삼중 음성 유방암 세포에 대한 로바스타틴과 독소루비신의 풀루란 나노입자 매개 공동 전달의 상승적으로 강화된 억제 효과

초록

삼중음성유방암(TNBC)은 약물 내성이 생기기 쉽고 치료가 어려운 유방암의 하위 유형입니다. 이 연구에서 우리는 새로운 양친매성 접합체인 풀루란 캡슐화 LV(PLV)를 개발하기 위해 수용성 풀루란과 로바스타틴(LV)을 접목했습니다. PLV 접합체는 풀루란 대 LV의 세 가지 다른 비율로 합성되었으며 푸리에 변환 적외선(FTIR)으로 특성화되었습니다. 몰비로 환산한 LV의 치환도(DS)는 PLV(1/2), PLV(1/3) 및 PLV(1/4)에 대해 각각 7.87%, 3.58% 및 3.06%였다. 양성자 NMR 분석. 우리는 우수한 특성 때문에 독소루비신(DXR)이 로딩된 PLV 나노입자(PLV/DXR NP)를 준비하기 위해 PLV(1/2) 접합체를 선택했습니다. 동적 광산란으로 측정한 PLV(1/2) NP의 평균 크기와 제타 전위는 각각 177.6 nm 및 - 11.66 mV이고 PLV/DXR NP의 평균 크기와 제타 전위는 각각 225.6 nm 및 - 10.51 mV입니다. 시험관 내 약물 방출 프로파일링은 PLV/DXR NP가 72시간 이내에 DXR을 지속 가능하게 방출하는 것으로 나타났으며, 이는 pH 7.4(76.15%)보다 pH 5.4(97.90%)에서 더 강력했습니다. 세포독성 연구에서 PLV/DXR NP는 비-TNBC MDA-MB-453 세포보다 TNBC MDA-MB-231의 증식 억제가 더 큰 것으로 나타났습니다(IC₅₀ 0.60 대 11.05 μM). FITC가 탑재된 PLV/DXR NP는 세포 흡수를 조사하기 위해 준비되었습니다. 두 세포주 모두 NP의 시간 의존적 흡수를 나타내었지만 MDA-MB-231 세포에 들어가는 NP의 수는 MDA-MB-453 세포에 들어가는 것보다 많았습니다. . LV 및 DXR의 Pullulan 기반 NP 공동 전달은 TNBC 세포를 효율적으로 억제할 수 있으며, 이는 TNBC 치료를 위한 강력한 약물 전달 시스템을 설계하는 데 도움이 될 수 있습니다.

소개

삼중음성유방암(TNBC)은 에스트로겐 수용체(ER), 프로게스테론 수용체(PR) 및 인간 표피 성장 인자 수용체 2(HER2)가 결핍되어 있는 유방암의 특수한 아형으로 다른 유방암 아형에 비해 예후가 좋지 않습니다. 1,2,3]. 사용 가능한 표적 요법은 대부분 종양 세포 표면의 특정 수용체를 표적화하는 것에 달려 있습니다. TNBC에는 치료를 위한 활성 표적화를 위한 특정 표면 마커가 없기 때문에 다른 표적화 접근법을 탐색할 가치가 있습니다. 예를 들어, 고형 종양에 대한 고유한 EPR(Enhanced Permeability and Retention) 효과를 포함하는 수동 표적화[4]는 특정 크기 범위의 입자가 종양 부위를 표적화할 수 있게 합니다[5, 6]. 나노입자(NP)는 EPR 효과를 이용하여 고형 종양 부위에 농축될 수 있는 일종의 약물 운반체이다[4].

최근 고지혈증 치료에 사용되는 친유성 스타틴 중 하나인 lovastatin(LV)[7]이 암 줄기세포를 표적으로 하여 TNBC를 선택적으로 억제한다는 사실이 밝혀졌습니다[8, 9]. 또한, 우리는 NP 캡슐화가 유방암 세포 이식의 마우스 모델에서 TNBC에 대한 LV의 억제 효과를 향상시킬 수 있음을 입증했습니다[8]. 우리의 연구는 이전의 발견[10, 11]과 함께 친유성 스타틴, 특히 LV가 TNBC 치료를 위한 항암제로 재사용될 수 있음을 시사합니다. 그러나 좌심실이 TNBC에서 화학 내성을 극복하거나 화학 요법 약물의 치료 효과를 향상시킬 수 있는지 여부는 아직 알려지지 않았습니다.

