 절편했습니다. 조직 절편을 (40,6-디아미디노-2-페닐인돌)(DAPI, 파란색)과 말단 디옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제 dUTP 닉 엔드 라벨링(TUNEL, 녹색)으로 염색한 후 자이스 LSM510 Meta 공초점 현미경으로 관찰했습니다[20].
자유 CDDP+Tet군과 CDDP-Tet 탑재 NP군의 쥐를 치료 후 6일째 PET/CT 영상 촬영했습니다. 추적자 주입 전 4시간 금식했습니다. ¹⁸F-FDG 14.8MBq(400µCi)를 꼬리 정맥으로 방사성 추적자로 주입했습니다. 결합 PET/CT 스캐너(Jemini JXL, Philips, USA)로 이미지를 생성했습니다. ¹⁸F-FDG 투여 45분 후 쥐에서 고해상도 PET 이미지와 동일한 시야의 CT 뷰를 획득했습니다. PET 이미지는 CT 데이터를 기반으로 감쇠 및 산란 보정되었습니다. 이미지 융합은 공급업체 소프트웨어를 사용하는 자동 이미지 융합 시스템으로 수행했습니다. 체중과 주입 활성 보정을 적용하여 표준 섭취 값(SUV) 계산을 위해 종양 내 최대 FDG 섭취 값을 얻었습니다.
데이터 통계 분석은 Student's t-test로 수행했습니다. 데이터는 평균±SD로 나열했으며, P<0.05 값을 통계적으로 유의한 차이로 간주했습니다.
이전 연구에 따라 PEG-PCL과 HO-PCL로 NP를 합성했습니다(최적 비율 1:3)[14]. 최적 PEG-PCL 공중합체 NP의 직경, 다분산도, 수평균 분자량(Mn), 중량평균 분자량(Mw)은 추가 파일 1: 표 S1에 나와 있습니다. CDDP와 Tet 탑재 시 약물 탑재량과 포장 효율도 측정되었습니다(추가 파일 1: 표 S2), 이는 CDDP 탑재 PEG-PCL 공중합체 NP와 유사했습니다. 그러나 Tet의 약물 탑재량과 탑재 효율은 Tet 탑재 PEG-PCL 공중합체 NP보다 낮았으며, 이는 HO-PCL 성분과 관련이 있을 수 있습니다.
동적 광산란(DLS)을 통해 CDDP-Tet 탑재 PEG-PCL 공중합체 NP의 직경은 359.1±5.3nm, 다분산도는 약 0.231이었습니다. TEM과 AFM으로 관찰 시(추가 파일 1: Fig S1a, S1b), NP는 규칙적인 구형 모양과 DLS 데이터와 일치하는 유사한 크기를 보였습니다. 또한 나노입자 내에 작은 액적들이 분산되어 있어 나노입자가 실제로 이중 유화 구조임을 확인했습니다.
형광 염료 탑재 입자는 세포 흡수를 탐구하는 일반적인 방법으로 시각적 실시간 검출을 실현합니다. 우리는 염료 탑재 NP가 내포작용을 통해 세포에 진입할 수 있음을 입증했습니다. 본 연구에서 로다민 B는 친수성이며 PI 형광 채널에서 검출되어 CDDP를 모사했습니다. Tet 모사체로 쿠마린-6은 소수성이며 그 신호는 FITC 형광 채널에서 수신됩니다. 쿠마린-6과 로다민 B를 탑재한 NP와 2시간 공동 배양 후 LoVo 세포를 형광 현미경과 광학 렌즈(200×)로 검출했습니다. 그림 2에서 볼 수 있듯이 PI 형광 채널, FITC 형광 채널, PI/FITC 이중 형광 채널에서 형광 신호를 검출할 수 있었습니다. 결과는 NP가 쿠마린-6과 로다민 B를 동시에 종양 세포로 운반할 수 있음을 확인했으며, 이를 바탕으로 CDDP와 Tet가 NP에 탑재되어 종양 세포에 동시에 흡수될 수 있음을 추론할 수 있습니다.
