Fe(II)-타닌산 코팅 MOF를 통한 아르테미시닌 표적 전달로 삼중음성 유방암에서 페롭토시스 강화

초록

페롭토시스(ferroptosis) 유도를 통한 종양 발달 억제는 세포내 산화 불균형에 민감한 삼중음성 유방암(TNBC)에 대한 잠재적 치료제가 될 수 있습니다. 최근 아르테미시닌(ART)과 그 유도체들이 엔도페록시드 가교의 철 매개 절단을 통한 페롭토시스 유도로 고악성 암 치료를 위한 잠재적 항암제로 조사되어 왔습니다. 그러나 낮은 수용성과 제한된 세포내 철 함량으로 인해 항암 요법에의 추가 적용이 어렵습니다. 본 연구에서는 타닌산(TA)과 아연 이온(Fe(II))을 아르테미시닌이 캡슐화된 제올라이트 이미다졸레이트 프레임워크-8(ZIF)에 배위 구동 자기조립으로 코팅한 ART용 철 공급 나노전달체(TA-Fe/ART@ZIF)를 개발했습니다. 약물 방출 실험에서 ART는 pH 7.4에서 거의 방출되지 않았으나, pH 5.0에서 10시간 후 59%가 방출되어 우수한 pH 반응성 방출을 입증했습니다. 한편, GSH와 GPX4 감소와 함께 높은 수준의 세포내 ROS와 MDA가 나타나 새로 개발된 나노약물 시스템이 현저히 강화된 페롭토시스를 유도함을 보여주었습니다. 단일 요법과 비교한 체외 및 생체 내 종양 억제 실험에서 TA-Fe/ART@ZIF의 더 높은 종양 억제 효율이 입증되었습니다. 이 연구는 페롭토시스 나노의약품의 효능을 강화하는 새로운 접근법과 TNBC 치료를 위한 새로운 방향을 제공합니다.

서론

페롭토시스는 새롭게 발견된 세포 사멸 아형으로, 철 의존적 지질 하이드로퍼옥사이드(LPO) 축적을 초래해 세포 구조와 무결성을 손상시킵니다[1,2,3]. 여러 작은 분자에 의한 페롭토시스 활성화가 다양한 실험적 암 모델에서 종양 억제에 효과적이라는 새로운 증거들이 제시되며, 페롭토시스가 새로운 항암 요법으로서의 잠재력에 대한 높은 기대를 불러일으켰습니다[4,5,6]. 삼중음성 유방암(TNBC)은 표적 치료제가 부족하고 종양 재발, 원격 전이, 치료 내성과 연관된 가장 공격적인 유방암 아형입니다[7]. 선행 연구들은 xCT 시스틴/글루타메이트 역수송체가 수많은 TNBC 세포에서 높게 발현되어 글루타치온(GSH) 수준과 산화환원 균형 유지에 중요한 역할을 함을 지적했습니다[8]. 세포내 GSH 함량 감소는 TNBC 세포를 페롭토시스에 민감하게 만들어 종양 세포를 사멸시킬 수 있습니다[8]. 주목할 점은 페롭토시스가 TNBC의 통상적 프로그램된 아포토시스에 대한 내성도 우회할 수 있다는 것입니다[9]. 따라서 페롭토시스 유도 기반 전략이나 약물이 난치성 TNBC 임상 치료에 치료적 잠재력을 가질 수 있습니다.

전통 중국 식물 Artemisia annua에서 분리된 세스퀴테르펜 락톤인 아르테미시닌(ART)은 과산화기 그룹을 포함하며 다수 암세포주에서 바람직한 항종양 활성을 보였습니다[10, 11]. 암세포가 정상 세포보다 훨씬 많은 세포내 철 풀을 포함하며, 철 매개 엔도페록시드 가교 절단을 통해 ART가 다수 암세포주에서 선택적 세포 사멸을 유도한다는 증거가 증가하고 있습니다[12, 13]. 철 이온 의존적 항종양 활성이 ART 조절 페롭토시스에 대한 관심을 끌고 있습니다[13]. 기전적으로 ART는 자가포식 비의존적 방식으로 페리틴의 라이소좀 분해를 유도해 세포내 아연 이온 수준을 높이고 세포를 페롭토시스에 민감하게 만듭니다[11].