좌심실과 독소루비신(DXR), 5-플루오로우라실[12], 시스플라틴[13], 1-β-D-아라비노푸라노실시토신[14]과 같은 다른 유형의 화학요법제 간의 시너지 효과는 다른 암세포 유형에서 보고되었습니다. DXR은 DNA에 결합하고 핵산 합성을 억제하는 복잡한 기능을 가진 안트라사이클린 화합물입니다. 또한 좌심실은 DXR과 상승작용으로 난소암 세포의 세포자멸사를 유도했습니다[15]. 또한 LV는 DXR을 세포외 구획으로 쉽게 배출할 수 있는 ATP 구동 펌프인 유출 단백질 P-당단백질[16]의 직접적인 억제제입니다[17, 18]. 따라서 좌심실은 다른 치료제의 치료 효과를 증가시킬 수 있고 좌심실과 이들 약물의 조합은 TNBC에 대한 치료 효능을 향상시킬 수 있습니다.

현재의 복합 요법은 도전으로 가득 차 있습니다. 한편, 병용 화학요법은 화학요법 약물의 빠른 대사, 낮은 수용성 및 낮은 생체이용률로 인해 심각하게 제한될 수 있습니다[19, 20]. 다른 한편으로, 다양한 약동학, 막 수송 특성 및 상이한 약물의 비특이적 생체 분포로 인해 개별 세포에서 투여되는 약물의 충분한 농도 및 특정 비율을 달성하는 것이 어렵다[21,22,23]. 이들 인자는 치료 효능 및 조합에 대한 상승작용 또는 길항작용의 수준에 영향을 미친다. 2개의 치료제를 나노 크기의 약물 담체에 공동 캡슐화하는 것은 담체에 적재된 약물이 상승 효과에 대해 정확한 비율을 유지할 수 있게 해주기 때문에 이러한 문제를 극복하는 효율적인 방법입니다[24, 25].

공동 캡슐화된 나노운반체는 주로 리포솜, 고분자 미셀, 마이크로 또는 나노구를 포함합니다[26,27,28,29]. 고분자 미셀은 우수한 성능(예:화학적으로 결합되고 물리적으로 캡슐화된 이중 약물 로딩, 높은 약물 로딩 및 높은 생체 적합성)으로 인해 많은 관심을 받았습니다[26, 30]. 이전 연구에서 우리는 생체적합성이 높은 친수성 다당류인 풀루란으로 일련의 나노입자를 준비하고 약물 방출 거동에 대한 다양한 요인의 영향을 연구했습니다[31]. 이 현재 연구에서 우리는 pullulan과 LV의 공급 비율이 다른 새로운 PLV 고분자 미셀을 준비하고 크기와 제타 전위 및 형태의 분포를 특성화했습니다. EPR 효과를 사용한다는 전제 하에 세포에 의해 내재화될 가능성이 더 높기 때문에 DXR로 로딩하기 위해 가장 작은 결과 NP를 선택했습니다. 또한 pH 값이 다른 배지에서 PLV/DXR NP의 약물 로딩량, 캡슐화 효율 및 약물 방출량을 측정했습니다. 우리는 FITC가 로드된 PLV/DXR NP의 세포 흡수를 평가하여 NP가 종양 세포로 들어가는 것과 DXR과 LV의 시너지 효과를 조사할 뿐만 아니라 MDA-MB-231(TNBC) 및 MDA-MB에 대한 NP의 세포 독성을 평가했습니다. -453(비TNBC) 세포(도식 1).

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나노입자(NP) 및 시험관 내 세포 실험의 개략도. 풀루란-로바스타틴(PLV) NP는 수용액에서 풀루란과 LV에 의해 형성된 폴리머의 자가 조립에 의해 형성되었습니다. NP를 형성하는 과정에서 DXR은 NP의 소수성 코어에 로딩되었습니다. 그런 다음, PLV/DXR을 각각 삼중 음성 유방암(TNBC) 및 비-TNBC 세포를 나타내는 MDA-MB-231 및 MDA-MB-453 세포로 시험관 내 세포 실험에 사용했습니다.

자료 및 방법

자료

Pullulan(200 kDa)은 Hayashibara(Tokyo) 출신입니다. LV 및 DXR 염산염은 J&K Scientific(Beijing)에서 구입했습니다. 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 염산염(EDCI) 및 4-디메틸아미노프리딘(DMAP)은 Aladdin Reagent(Shanghai)에서 구입했습니다. 용매와 같은 다른 시약은 Sinopharm Chemical Reagent Co.(Beijing)에서 구입했습니다. 유방암 세포주 MDA-MB-231(TNBC) 및 MDA-MB-453(비 TNBC)은 상하이 생물학 연구소의 세포 자원 센터에서 구입했습니다. CellTiterBlue 시약은 Promega(Madison, WI, USA)의 제품입니다. Dulbecco의 변형 이글 배지(DMEM)(Cat#SH30022.01)는 HyClone(USA)에서, 태아 소 혈청(FBS)(Cat#04-001-1ACS)은 Biological Industries(이스라엘)에서 가져왔습니다.