위암 세포주 MKN28에서 자유 CDDP, 자유 Tet, 자유 CDDP+Tet, CDDP-Tet 탑재 NP의 세포독성을 비교했습니다. Tet 농도는 CDDP 농도의 2.4배였습니다. 그림 3에 나타난 바와 같이 네 그룹 중 CDDP-Tet 탑재 NP의 세포독성이 가장 강력했습니다. 자유 Tet와 NP 그룹, 그리고 다른 세 자유 약물 그룹 간의 세포독성 차이는 농도 증가와 함께 두드러졌습니다. 인간 자궁경부암 세포 HeLa와 간세포암 세포 H₂₂에서도 유사한 결과가 관찰되었습니다(추가 파일 1: Fig S2a, S2b).
빈 NP의 독성 연구는 이전 연구에서 수행되었습니다. 이전 연구에서 빈 NP가 종양 세포주에 거의 독성이 없어 빈 NP가 만족스러운 생체적합성을 가짐을 나타냈습니다[14, 16].
1µg/mL 자유 CDDP, 2.4µg/mL 자유 Tet, 자유 CDDP+Tet(1µg/mL+2.4µg/mL), CDDP-Tet 탑재 NP(1µg/mL+2.4µg/mL)가 48시간 공동 배양 후 MKN28 세포 세포자살률에 미치는 영향을 측정했습니다. 세포자살률은 Q2+Q4로 계산했습니다(그림 4 참조). 자유 CDDP+Tet, 자유 CDDP, 자유 Tet 그룹 간 세포자살률 변화는 유사했습니다(그림 4a-c). 그러나 CDDP-Tet 탑재 NP에 의해 유도된 MKN28 세포 세포자살률은 다른 세 그룹보다 유의하게 높았습니다(그림 4d).
NP의 항종양 효능을 더 포괄적으로 평가하기 위해 HDRA를 사용하여 자유 CDDP, 자유 CDDP+Tet, CDDP-Tet 탑재 NP의 H₂₂ 세포주에 대한 항종양 효과를 평가했습니다. 화학감수성 예측을 위한 임상 방법으로서 HDRA는 세포학적 실험보다 종양 조직의 실제 조건을 더 진정성 있게 시뮬레이션합니다[19], 그 결과는 약물 침투, 세포외 pH 값, 간질액 압력 등 종양 미세환경과 미세구조의 영향을 받을 수 있습니다.
Tet 농도는 CDDP 농도의 2.4배입니다. 그림 5에 나타난 바와 같이 최저 농도에서 자유 CDDP+Tet군의 항종양 효과가 자유 CDDP보다 우수했으나 약물 농도 증가에 따라 효과는 유사해졌습니다. 세포자살 분석과 일치하게 CDDP-Tet 탑재 NP는 모든 테스트 농도에서 세 그룹 중 현저히 우수한 항종양 효과를 보였습니다.
H₂₂ 세포주 이식으로 형성된 쥐 모델을 자유 CDDP 3mg/kg, 자유 CDDP+Tet(CDDP 3mg/kg+Tet 7.2mg/kg), CDDP-Tet 탑재 NP(CDDP 3mg/kg+Tet 7.2mg/kg)로 각각 치료했습니다. 약물 치료 12일 후 종양을 얻었습니다. 종양 크기를 이틀마다 측정하여 최적 약물 전달 함량을 결정했습니다. 종양 성장 곡선(그림 6)에 나타난 바와 같이 대조군과 빈 NP군의 종양 성장 추세는 유사했으나 약물 전달이 있는 다른 세 그룹에서 현저한 종양 억제가 있었습니다. 자유 CDDP군 대비 자유 CDDP+Tet군이 처음 6일 동안 더 나은 항종양 효능을 보였습니다. 그러나 6일 후 두 그룹 간 종양 억제율 차이가 좁아지기 시작했고 10일 후에는 자유 CDDP+Tet군이 더 나쁜 항종양 효과를 보였습니다.