그러나 ART가 TNBC에서 페롭토시스를 유도하는지 여부는 여전히 불분명합니다. 또한 낮은 수용성과 불충분한 세포내 아연 이온 가용성 등 일련의 요인들이 ART의 항암 요법 추가 적용을 제한합니다[13]. ART 나노복합체들은 ART 기반 항종양 약물을 위한 전망 있는 나노약물 전달 시스템으로 성공적으로 사용될 것으로 기대됩니다[14,15,16]. 최근 금속-유기 골격체(MOFs)는 큰 기공 크기, 높은 겉보기 표면적, 작은 분자의 선택적 흡착 입증으로 주목받는 다공성 고분자 소재입니다[17,18,19]. MOF 유형 소재의 대표격인 제올라이트 이미다졸레이트 프레임워크(ZIF-8)는 pH 반응성, 높은 약물 탑재량, 좋은 생체적합성 특성으로 나노의약품 개발에 널리 사용됩니다[20,21,22,23]. 게다가 MOF에 조절 가능한 표면을 도입할 수 있어 표면 물성을 제어하고 다기능성을 부여할 수 있습니다[24, 25]. MOF 표면에 금속-페놀 배위 코팅을 초분자 조립하는 것이 자극 반응성 분해, 콜로이드 안정성, 생체적합성 등 바람직한 특성으로 최근 관심을 끌고 있습니다[26, 27]. MOF 위의 금속-페놀 배위 소재는 소수성 ART 전달을 위한 이상적 운반체일 수 있습니다.

이에서 영감을 받아 우리는 TNBC 세포에서 페롭토시스 조절을 위해 ART를 캡슐화한 ZIF-8 나노시스템을 아연 이온-타닌산 배위 코팅으로 감싼 TA-Fe/ART@ZIF를 개발했습니다(그림 1 참조). ZIF-8은 좋은 생체적합성과 pH 반응성 방출로 ART 캡슐화 나노전달체로 선정되었습니다. 아연 이온-TA 배위 코팅은 ART@ZIF 표면에 고정시켜 분산 안정성과 아연 이온(Fe(II)) 공급을 도모했습니다. 제조된 나노시스템이 세포 내에 섭취된 후 산성 분해로 ART 방출과 Fe(II) 축적이 촉진될 것입니다. 세포내 Fe(II) 수준 상승은 철 매개 엔도페록시드 가교 절단을 통해 ART를 라디칼로 분해해 페롭토시스 효과를 현저히 강화할 것입니다. 결론적으로 TA-Fe/ART@ZIF 매개 페롭토시스 발견은 TNBC에 대한 새로운 치료법 개발에 새로운 관점을 제공할 수 있습니다.

재료 및 방법

시약

아르테미시닌(99%), 2-메틸이미다졸(98%), 질산 아연(ZnNO₃; 98%), TA(98%), 황산 제1철(FeSO₄; 98%), 무수 메탄올을 알라딘-시약(상하이, 중국)에서 제공받았습니다.

TA-Fe/ART@ZIF 나노입자 제조

ART@ZIF 나노입자 제조를 위해 ART 200 mg을 무수 메탄올 1 mL에 녹이고, 2-메틸이미다졸 2 g(용매: 무수 메탄올 8 mL)을 얻은 ART 용액에 서서히 첨가했습니다. 자기 교반 하에 질산 아연 0.2 g(용매: 무수 메탄올 1 mL)을 서서히 첨가했습니다. 최종적으로 용액 부피를 15 mL로 조절하고 10분간 교반해 연한 백색 용액을 얻었습니다. 10,000 rpm으로 원심분리 후 시료를 메탄올로 3회 세척했습니다. 상층액으로 ART 함량을 측정하고, 침전물을 동결건조해 고체 상태로 얻어 추후 사용했습니다.