LV 이식 풀루란(PLV) 합성

먼저, LV 숙신산 모노에스테르(LV-SA)를 다음 단계에 의해 합성하였다. 요약하면, 0.60 g 숙신산 무수물(SA, 6.0 mmol) 및 2.0 g LV(5.0 mmol)를 20 mL 무수 피리딘에 용해시키고 50 ℃에서 48시간 동안 교반하였다. 생성된 반응액을 pH 3의 1500mL 빙염용액에 일정하게 교반하면서 천천히 붓고 많은 양의 백색 침전물을 침전시키고 농축된 HCl로 현탁액의 pH를 pH 3으로 조절한 후 진공여과하였다. . 그런 다음 침전물을 pH-3 빙염 HCl 용액으로 세척한 다음 ddH₂로 세척했습니다. O를 중성으로 전환하여 조 생성물을 제공합니다. 마지막으로, 조 생성물을 아세톤-물 용매 시스템으로부터 재결정화하여 순수한 LV-SA를 얻었고 수율은 72%였다. PLV는 LV-SA 대 풀루란의 몰비 1/2, 1/3 및 1/4에서 풀루란의 히드록실과 LV-SA의 카르복실산기를 접합하여 생성되었습니다. 요약하면, 0.5g(1.03mmol)의 LV-SA, 0.15g DMAP(1.23mmol) 및 0.24g EDCI(1.23mmol)를 20 mL 디메틸 설폭사이드(DMSO)에 용해시키고 ℃에서 교반합니다. 풀루란(0.33 g, 1/2; 0.50 g, 1/3; 0.67 g, 1/4)을 DMSO에 녹여 2%(w/v) 용액을 얻었다. 그 후 반응용액에 풀루란 용액을 천천히 가하여 50℃에서 48시간 반응시켰다. 반응 혼합물을 투석 백(MWCO =8~12 kDa)에 넣고 25% 에탄올/물 및 물에 대해 투석하였다. 그런 다음 샘플을 동결 건조했습니다[32]. 풀루란에 대한 LV의 공급 비율이 다른 PLV 접합체는 FTIR 분광 광도계(KBr 펠릿, Nicolet, TM Nexus 470-ESP, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)를 사용하여 FTIR 분석으로 특성화되었습니다. PLV 접합체도 ¹ 에 의해 확인되었습니다. H NMR 분광법(DMSO-d6 용매, BRUKER AVANCE-500, Bruker, Billerica, MA, USA) 및 각 접합체에 대한 LV에 대한 치환도(DS)를 계산했습니다.

NP의 준비 및 특성화

50mg 양의 PLV 접합체를 37 °C(접합체를 완전히 팽창시키기 위해)에서 부드럽게 흔들면서 12.5mL DMSO에 용해시켜 4 mg/mL 접합체 용액을 얻었다. 5mL 양의 접합체 용액을 DMSO로 2 mg/mL로 희석하여 1000mL 증류수에 대해 8시간 동안 투석백(8~14 kDa)을 사용하여 10회 교환하여 투석하였다. 그런 다음, 용액을 빙수욕에서 2분 동안 펄스(펄스 켜짐 2.0초, 꺼짐 2.0초)와 함께 100 W에서 프로브형 초음파 처리기(GA92-IIDA 초음파 세포 분쇄기, Suzhou Jiangdong Precision Instruments)를 사용하여 초음파 처리했습니다. . 자가 조립된 PLV NP를 얻었고 샘플을 4 °C에서 보관했습니다. PLV/DXR 나노입자를 제조하기 위해 2 mg DXR을 5 mL DMSO에 녹인 다음 5 mL 접합체 용액에 적가한 다음 동일한 방법으로 PLV/DXR 나노입자를 제조했습니다. FITC가 장착된 PLV/DXR NP를 제조하는 일반적인 절차에서 1 mg DXR을 2 mL DMSO에 용해한 다음 2.5mL 접합체 용액에 적가했습니다. 그런 다음 DMSO에 1 mL FITC 용액(0.6 mg/mL)을 적가하고 동일한 방법으로 FITC가 로딩된 PLV/DXR NP를 제조했습니다.