처음 6일 동안 자유 CDDP+Tet군과 CDDP-Tet 탑재 NP군의 항종양 효과는 유사했습니다. 따라서 CDDP-Tet 탑재 NP를 투여받은 쥐는 치료 후 6일부터 더 나은 항종양 효능을 보였습니다. 추가 파일 1: Figure S3a는 각 그룹의 다른 종양 크기를 보여줍니다. CDDP-Tet 탑재 NP군의 종양 부피가 가장 작아 현저한 항종양 효과의 직접적 반영으로 간주될 수 있습니다. 종양 억제 능력 외에도, 자유 CDDP 또는 자유 CDDP+Tet군 대비 종양 표면의 혈관이 더 적게 위치했습니다. 마찬가지로 추가 파일 1: Figure S3b에 나타난 바와 같이 혈관 밀도가 대조군과 자유 CDDP+Tet군 대비 NP군에서 가장 낮았습니다.
체내 종양 조직의 세포자살 세포 비율을 추가로 조사하기 위해 TUNEL 분석을 수행했습니다. 그림 7에 나타난 바와 같이 종양의 세포자살 세포는 녹색 형광으로 염색되어 세포자살을 나타냅니다. 병합 이미지에서 대조군과 자유 CDDP+Tet군에서 녹색 형광 영역이 적어 세포자살 세포가 적음을 나타냅니다. 게다가 CDDP-Tet NP 치료 그룹에서 많은 녹색 형광 영역이 관찰되어 다량의 세포자살 세포가 있음을 나타냅니다. 결과는 CDDP-Tet NP가 체내에서 종양 세포자살을 촉진할 수 있음을 확인했습니다.
자유 CDDP와 자유 CDDP+Tet군 대비 더 나은 항종양 효능 외에도 CDDP-Tet 탑재 NP는 더 적은 부작용을 보였습니다. 그림 8a에 나타난 바와 같이 자유 CDDP와 자유 CDDP+Tet는 대조군 대비 유의한 체중 감소를 유발하여 직접 약물 전달의 독성을 나타냈습니다. 빈 NP군의 체중 변화 곡선은 대조군과 유사하여 빈 NP의 독성은 무시할 수 있음을 시사했습니다. CDDP-Tet 탑재 NP와 대조군의 체중 감소는 처음 6일 동안 비교 가능했습니다. 6일에서 12일까지 NP군의 쥐 체중 수준은 대조군보다 약간 낮았으나 자유 CDDP 또는 자유 CDDP+Tet군보다 높았습니다. 주목할 점은 자유 CDDP+Tet군이 처음 4일 동안 명백한 체중 감소와 쥐 식욕 감소를 초래하여 약물 흡수가 전신에 해로움을 나타냈습니다. 대조적으로 CDDP-Tet 탑재 NP는 조직에서 천천히 방출되어 농도를 안정적으로 유지할 수 있으므로 직접 약물 전달에 비해 부작용이 현저히 낮아졌습니다. 그런 다음 간 생검으로 부작용을 추가 평가했습니다(그림 8b). 대조군 대비 이중 약물 자유 약물 그룹에서 간세포 경계가 불분명하고, 일부 간세포가 풍선 변성을 보이며, 세포체가 수축하고, 핵 농축, 호산구 증가(노란 화살표)가 나타났습니다. 반면 이중 약물 나노입자 그룹에서는 줄기세포 구조가 정상이고, 세포간 공간이 명확하며, 뚜렷한 병리적 변화가 없었습니다. 이 결과는 NP 전달로 인한 손상이 거의 없음을 시사했습니다.
각 그룹의 체내 치료 효과를 더 잘 비교하기 위해 쥐를 치료 후 6일째 CT, PET/CT 스캔했습니다. CT와 PET 스캔의 융합 이미지는 그림 9에 표시되어 있습니다. PET/CT는 ¹⁸FDG 섭취 검출을 통해 대사 변화를 반영하는 효율적인 방법입니다[21]. CT 스캔(그림 9)에서 자유 CDDP+Tet군과 CDDP-Tet 탑재 NP군의 종양 부피는 비슷했습니다(그림 9a) 하지만 자유 CDDP+Tet군의 종양 대사율은 NP군보다 유의하게 높았습니다(그림 9b). CDDP-Tet 탑재 NP를 투여받은 쥐의 종양 부위에서 강도 감소를 보여 종양의 낮은 대사율을 상징하며, 이로써 NP의 종양 성장 지연 능력을 나타냈습니다.