TA-Fe/ART@ZIF 나노입자 제조를 위해 TA 용액(탈이온수 중 40 mg/mL, 2 mL)을 ART@ZIF 용액(10 mg/mL, 4 mL)에 서서히 첨가했습니다. 20분간 교반 후 5 mg/mL FeSO₄를 위 용액에 서서히 첨가했습니다. 30분간 반복 교반 후 암자색 용액을 얻었습니다. 최종적으로 10,000 rpm 원심분리로 침전물을 수집했습니다. 침전물을 탈이온수로 3회 세척하고 동결건조해 TA-Fe/ART@ZIF를 얻어 추후 사용했습니다.

특성 분석

TEM(JEM-1230; JEOL, 도쿄, 일본)으로 나노입자 각 부분의 형태학적, 원소 조성을 분석했습니다. 동적광산란과 제타 전위(DLS; 제타사이저 나노 시스템, 말번 인스트루먼트, 말번, 영국)로 나노입자 크기와 전기적 안정성을 평가했습니다. 푸리에 변환 적외선 분광법(VERTEX 70; 브루커, 브레멘, 독일)과 열중량 분석으로 나노입자 구성 성분을 분석했습니다. X선 광전자 분광법(XPS) 측정은 PHI 5000 버사 프로브 III(피지컬 일렉트로닉스)로 수행했습니다. TA-Fe/ART@ZIF 소재의 원소 조성은 EDX(칼 자이스 모델: Neon-40)로 수행했습니다.

캡슐화 효율 및 약물 탑재량 측정

고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)(애질런트 1200; 애질런트 테크놀로지스, 산타클라라, CA)로 상층액의 ART 양을 측정했습니다. ART의 약물 탑재율과 캡슐화율은 다음과 같이 계산할 수 있습니다:

$${\text{약물 탑재율}}(\%) = \frac{{{\text{실제 NPs 내 캡슐화된 약물량}}}}{{{\text{NPs 양}}}} \times 100\%$$

$${\text{캡슐화 효율}}\% = \frac{{{\text{실제 NPs 내 캡슐화된 약물량}}}}{{{\text{사용된 초기 약물량}}}} \times 100\%$$

TA-Fe/ART@ZIF 나노입자 체외 방출 및 pH 반응성

2 mg 나노입자로 처리된 투석막을 pH 7.4와 5.0의 인산염 완충 식염수(PBS) 50 mL에 각각 넣고 37°C에서 지속적으로 흔들어주었습니다. 투석막 밖 용액을 실험 개시 후 15분, 30분, 45분, 1시간, 2시간, 4시간, 6시간, 8시간, 10시간에 채취했습니다. 완충 용액의 ART 함량을 HPLC로 측정했습니다.

세포 배양

MDA-MB-231과 L929 세포주를 미국형배양보존기관(ATCC, 마나사스, VA, 미국)에서 구입했습니다. 세포는 RPMI-1640 배지(솔라바이오, 베이징, 중국)에서 37°C, 5% CO₂, 습도 조건으로 배양했으며, 10% 태아 소 혈청(사이클론, 유타, 미국), 100 µg/mL 피루브산 나트륨, 페니실린, 스트렙토마이신(솔라바이오, 베이징, 중국)을 첨가했습니다.

체외 세포 독성 시험

세포 생존율은 문헌 절차[28, 29]에 따라 MTT 분석으로 측정했습니다.

MDA-MB-231 세포와 L929 세포를 표준 세포 배지로 96웰 플레이트(웰당 5,000 세포)에 배양하고 5% CO₂, 37°C에서 24시간 배양했습니다. 웰 내 유체를 버리고, PBS와 ART, TA-Fe/ZIF, TA-Fe/ART@ZIF, 데페록사민(DFO, MedChemExpress, 상하이, 중국), Z-VAD-FMK(MedChemExpress, 상하이, 중국), 페로스타틴-1(Fer1, MedChemExpress, 상하이, 중국) 다양한 농도를 포함한 무혈청 배지 100 µL을 웰당 첨가했습니다. 48시간 후 웰당 10 µL MTT(5 mg/mL)를 첨가하고 4시간 추가 배양했습니다. 마지막으로 자동 효소 마커(바이오텍 인스트루먼트, 미국)로 각 웰 흡광도를 측정했습니다. 결과는 세포 생존율 백분율로 표현했습니다.