PLV NP, PLV/DXR NP 및 FITC가 장착된 PLV/DXR NP를 0.45μm 멤브레인을 통해 여과한 다음 입자 크기, 제타 전위 및 다분산 지수(PDI)를 동적 광산란(DLS, Zetasizer 3000 HS, Malvern Instruments, Malvern, UK). PLV NP의 형태학적 특징은 가속 전압 80 kV에서 투과 전자 현미경(TEM; Tecnai G2 20 S-Twin, FEI Hong Kong)으로 관찰되었습니다.

적재 용량 및 포획 효율 결정

PLV/DXR NP 용액(5 mL)을 5 분 동안 초음파 처리(2.0 에서 펄스, 2.0 에서 펄스)하여 NP에서 약물을 방출했습니다. 용액 내 DXR 흡광도는 UV-visible spectrophotometer(Shimadzu UV-2550, Kyoto, Japan)를 사용하여 480 nm에서 측정하여 약물 농도를 계산하였다. DXR 캡슐화 효율(EE) 및 로딩 용량(LC)은 다음과 같이 계산되었습니다.

$$ \mathrm{EE}\%=\frac{\mathrm{amount}\ \mathrm{of}\ \mathrm{drug}\ \mathrm{in}\ \mathrm{NPs}}{\mathrm{amount}\ \mathrm{of}\ \mathrm{총계}\ \mathrm{추가}\ \mathrm{약물}}\times 100\% $$ $$ \mathrm{LC}\%=\frac{\mathrm{amount}\ \mathrm{of}\ \mathrm{약물}\ \mathrm{in}\ \mathrm{NPs}}{\mathrm{NP}\ \mathrm{weight}}\times 100\% $$

체외 약물 방출

PLV/DXR 나노입자로부터의 DXR 방출 프로파일은 [33]에 기술된 투석 방법에 의해 37°C에서 0.1 M 인산염 완충 용액에서 측정되었습니다. 일반적으로 6 mL PLV/DXR NP(139.4 mg DXR와 동일)를 투석 백(MWCO =3500 Da)으로 옮기고 15 mL PBS(pH 4).4 및 5에서 37 °C에서 배양합니다. 미리 정해진 시간에 3 mL 외부 완충액을 빼내고 3 mL 신선한 PBS(pH 4 또는 5.4)로 교체했습니다. 방출된 DXR의 양은 형광 분광광도법으로 측정하였다. 약물 방출 비율(Q %)는 다음과 같이 계산되었습니다.

$$ Q\%=\left({C}_n\times V+{V}_n\sum \limits_{t=0}^n{C}_i\right)/\left({W}_{\mathrm{ NP}}\times \mathrm{LC}\%\right) $$

여기서 W 는 NP 가중치, C _n Tn에서의 시료 농도 , V 방출 매체의 총 부피, V _n 는 샘플 부피(2 mL)이고 C _나 T에서의 샘플 농도입니다. _나 (나 =0, 0.5, 1,…n 시간, 둘 다 V ₀ 및 C ₀ 0과 같습니다).

세포 배양

인간 유방암 세포주 MDA-MB-231 및 MDA-MB-453은 37°C, 5% CO₂의 습한 조건에서 10% FBS를 포함하는 DMEM 완전 배지에서 배양되었습니다. 및 정상산소(21% O₂ ). 실험 세포는 모두 대수 성장기 세포에서 파생되었습니다.

시험관 세포독성

96웰 플레이트에 접종된 MDA-MB-231 및 MDA-MB-453 세포(4× 10³ 100μL 부피의 세포/웰)을 24시간 동안 일상적인 배양 조건에서 성장시켰다. 그런 다음 다양한 약물 농도(DXR 및 LV의 질량비는 8.13임)를 갖는 PLV/DXR NP를 첨가하고 48시간 동안 인큐베이션하였다. 마지막으로, 세포 증식을 측정하는 데 사용되는 20 μL CellTiter Blue 시약(Promega)을 첨가하고 37 °C에서 1-4 시간 동안 배양했습니다. 530/590 nm에서의 흡광도는 자동 마이크로플레이트 리더를 사용하여 측정하였다. 세포 생존율은 처리하지 않은 대조군에 대한 흡광도의 백분율로 표시되었습니다.