종양의 이질성과 복잡성을 고려할 때 병용요법은 임상 종양 치료에서 표준 전략이 되었습니다[22]. 그럼에도 불구하고 두 개별 치료제의 단순 병용은 두 약물의 상이한 물리화학적 및 약동학적 특성으로 인해 반드시 예상 효과에 도달할 수 없습니다[23]. 두 약물을 시너지 비율로 종양 세포에 전달하기 위해 본 연구에서 병용요법 전달체를 설계했습니다. CDDP는 친수성인 반면 Tet은 소수성으로, 이는 탑재 방법에 문제를 야기합니다. 본 연구에서는 PCL을 소수성 코어로, PEG를 친수성 코로나로 하는 양친매성 공중합체를 사용했습니다[14]. 개선된 이중 유화법으로 Tet은 유층에, CDDP는 수층에 위치하여, 이 독특한 구조가 NP에 Tet과 CDDP의 동시 포장 능력을 부여하여 NP를 형성합니다. CDDP와 Tet가 NP의 다른 층에 위치하여 낮은 간섭 효과와 높은 안정성을 달성합니다[24].
CDDP와 Tet 탑재 병용요법 전달체는 CDDP-Tet 병용의 효능을 향상시킬 수 있습니다. 세포 실험뿐만 아니라 HDRA 분석에서 CDDP-Tet NP가 종양 조직 생존율을 유의하게 억제하여 종양 미세환경을 고려한 모델에서 NP의 항종양 효과를 검증했습니다[19]. 체내 연구에서는 종양 부피 변화에서 항종양 효능이 관찰되어 CDDP-Tet NP가 낮은 증식 수준으로 종양 성장을 효과적으로 억제함을 입증했습니다. ¹⁸FDG-PET/CT 영상은 CDDP-Tet 그룹에서 종양의 포도당 대사가 더 현저히 그리고 조기에 억제됨을 보여주었으며, 이는 면역형광 분석에서 확인된 더 높은 종양 세포자살 유도에 기인합니다[21]. 자유 CDDP+Tet 대비 CDDP-Tet NP가 더 빠르고 안전하게 효과를 나타내며, 이는 다음과 세 가지 메커니즘으로 설명될 수 있습니다.
첫째, 지용성 약물인 Tet은 ECM에 분포하기 어렵고 따라서 종양 세포 주위로 확산되기 어렵습니다[9]. NP의 유상에 위치함으로써 Tet은 더 나은 용해도와 생체이용률을 부여받아 CDDP와 동일한 시너지 비율로 종양 부위에 도달할 수 있습니다. 게다가 CDDP는 전신 부작용을 가지지만, 나노입자에 의해 운반되면 누출된 종양 혈관으로부터 종양 조직 간질로 쉽게 도달할 수 있으며, 빈약한 림프 배수로 인한 압력에 의해 종양 내에 유지될 수 있습니다[25]. 종양 조직이 더 많은 CDDP를 보유할수록 정상 장기에 대한 손상이 줄어듭니다. 수동적 표적화 전략의 결과로 CDDP-Tet NP는 자유 CDDP+Tet보다 훨씬 안전하며, 이는 쥐 체중 변화와 간 생검에서 관찰할 수 있습니다.