칼세인-AM 염색 분석

MDA-MB-231 세포를 24웰 플레이트(웰당 2×10⁴ 세포)에 배양하고 24시간 배양했습니다. 이후 TA-Fe/ART@ZIF 나노입자 다양한 농도로 세포를 처리하고 24시간 후 배지를 버리고, 칼세인-AM(베이오타임 바이오테크, 상하이, 중국)으로 암실에서 4°C, 20분간 염색한 후 형광 역현미경(올림푸스, 도쿄, 일본)으로 관찰했습니다.

아포토시스 유세포분석

MDA-MB-231 세포를 6웰 플레이트에 웰당 2.5×10⁵ 세포 밀도로 동일한 조건에서 배양했습니다. PBS, ART, TA-Fe/ZIF, TA-Fe/ART@ZIF를 24시간 처리했습니다. 이후 세포를 원심분리해 6웰 플레이트에서 수집했습니다. 프로피듐 요오드와 앤신 V 이중 염색(앤신 V-FITC 키트; 베크만 쿨터, 마르세유, 프랑스) 후 유세포분석으로 검출했습니다.

체외 활성산소종(ROS) 측정 분석

세포내 ROS 함량은 ROS 형광 프로브(디클로로-디하이드로-플루오레세인 디아세테이트(DCFH-DA), 베이오타임 바이오테크, 상하이, 중국)로 측정했습니다. MDA-MB-231 세포를 6웰 플레이트(웰당 2.5×10⁵ 세포)에 배양하고 5% CO₂, 37°C에서 24시간 배양했습니다. 웰 유체를 버리고, 다음과 같이 처리했습니다: 블랭크 대조군(무혈청 배지), 양성 대조군, 실험군(나노입자 다양한 농도). 37°C에서 8시간 배양 후 각 웰에 0.1% DCFH-DA를 첨가하고 30분간 배양했습니다. DCFH-DA에 반응하지 않는 세포를 PBS로 제거하고 형광 역현미경(올림푸스, 도쿄, 일본)으로 관찰했습니다.

말론디알데히드(MDA) 및 GSH 함량 측정

MDA 분석 키트(TBA 법; 지안청 바이오엔지니어링, 난징, 중국)와 GSH 분석 키트(베이오타임 바이오테크, 상하이, 중국)로 세포내 MDA와 GSH 수준을 측정했습니다. PBS, ART, TA-Fe/ZIF, TA-Fe/ART@ZIF 처리 후 MDA-MB-231 세포를 수집해 계수했습니다. 키트 지침에 따라 세포내 MDA와 GSH 함량을 결정했습니다.

웨스턴 블롯 분석

다른 나노입자로 처리된 MDA-MB-231 세포를 RIPA 용해 버퍼로 용해했습니다. 단백질 농도 결정 후, 다른 시료 단백질을 10% SDS-PAGE 겔로 분리해 니트로셀룰로오스 막으로 전이했습니다. 니트로셀룰로오스 막을 0.5% BSA 단백질 용액으로 1시간 차단한 후, 1차 항체와 4°C에서 24시간 배양했습니다. TBST로 1차 항체를 씻어내고 상온에서 2시간 해당 2차 항체와 배양했습니다. 니트로셀룰로오스 막에서 2차 항체를 씻어낸 후 화학발광 용액으로 겔 이미징 시스템에서 관찰했습니다.