체외 시너지 효과 분석

Isobole 분석은 짝을 이루는 약물에 의해 생성된 시너지 효과와 길항 작용을 정량적으로 평가하는 데 사용되었습니다. Tallarida의 용량 등가 원리와 Loewe 가법 모델에 따라 짝지어진 약물의 상가 효과를 정의하는 선인 isobole이 생성됩니다[34, 35]. 실제로 이전에 설명한 대로 [8], 우리는 먼저 자유 DXR 및 자유 좌심실에 대한 용량-효과 곡선을 획득하고 약물 용량과 효과를 변환한 후 선형 회귀를 사용하여 쌍을 이루는 결합된 용량을 계산하는 선형 회귀 방정식을 얻었습니다. 특정 효과를 주는 약물. isobole을 플로팅하기 위한 데이터는 표 1에 나와 있습니다. isobole의 점은 50% 최대 효과를 생성하기 위해 DXR/LV를 다른 비율로 설정합니다. IC₅₀ isobole 아래에 있는 한 쌍의 약물 용량은 상승 효과를 나타내는 반면 IC₅₀ isobole 위는 길항 효과를 나타냅니다.

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체외 세포 흡수

투석을 통해 PLV/DXR FITC 나노입자를 얻었다. PLV/DXR FITC NP의 세포 흡수는 형광 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 테스트되었습니다. MDA-MB-231 및 MDA-MB-453 세포를 접종했습니다(2 × 10⁵ /well) 2.5cm 접시에 넣고 37 °C에서 24 시간 동안 배양합니다. 그런 다음 세포를 37 °C에서 1, 2 및 4 시간 동안 농도의 PLV-DXR FITC NP와 함께 인큐베이션했습니다. 그 다음, 배양 배지를 제거하고 차가운 PBS로 2회 세척하였다. 세포를 5분 동안 4% 파라포름알데히드로 고정하고 DAPI를 포함하는 장착 배지를 사용하여 슬라이드에 장착했습니다. 그런 다음 형광 현미경으로 NP의 세포 흡수를 시각화했습니다.

통계 분석

데이터는 평균 ± SD로 표시되며 학생의 t 테스트. 차이는 P에서 통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다. <0.05.

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결과

시험관 세포독성 및 DXR 및 LV의 상승 효과

TNBC 및 비-TNBC 세포 증식에 대한 LV 및 DXR의 억제 효과를 평가하기 위해 Alamar blue assay로 세포 생존력을 평가했습니다. 우리는 먼저 무료 약물 테스트를 통해 두 개의 TNBC 세포주에 대한 LV 및 DXR의 억제 효과를 결정했습니다. 한 약물의 농도를 일정하게 설정하고 다른 약물의 농도를 변경하여 일련의 LV/DXR 농도 비율을 얻었습니다. MDA-MB-231 세포주의 경우 LV와 DXR 모두 농도 의존적 억제를 나타내었지만 LV는 최대 3.0 μM 농도에서 상당한 억제 효과를 나타냈습니다(그림 1).

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유방암 세포에서 유리 독소루비신(DXR)과 유리 로바스타틴(LV)의 세포독성. MDA-MB-231(a , b ) 및 MDA-MB-453(c , d ) 암세포

IC₅₀ 다른 DXR 처리 하의 LV 및 다른 LV 처리 하의 DXR 값이 표 2에 나와 있으며 이러한 IC₅₀도 표시했습니다. 값(그림 2a)을 사용하여 DXR/LV의 결합 효과를 시각적으로 반영합니다. IC₅₀ 무료 DXR 단독의 경우 0.865 μM이었고, 무료 LV 단독의 경우 10.07 μM이었습니다. DXR의 농도가 0.125에서 0.625 μM로 증가하면(5배 증가), IC₅₀ LV의 경우 10.92에서 0.28 μM(39배 감소)으로 감소하고 DXR 농도가 0.625에서 3.125 μM(5배 증가)으로 증가하면 IC₅₀ LV 값은 0.28에서 0.0004085 μM으로 감소했습니다(685배 감소). 유사하게, LV 농도가 1.0에서 3.0 μM으로 증가할 때(3배 증가), IC₅₀ DXR에 대한 값은 1.005에서 0.3033 μM(3.3배 감소)으로 감소하고 LV 농도가 3.0에서 10 μM(3.3배 증가)으로 증가하면 IC₅₀ DXR에 대한 값은 0.3033에서 0.007196 μM(42배 감소)으로 감소했습니다. 따라서 MDA-MD-231 세포 증식의 동일한 억제율에 대해 DXR은 필요한 LV의 양을 상당히 감소시킬 수 있고 LV는 또한 필요한 DXR의 양을 상당히 감소시킬 수 있습니다. 이 발견은 DXR이 바람직하지 않은 부작용이 있는 매우 강력한 화학요법 약물이고 낮은 농도로 유지되어야 하고 LV는 부작용이 최소이기 때문에 종양 화학요법에 필수적입니다[36]. MDA-MB-453 세포의 경우 DXR은 농도 의존적 억제를 나타내었지만 LV는 조사된 농도에서 유의한 억제를 나타내지 않았습니다. 또한, DXR은 최대 3.0 μM 농도에서 MDA-MB-453 세포에 상당한 억제 효과를 나타내어 MDA-MB-231 세포보다 훨씬 덜 효과적이었습니다(그림 1). 우리는 최근에 LV가 비-TNBC 세포주와 비교하여 TNBC 세포주의 패널을 선택적으로 억제한다는 것을 발견했습니다[8]. 따라서 LV와 DXR의 조합은 TNBC를 치료하는 데 적합할 수 있지만 비-TNBC 세포에는 적합하지 않을 수 있습니다.