약물 내성은 암 치료에서 가장 큰 도전 과제 중 하나로 여겨지며, 단일 세포 수준의 유전적 변화뿐만 아니라 종양 조직과 미세환경 때문입니다[26]. 한편 Tet은 알칼리성이므로 산성 종양 미세환경에서 양성자화되어 전기음성 종양 세포막을 통과할 수 없는데, 이를 pH 유도 생리적 약물 내성이라고 합니다[27]. 다른 한편 고형 종양에서 혈관 간 큰 거리와 높은 간질액 압력은 CDDP와 Tet의 제한된 분포에 기여합니다[28]. 나노전달체에 의해 운반되면 Tet은 종양 미세환경 영향 없이 내포작용을 통해 종양 세포에 진입할 수 있어 pH 유도 생리적 약물 내성을 극복할 수 있습니다. 나노전달체의 작은 크기는 종양 혈관에 진입하여 체내에서 종양 부위에 선택적으로 축적될 수 있게 합니다[29, 30].
요약하자면, 이 연구는 화학요법 약물과 화학감작제를 동시에 전달하는 예시를 나타냅니다. NP에 의해 운반되어 두 약물 모두 종양 부위로 수동적으로 표적화되어 전신 독성을 감소시킵니다. 게다가 NP는 화학감작제가 종양 세포에 더 많이 더 빠르게 진입하도록 돕는 생리적 약물 내성 해결책을 제공하며, 이는 종양 화학요법 효능 개선에 중요한 역할을 합니다. 따라서 우리는 이 PEG-PCL 블록 공중합체 NP가 병용 화학요법을 위한 유망한 전달체일 수 있다고 믿습니다.
이전 연구[8, 14, 16]를 기반으로 본 논문은 상이한 물리화학적 특성을 가진 두 약물 병용 전달을 위한 PEG-PCL/HO-PCL NP 적용을 조사했습니다. 체외 연구에서 NP는 우수한 생체적합성과 함께 뛰어난 항종양 효과를 보였습니다. 체내 연구에서 종양 부피 변화와 ¹⁸FDG-PET/CT 영상에서 향상된 항종양 효능이 관찰되었습니다. NP군의 쥐도 부작용 감소를 보였습니다. 또한 NP에 의해 종양 세포 세포자살률이 체외 및 체내 연구 모두에서 촉진되었습니다. 요약하자면, 이 블록 공중합체 NP는 시스플라틴-테트라드린 병용 및 기타 병용 전달을 위한 유망한 전달체가 될 수 있으며, 암 치료를 위한 향상된 항종양 효과와 감소된 독성을 제공합니다.
현재 연구 동안 사용 및/또는 분석된 데이터 세트는 합리적인 요청 시 해당 저자로부터 제공받을 수 있습니다.
나노물질
초록 전통적인 암 치료제는 다양한 부작용과 표적 종양에 대한 불충분한 손상으로 비판받아 왔습니다. 나노입자의 돌파구는 전통적 치료와 진단을 업그레이드하는 새로운 접근법을 제공합니다. 실제로 나노입자는 전통적 암 진단과 치료의 단점을 해결할 뿐만 아니라 종양 진단과 치료를 위한 완전히 새로운 관점과 최첨단 장치를 창출합니다. 그러나 대부분의 나노입자 연구는 생체 내외 실험 단계에 머물러 있으며, 나노입자에 대한 임상 연구는 극소수만 보고되었습니다. 본 리뷰에서는 먼저 나노입자의 암 진단 및 치료 분야 현재 응용을 요약합니다. 이후 나
매일 로봇이 오하이오 제조 기업에서 점점 더 일반화되고 있습니다. 비행기, 기차, 자동차를 조립하고 용접하는 산업용 로봇이 있습니다. 크고 작은 금속 제품을 용접하는 로봇이 있습니다. 제품을 연마하고 마감하여 새 동전처럼 빛나게 하는 로봇도 있습니다. 투자 대비 효과 오하이오 기업들은 로봇 제조를 통해 투자 대비 더 큰 효과를 얻고 있음을 깨닫고 있습니다. 로봇 용접기는 금속 가공 기업에서 인간 용접공 4명만큼의 일을 할 수 있습니다. 기업이 자동 용접 시스템에 처음 3만~6만 달러를 투자하지만, 장기적으로 연간 생산 및 인건비를