생체 내 항종양 실험

모든 동물 실험은 웨이팡 의과대학 윤리위원회 승인을 받았습니다. 건강한 암컷 누드 마우스(나이: 4주, 체중: 13~17 g; 바이탈 리버, 베이징, 중국)에 150 µL 인산염 완충 식염수 중 5×10⁶ MDA-MB-231 세포를 투여했습니다. 종양 부피가 70~120 mm³로 증가하면 마우스를 무작위로 4그룹으로 나눴습니다. 각 그룹 마우스를 PBS, ART(20 mg/kg), TA-Fe/ZIF(80 mg/kg), TA-Fe/ART@ZIF(100 mg/kg)로 별도 처리했습니다. 각 마우스는 3일마다 복강 내 주사로 처리했습니다. 14일 후 모든 마우스를 안락사시켰습니다. 종양 조직과 중요 장기를 수집해 헤마톡실린-에오신 염색을 수행했습니다.

통계 분석

모든 실험은 최소 3회 반복했습니다. 모든 데이터는 SPSS 22.0 소프트웨어(IBM, 아르몽크, 미국)로 통계 분석했습니다. 결과는 평균 ± 표준편차로 표현했습니다. p값 < 0.05를 통계적 유의성으로 간주했습니다.

결과 및 논의

TA-Fe/ART@ZIF 나노입자 특성 분석

먼저, 문헌 절차[30]에 따라 메탄올, 아세트산 아연, 2-메틸이미다졸, ART로부터 상온에서 ART@ZIF 나노입자를 합성했습니다. 안정적인 금속-폴리페놀 초분자 막을 TA와 아연 이온을 볼텍싱해 ART@ZIF 템플릿 주위에 신속히 형성했습니다. 보고된 자성 나노입자[31,32,33]와 비교해 TA-Fe/ART@ZIF는 가혹한 화학 반응이나 수열 반응 없이 MOF 표면에 TA-Fe 막을 형성하는 자기조립 법으로 제조되었습니다. 더 중요하게, TA-Fe/ART@ZIF 나노전달체는 낮은 pH에서 촉발돼 ART와 Fe(II)를 방출하며, 이는 ART의 엔도페록시드에 의해 추가로 촉매돼 탄소 중심 자유 라디칼을 생성해 페롭토시스를 현저히 강화합니다. 첫 원심분리 상층액으로 HPLC 측정 캡슐화 효율은 66.7%였습니다. TA-Fe/ART@ZIF 나노입자로 얻은 상층액에서 계산된 ART 약물 탑재량은 11.4%였습니다. FTIR 분광법(그림 2a)에 따르면 ART 특성 흡수 피크인 1,738 cm⁻¹의 카르보닐 결합과 724 cm⁻¹의 과산화 가교[34]가 TA-Fe/ART@ZIF 나노입자에서 관찰되어 ART가 나노입자에 성공적으로 캡슐화됨을 나타냈습니다. 다음, 열중량 분석 결과 ART가 온도 약 400°C로 증가할 때 완전히 소멸됨을 보여주었습니다(그림 2b). TA-Fe/ZIF 나노입자와 비교해 TA-Fe/ART@ZIF에서 ART가 전체 중량의 7.1%를 차지함을 발견했는데, 이는 HPLC 분석 결과와 기본적으로 일치합니다.