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DXR과 LV의 시너지 IC₅₀ GraphPad Prism 7(a)로 계산한 LV 및 DXR 농도가 다른 DXR 및 LV 값 ) 및 isobole 방법(b )

DXR과 LV의 시너지 효과를 더 정량적으로 평가하기 위해 isobole 방법을 사용했습니다. 50% 최대 효과를 달성하기 위해 다른 DXR/LV 비율을 사용하여(표 1), DXR/LV 비율의 추가 효과를 나타내는 등극선을 플로팅했습니다(그림 2b). IC₅₀ 0.025/7.09, 0.3033/3.0 및 0.625/0.28(μM/μM)에서 DXR/LV의 용량은 동위체 미만이었고, 이는 이러한 비율에서 DXR/LV가 상승 효과를 생성할 것임을 시사합니다. 따라서 이러한 시너지 효과(1 + 1> 2)는 약리학적으로 통계적으로 최소화된 약물 용량과 최대의 약물 효능을 추가로 달성할 것입니다[37]. 이 세 가지 상승적 비율은 이러한 결과를 나타내는 것으로 나타났습니다. (1) 0.025 μM DXR이 좌심실의 용량-효과 곡선에 대해 더 큰 음의 기울기를 생성할 수 있기 때문에 낮은 용량의 DXR(0.025 μM)이 좌심실의 치료 효능을 더 잘 향상시킬 수 있습니다(그림 1). . 2b); (2) 높은 DXR 농도에서 소량의 LV를 추가하면 IC₅₀ DXR 단독의 경우 0.865 μM이었지만 0.28 μM LV만 추가하면 IC₅₀가 감소했습니다. DXR을 0.625 μM로, 즉 0.28 μM LV가 0.24 μM DXR의 효능을 완전히 대체했습니다(표 2). (3) 좌심실 선량이 DXR 선량의 약 10배일 때 점(0.3033, 3.0)이 동위체에서 가장 멀리 떨어져 있기 때문에 DXR/LV 비율이 최고의 시너지 효과를 내야 합니다(그림 2b).

PLV 접합체의 합성 및 구조적 특성화

양친매성 PLV 접합체는 반응식 2와 같이 합성되었습니다. PLV는 풀루란과 LV의 에스테르화에 의해 얻어졌습니다. PLV 접합체의 구조는 FTIR 및 ¹ 에 의해 확인되었습니다. H NMR 스펙트럼(그림 3). FTIR 분석(그림 3a)에 따르면 PLV 접합체가 성공적으로 생성되었습니다. PLV 접합체 스펙트럼의 경우 풀루란(1644, 1642 및 1648 cm⁻¹ 의 특징적인 피크를 유지하는 것 외에도 ), 1459 cm⁻¹ 에서 향상된 피크 및 1360 cm⁻¹ 또한 –CH₃의 굽힘 진동 피크를 보여주었습니다. 및 -CH₂ – 각각 LV의 경우. 또한 1725 cm⁻¹ 에서 –C=O 신축 흡수 피크(LV의 에스테르 결합)의 높은 파수 이동을 관찰했습니다. 새로 생성된 에스테르 결합으로 인해 PLV 접합체에서 생성되었으며 이러한 피크는 풀루란에 대한 LV의 몰비가 증가함에 따라 향상되었습니다(그림 3a).

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양친매성 PLV 접합체의 화학적 합성 LV와 succinic anhydride(SA)는 pyridine의 촉매 작용 하에 반응하여 50 °L에서 LV-SA를 형성했습니다. 그런 다음 LV-SA는 EDC 및 DMAP의 촉매 작용 하에 에스테르 결합에 의해 풀루란에 연결되어 PLV 중합체를 형성합니다.