TEM 결과 ZIF-8과 ART@ZIF가 유사한 균일한 육각형 형태를 보이며 입자 크기 분포가 약 100 nm로 결정되었습니다(그림 3a, b). TA-Fe/ART@ZIF 나노입자는 구형 형태를 보이며 입자 크기 분포는 150 nm였습니다. 완전 ART@ZIF와 비교해 Fe(II)와 TA로 코팅된 TA-Fe/ART@ZIF는 뚜렷한 코어-쉘 구조를 보이며 TA-Fe 막 크기는 약 30 nm였습니다(그림 3a). 또한 형성된 나노입자의 영역 원소 매핑 분석을 수행했습니다. 영역 원소 매핑은 TA-Fe/ART@ZIF 나노입자 주변이 Fe 원소로 둘러싸여 있음을 확인해 Fe(II)와 TA가 성공적으로 코팅됨을 입증했습니다(그림 3b). XPS 측정으로 TA-Fe/ART@ZIF 복합체의 표면 원소 조성과 상호작용을 조사했습니다. TA-Fe/ART@ZIF의 와이드-스캔 XPS 스펙트럼은 추가 파일 1: 그림 1s에 나와 있습니다. 약 285, 408, 531, 737, 1036 eV에서 나타나는 주요 피크는 각각 C 1s, N 1s, O 1s, Fe 2p, Zn 2p와 관련되어 TA-Fe/ART@ZIF 나노복합체 형성을 입증합니다. 또한 TA-Fe/ART@ZIF의 EDS 매핑 이미지는 추가 파일 1: 그림 2s에 나와 있습니다. 탄소(C), 질소(N), 산소(O), 철(Fe), 아연(Zn) 원소에 해당하는 피크가 XPS 스펙트럼과 잘 일치함을 명확히 알 수 있습니다. Fe(II) 양을 증가시킴에 따라 TA-Fe/ART@ZIF 나노입자의 수동적 직경이 증가함을 발견했습니다(추가 파일 1: 그림 3s). 코팅을 추가 확인하기 위해 다양한 나노입자의 제타 전위를 측정했습니다. ART@ZIF 입자에 TA-Fe(II) 층 형성으로 TA의 산성 특성으로 표면 제타 전위가 +21 mV에서 -19.5 mV로 이동했습니다(추가 파일 1: 그림 4s). 선행 문헌 보고[30]에 따르면 TA 구조의 풍부한 폴리페놀 기는 기질 코팅 능력뿐만 아니라 전이 금속 이온(Fe, Zn)과 배위해 금속-페놀 복합체를 형성할 수 있습니다. Zn²⁺와 Hmim을 혼합해 용액을 만들면 다량의 Zn²⁺ 이온이 ART@ZIF 입자 표면에서 배위하므로 ART@ZIF 제타 전위는 +21 mV입니다. TA의 페놀 기(pKa 8.5)는 탈양성자화되어 음전하를 띠며 양전하 Zn²⁺과 상호작용해 ART@ZIF 표면에서 TA-Fe 막 성장을 촉진합니다. 약물 전달은 운반체를 선호하므로 안정성은 의약적 적용에 중요한 요소입니다. 나노입자 안정성은 PBS에 분산시켜 1주일간 입증했습니다. 추가 파일 1: 그림 5s에 보인 바와 같이 입자 크기가 연구 기간 동안 바람직한 크기와 안정성을 보였습니다.

TA-Fe/ART@ZIF 체외 방출 및 세포독성

다음으로 TA-Fe/ART@ZIF가 pH 반응성 분해 거동을 가지는지 연구하기 위해 중성과 산성 조건에서 나노입자로부터 ART 방출을 조사했습니다. 그림 4a에 보인 바와 같이 산성 조건에서 나노입자는 1시간 내 약 58% ART를 신속히 방출할 수 있습니다. 그러나 중성 조건에서는 나노입자가 극소량의 ART만 느리게 방출합니다. 또한 투석막 외부 용액을 수산화나트륨으로 처리하는 동안, pH = 5.0 그룹 용액이 수산화나트륨과 반응해 상당한 백색 침전물을 생성했습니다. 그러나 이 현상은 pH = 7.4 그룹에서 관찰되지 않았습니다.

가설에 따르면 이 백색 침전물은 산성 조건에서 나노입자로부터 아연 이온과 알칼리가 해리돼 형성된 수산화 아연 침전물입니다. 종합적으로 이 증거들은 우리 나노입자가 산성 조건에서 해리 능력을 가짐을 성공적으로 보여줍니다.