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풀루란-로바스타틴(PLV) 접합체의 구조적 특성화. 아 풀루란, LV, PLV(1/2), PLV(1/3) 및 PLV(1/4)에 대한 FTIR 스펙트럼, 1644, 1642 및 1648 cm⁻¹ 에서 피크 풀루란의 특징적인 봉우리로. 1360, 1459 및 1725 cm⁻¹ 의 점선 –CH₃의 굽힘 진동 피크 표시 – 및 –CH₂ – LV의 경우. ㄴ ¹ 풀루란, LV, PLV(1/2), PLV(1/3) 및 PLV(1/4)에 대한 H NMR 스펙트럼

¹ 에 의해 PLV 접합체의 성공적인 합성을 확인했습니다. H NMR 스펙트럼(그림 3b). ¹ H-NMR 스펙트럼은 풀루란의 특징적인 피크와 CH3에 할당된 새로운 피크를 보여주었습니다. , 채널₂ , 및 0.5~2.7 ppm에서 LV 부분의 CH 양성자(빨간색 프레임)는 풀루란에 대한 LV의 성공적인 접합을 나타냅니다. C₁의 α-1,6 및 α-1,4 글리코시드 결합 양성자에 해당하는 4.94~5.14 ppm(a)에서 풀루란의 특성 피크를 사용했습니다. 풀루란에서 포도당 단위를 정의하기 위해 [38]. 4.12 ppm(b)에서의 신호는 C₁₃의 양성자에 해당합니다. LV에서. 따라서 풀루란의 100글루코스 단위당 좌심실 잔기의 DS는 C₁₃의 비율로 계산되었습니다. LV의 양성자(4.05~4.15 ppm)에서 당 양성자(4.94~5.14 ppm)로의 변환:DS =I _4.05~4.15 /나 _4.94~5.14 × 100%. LV에 대한 DS 데이터는 표 3에 나와 있습니다.

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PLV NP의 특성

합성된 PLV 접합체는 수용액에서 미셀로 자가 조립될 수 있습니다. 평균 크기 및 다분산 지수(PDI)는 PLV(1/2) NP에 대해 각각 177.2nm 및 0.138이었습니다. PLV(1/3) NP의 경우 189.7 nm 및 0.160, PLV(1/4) NP의 경우 219.8 nm 및 0.050입니다(표 3, 그림 4a, b). 또한, PLV(1/2), PLV(1/3) 및 PLV(1/4) NP에 대한 제타 전위는 각각 - 11.66, - 10.51 및 - 8.30 mV였습니다. PLV NP의 크기는 LV의 DS가 증가함에 따라 감소했으며 제타 전위에는 큰 변화가 없었습니다. 크기의 변화는 주로 LV 그룹 간의 소수성 상호 작용이 강화되어 더 조밀한 소수성 코어가 형성되기 때문입니다[39]. 우리는 이전에 콜레스테롤의 다른 DS 값을 갖는 풀루란 나노입자를 연구했으며 어느 정도 양친매성 고분자의 소수성 DS가 클수록 형성된 나노입자의 크기가 작아짐을 발견했습니다[33]. 이 연구에서 소수성 그룹 LV의 DS가 더 크기 때문에 NP의 크기도 더 작았습니다. 또한 TEM 이미지(그림 4c)는 NP가 일반적으로 단분산성이 좋은 구형 형태임을 보여주었습니다. 다음 실험을 위해 가장 높은 DS가 가장 높은 LV 로딩과 가장 작은 크기를 갖는 PLV(1/2) NP가 선택되었습니다.

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나노입자(NP)의 특성화. 아 PLV의 입자 크기 및 분포. ㄴ PLV의 제타 전위. c PLV(1/2)의 투과전자현미경 이미지. d PLV/DXR 및 FITC가 탑재된 PLV/DXR의 입자 크기 및 분포. 이 PLV/DXR 및 FITC가 탑재된 PLV/DXR의 제타 전위. 에 PLV, PLV/DXR 및 FITC가 탑재된 PLV/DXR의 사진

PLV/DXR NP는 또한 빈 PLV NP보다 구형 형태와 225.6 nm 더 큰 크기를 나타냈다. PLV/DXR 나노입자의 캡슐화 효율과 로딩 용량은 각각 20.92%와 1.93%였다. NP의 소수성 코어와 약물의 소수성 기 사이의 소수성 상호작용은 NP에서 약물 로딩의 양을 결정합니다. 본 실험에 사용된 DXR 염산염의 수용해도가 약간 더 큰 것을 고려하면, DXR과 나노입자의 소수성 코어 사이의 소수성 상호작용이 약해 실제로 나노입자에 캡슐화되는 DXR의 양이 더 적습니다. 종양 세포에 의한 NP의 흡수를 더 명확히 하기 위해 FITC를 PLV/DXR NP에 로딩했습니다. FITC 로딩 시 FITC 로딩된 PLV/DXR NP의 평균 크기는 253.8 nm이고 평균 제타 전위는 - 15.09 mV였습니다(그림 4d, e).