TA-Fe/ART@ZIF 나노시스템 설계에서 TA-Fe(II)와 ZIF 구조는 종양 미세환경의 산성 조건에서 캡슐화된 ART와 Fe(II)를 방출하도록 소실됩니다. 세포내 Fe(II) 수준 상승은 철 매개 엔도페록시드 가교 절단을 통해 ART를 라디칼로 분해해 페롭토시스 효과를 현저히 강화합니다. 이에 MTT 분석으로 나노시스템의 MDA-MB-231 세포와 L929 세포에 대한 세포독성을 연구했습니다. ART와 비교해 TA-Fe/ART@ZIF 나노입자가 MDA-MB-231 세포에 더 큰 세포독성을 보였습니다(그림 4b) 그리고 정상 세포에 낮은 세포독성을 보였습니다(그림 4c). TA-Fe/ART@ZIF 나노입자는 MDA-MB-231 세포 활성을 53.9% 억제한 반면, 동일 농도 ART는 전체 세포의 24.1%만 억제했습니다. 칼세인-AM 염색 실험 결과 TA-Fe/ART@ZIF 나노입자 농도 증가에 따라 생존 MDA-MB-231 세포 수가 점차 감소함을 확인했습니다(그림 4d).

TA-Fe/ART@ZIF의 MDA-MB-231 세포에서 ROS 생성 강화

ART는 철 매개 엔도페록시드 가교 절단으로 생성된 ROS를 통해 항암 활성을 발휘하는 것으로 알려져 있습니다[35, 36]. 따라서 2′,7′-디클로로디하이드로플루오레세인 디아세테이트(DCHF-DA) 프로브[37]로 TA-Fe/ART@ZIF의 ROS 생성 효율을 조사했습니다. 그림 5에 보인 바와 같이 ART와 TA-Fe/ZIF 처리 세포에서 무처리 그룹 대비 약간 강한 형광 신호가 관찰되어 ART와 Fe(II) 이온이 ROS 생성을 유도할 수 있음을 나타냈습니다. 대조적으로 TA-Fe/ART@ZIF 나노약물 처리 세포에서 강한 형광 신호가 관찰되어 ART의 Fe(II) 매개 엔도페록시드 절단으로 생성된 원하는 ROS 수율을 입증했습니다. 세포 내 제조 나노시스템이 분해돼 Fe(II) 축적을 일으키며, 이는 ROS 생성을 현저히 강화합니다. ART와 그 유도체의 항암 효과는 DNA 손상 반응, 라이소좀 매개 이화 과정인 거대자가포식, 산화 스트레스 등 다양한 세포 과정을 통한 아포토시스 유도 능력에 기인합니다[13, 35, 38]. 또한 ART의 철 매개 엔도페록시드 가교 절단이 다수 암세포 유형에서 세포내 산화 균형에 영향을 미쳐 페롭토시스를 유도할 수 있다는 보고도 있습니다[11]. 산화 불균형 기반 페롭토시스 유도는 Fe(II) 추가로 더욱 증폭될 수 있습니다. Fe(II)가 ART를 활성화하는 동시에 세포내 과산화수소와 반응해 펜톤 반응으로 하이드록실 자유 라디칼을 생성해 종양 세포에서 ART의 아포토시스 유도 효과를 강화합니다.

TA-Fe/ART@ZIF의 MDA-MB-231 세포에서 아포토시스 및 페롭토시스 유도

한편, 세포 사멸과 Fe(II) 역할을 조사하기 위해 철 킬레이터 데페록사민, 아포토시스 억제제 Z-VAD-FMK, 페롭토시스 억제제 페로스타틴-1로 이 세포들을 구제했습니다. 예상대로 Fe(II) 청소제인 데페록사민이 세포 사멸을 명백히 차단해 Fe(II)의 중요한 역할을 시사했습니다. 또한 MDA-MB-231 세포 생존율이 아포토시스와 페롭토시스 억제제로 31.4%에서 각각 56.3%와 76.0%로 유의미하게 향상되었습니다(그림 6a), 이는 TA-Fe/ART@ZIF 나노입자 매개 세포 사멸에서 아포토시스와 페롭토시스의 중요성을 강조합니다. 또한 앤신 V-FITC 기반 분석을 유세포분석을 통해 수행해 아포토시스 정도를 정량적으로 결정했습니다. 결과에 따르면 TA-Fe/ART@ZIF 나노입자가 MDA-MB-231 세포 21.8%에서 아포토시스를 유도할 수 있습니다(추가 파일 1: 그림 6s). 이 비율은 ART 기록보다 높았으며, 아포토시스가 TA-Fe/ART@ZIF 나노입자 매개에 관여하지만 주원인은 아님을 시사합니다.