체외 약물 방출

PLV/DXR NP에서 DXR의 방출 거동을 밝히기 위해 시험관 내 DXR 방출 프로필을 PBS에서 pH 7.4 및 5.4로 평가하여 각각 정상 생리 조직 및 세포내 미세 환경의 조건을 모방했습니다. PLV/DXR NP는 두 단계의 DXR 방출을 나타냈습니다. 첫 번째 8 h의 빠른 방출과 그 이후의 지속 방출(그림 5)은 일반적인 NP의 방출 프로필과 일치합니다. 또한 pH가 7.4에서 5.4로 감소함에 따라 누적 DXR 방출이 72시간에서 각각 76.15% 및 97.90%까지 크게 가속화되었습니다. 따라서 PLV/DXR NP에서 DXR의 방출은 어느 정도 pH에 민감하며, 이는 치료 효능을 높이고 생체 내 부작용을 줄이는 데 특히 유용합니다[40].

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투석 후 다른 시간에 pH 7.4 대 5.4의 인산 완충 식염수에서 PLV/DXR의 DXR의 시험관 내 방출 프로필

FITC가 로드된 PLV/DXR NP의 세포 흡수

우리는 FITC가 로딩된 PLV/DXR NP에 노출된 후 각각 0.5, 1 및 4 h에서 MDA-MB-231(그림 6a) 및 MDA-MB-453(그림 6b) 세포의 형광 현미경 이미지를 얻었습니다. 는 NP 처리 후 0.5시간에서 4 h까지 적색 및 녹색 형광 강도의 시간 의존적 증가를 발견했으며(그림 6), 이는 각각 DXR 및 FITC 로딩된 NP의 시간 의존적 세포 흡수를 나타냅니다. 또한 MDA-MB-231 세포에 들어가는 FITC의 양이 MDA-MB-453 세포에 들어가는 양보다 많았다. 형광 강도를 추가로 정량화하면 NP 처리 후 1 h에서 MDA-MB-231과 MDA-MB-453 세포 사이의 DXR 흡수에 상당한 차이가 있음이 밝혀졌습니다(그림 6c).

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PLV/DXR NP에 로드된 약물의 유방암 세포 흡수. MDA-MB-231(a ) 및 MDA-MB-453(b ) 0.5, 1 및 4 h의 세포(DAPI의 경우 파란색, DXR의 경우 빨간색, FITC의 경우 녹색). ㄷ PLV/DXR 처리 후 MDA-MB-231 및 MDA-MB-453 세포에서 DXR의 세포 흡수 정량 분석

PLV/DXR NP의 시험관 내 세포독성

MDA-MB-231 및 MDA-MB-453 세포의 생존율에 대한 DXR 및 LV의 억제 효과를 확인하고 DXR 및 LV의 상승 효과를 입증한 후, 우리는 이 두 세포에 대한 PLV/DXR NP의 시험관내 세포독성을 결정했습니다. 윤곽. MDA-MB-231 및 MDA-MB-453 세포를 유리 DXR과 동일한 농도의 PLV/DXR NP와 함께 배양했습니다. PLV/DXR NP의 세포독성은 DXR 농도가 증가함에 따라 증가했으며 MDA-MB-453 세포보다 MDA-MB-231에서 더 컸다(그림 7a). This finding is consistent with the cytotoxicity trend of free drugs (Fig. 7b) and indicates that loading free drugs in NPs did not affect the inhibitory behavior of the drugs. PLV/DXR NPs had higher inhibitory effect on the proliferation of MDA-MB-231 than MDA-MB-453 cells, which was consistent with the preferential inhibitory effect of LV on TNBC. Growth inhibition of MDA-MB-231 cells was greater with PLV/DXR NPs than free DXR (IC₅₀ 0.6012 vs 0.865 μM), which suggests that NPs might facilitate cellular uptake and retention of the loaded drug inside the cell, causing enhanced cytotoxicity as compared with free drug.