페롭토시스의 공통 특징은 내인성 지질 과산화입니다[39]. 지질 과산화 생성물인 MDA[40]를 조사해 페롭토시스 정도를 평가했습니다. 결과 TA-Fe/ART@ZIF 나노입자가 대조군 대비 약 2.5배 높은 MDA 수준을 보였습니다(그림 6b). 이는 나노전달체로 풍부해진 Fe(II)와 이에 따른 지질 라디칼 수준 상승 때문으로 추정됩니다. 세포 내 주요 항산화 성분 중 하나인 세포내 GSH는 페롭토시스와 함께 감소합니다[41]. GSH의 페롭토시스 내 중요 역할을 고려해 TA-Fe/ART@ZIF 나노입자 처리 후 세포내 GSH 수준을 평가했습니다. GSH가 대조군 처리 세포 대비 유의미하게 감소했습니다(그림 6c). 이는 TA-Fe/ART@ZIF 나노입자에 의한 Fe(II) 매개 ART 활성화 중심으로 GSH 고갈과 산화 불균형에 대한 강력한 증거를 제공합니다. 다음, 웨스턴 블로팅으로 TA-Fe/ART@ZIF 나노입자의 GPX4 활성 영향[42]을 이해했습니다. TA-Fe/ART@ZIF 나노입자가 ART보다 GPX4 활성을 더 유의미하게 억제함을 관찰했습니다(그림 6d). 이 데이터들도 최고 수준의 GSH 고갈과 잘 일치했습니다.

생체 내 항종양 실험

우리는 종양 보유 누드 마우스에서 피하 이종이식 종양 억제로 나노입자의 MDA-MB-231 세포에 대한 생체 내 항종양 효능을 평가했습니다. 14일 치료 동안, 다른 그룹들에 비해 TA-Fe/ART@ZIF 나노입자가 Fe(II)-ART 반응을 통한 풍부한 ROS 생성 결과로 MDA-MB-231 이종이식 종양 성장을 유의미하게 억제했습니다(그림 7a). 또한 모든 실험 그룹에서 체중 유의미한 차이가 없었습니다(그림 7b), 이는 TA-Fe/ART@ZIF가 무시할 만한 부작용을 가짐을 나타냅니다. 치료 효과를 추가 연구하기 위해 14일 처리 후 종양과 다른 정상 조직을 H&E 염색으로 검사했습니다. 그림 8에 보인 바와 같이 TA-Fe/ART@ZIF가 종양 조직에서 가장 넓은 세포 사멸 영역을 유발했으며, 정상 조직에서는 명백한 손상과 아포토시스가 없었습니다. 전반적으로 이 결과들은 TA-Fe/ART@ZIF 매개 요법이 항암 효능뿐만 아니라 SFT-MB 매개 요법에서 낮은 급성 전신 독성도 가짐을 입증했습니다.

결론

요약하자면, 페롭토시스는 현재 만연한 치료의 불가피한 장벽을 극복하는 독점적 이점을 가지므로 TNBC 치료에 잠재적 치료제가 될 수 있습니다. 여기서 우리는 TA-Fe(II)로 ZIF 나노입자 표면을 코팅하고 ART를 캡슐화한 배위 구동 자기조립 기반 ART용 아연 공급 나노전달체를 설계해 강화된 페롭토시스를 달성했습니다. 나노전달체는 약산성 미세환경에서 용해돼 ART와 Fe(II)를 방출하며, 이는 높은 수준의 세포내 ROS와 MDA를 유발하고 GSH와 GPX4 감소와 동반돼 체외 및 생체 내 강력한 종양 성장 억제와 항암 효능을 이끕니다. 이 연구는 페롭토시스 나노의약품 효능 강화의 새로운 접근법과 TNBC 치료를 위한 새로운 방향을 제공합니다. TA-Fe/ART@ZIF 유도 페롭토시스의 생체적합성과 포괄적 기전은 향후 연구에서 보장되어야 합니다.