고체 나노포어를 통한 DNA 전위 제어

시간적 해결

고체 나노포어를 통한 DNA 전위 속도는 최대 0.01–1 μs/base[30]로 매우 빠르기 때문에 상용 패치 클램프로 수집한 효과적인 데이터는 거의 없습니다. 이와 같이 봉쇄 전류 신호로 모든 베이스를 구별하는 것은 불가능하다. 그래핀, MoS₂와 같은 2D 물질의 고체 상태 나노 기공의 DNA 전위 속도 , WS₂ , 및 h-BN은 그림 1에 나와 있습니다. 이상적으로는 각 뉴클레오티드의 신호를 만족스럽게 기록할 수 있도록 나노포어에서 DNA 전위 속도가 1–100 bp/ms여야 합니다[32].

2D 고체 나노 기공의 DNA 전위 속도 [18, 20,21,22,23, 25, 27, 31]. 빨간색 점선은 100 bp/ms

이러한 배경에서 DNA의 전위 속도를 늦추는 것은 많은 연구자들이 추구하는 중요한 목표이다. 고체 나노 기공 검출의 시간적 분해능을 향상시키기 위해 DNA 전위를 늦추기 위해 다양한 방법이 개발되었습니다. 일반적인 방법은 온도[33], 전해질 점도[27], 구동 전압[34], 이온 농도[35], 나노포어의 표면 전하 밀도[36]와 같은 실험적 요인의 영향을 DNA의 변화로 바꾸는 것이다[36]. 그것을 통한 이식. Wanunu et al. [33] 온도, 전압 및 DNA 길이를 변경하여 고체 상태 나노 기공을 통한 dsDNA 전위를 늦추는 데 집중했습니다. 또한 Feng et al. [27]은 실온 이온성 액체를 기반으로 하는 점도 구배 시스템이 MoS₂를 통한 DNA 전위의 역학을 제어하는 ​​데 사용할 수 있음을 보여주었습니다. nanopores, 실온 이온성 액체의 높은 점도가 373 bp/ms의 최적의 단일 뉴클레오티드 전위 속도를 제공함을 입증했습니다.

많은 접근 방식이 DNA 전위 속도를 줄이고 이온 전류 검출을 용이하게 할 가능성이 있지만 여전히 DNA 시퀀싱에 대한 요구 사항을 충족하지 못합니다. 따라서 나노포어를 통한 DNA의 통과를 제어하기 위한 보다 근본적인 방법을 개발할 필요가 있습니다. 여기에서는 시간적 해상도를 향상시키기 위해 나노포어 구조와 정량적 DNA 이동을 제어하는 ​​방법에 대해 논의합니다.

2개의 나노포어 시스템

연구원들은 동일한 분자를 여러 번 제어 가능하게 감지할 수 있는 DNA 분자 전위를 조작하기 위해 2-나노포어 시스템을 사용했습니다. 마이크로미터 크기의 공동 구획으로 분리된 2개의 적층된 나노포어[37](그림 2a)는 일정 시간 동안 DNA 분자를 가두어 제어 가능하게 방출할 수 있습니다. DNA 분자의 역학은 전위에 대한 직접적인 전기적 증거를 제공하는 상관 분석을 통해 두 기공의 신호에서 추론할 수 있습니다. 또한, 2층 나노포어 시스템의 엔트로피 장벽으로 인해 DNA 분자의 브라운 운동이 제한될 수 있으며, 이는 나노포어의 DNA 시퀀싱 정확도를 향상시킬 수 있습니다. 단일 분자 감지 기술과 비교하여 DNA 분자는 단일 기공을 앞뒤로 통과시키는 대신 여러 기공을 직렬로 배열하여 2층 나노 기공 시스템에서 여러 번 측정할 수 있습니다[39].

아 나노포어 DNA 검출에 사용되는 2층 나노포어 시스템의 개략도[37]. ㄴ 나노포어 DNA 검출에 사용되는 이중 나노포어 시스템의 개략도 [38]

이중 나노 기공 시스템은 분자 수송을 제어하고 두 기공 사이의 분자를 효율적으로 연결하는 또 다른 방법을 제공합니다. 그것들은 DNA 조작을 위한 라벨이 없는 기계론적 접근입니다[40]. 이중 나노 기공 시스템에는 동일한 고체 상태 막 내에서 두 개의 독립적으로 주소 지정이 가능하고 인접한 나노 기공이 있습니다. 나노포어 중 하나를 통해 DNA 분자가 전기영동으로 통과하는 동안 단일 DNA 분자가 두 포어에 포획되어 두 나노포어 사이에 "줄다리기"가 발생할 수 있습니다[38](그림 2b). 따라서 DNA 분자의 다른 끝 부분에 힘이 가해져서 움직임이 느려지고 심지어 완전히 정지됩니다. 이중 나노 기공 시스템은 고체 상태의 나노 기공에서 DNA의 기계적 트래핑에 대한 새로운 경로를 열어주며, 표지가 없고 높은 신호를 갖는 장점으로 광범위한 생체 분자를 측정할 수 있는 유망한 기술입니다. 대 잡음비 및 저렴한 비용. 그것은 DNA 분자를 효율적으로 가두고 가두어 DNA 전위를 늦출 수 있으며 DNA에 대한 이 나노규모 줄다리기의 물리학을 연구하는 데에도 사용할 수 있습니다[41].

광학 트랩 나노포어

광학 트랩 나노포어는 광학 핀셋이 크기가 수십 나노미터 미만인 입자를 트랩할 수 있도록 합니다. 이것은 단백질[42], DNA 단편[43], 기타 생체분자[44]와 작은 바이러스[45]의 광학적 포획을 가능하게 합니다. 광학 트랩 나노포어의 기본 이론은 자기 유도 역작용 광학 트랩이다[46]. 나노포어 어레이의 영역에 초점을 맞춘 레이저 빔은 구멍의 금속층 가장자리에 고출력 밀도 국소 라이트 필드를 형성합니다. 입자가 로컬 라이트 필드 사이를 이동할 때 로컬 광 전송에 큰 변화를 일으킬 수 있으며, 이는 차례로 입자에 큰 광학 및 유전력을 생성합니다. 이중 나노홀 구조는 포획된 입자의 크기 병목 현상을 깨는 데 사용됩니다. Muhammad et al. [47]은 20nm 실리카와 Au 나노입자가 있는 광학 트랩 나노포어의 잠재적 사용을 보여주었다. 이중 나노홀의 덤벨 모양을 Au 필름으로 밀링하고, 현탁된 Si_x를 통해 25nm 나노포어를 뚫었습니다. N_y 그림 3a와 같이 이중 나노홀 중간에 멤브레인. 나노포어를 통해 나노입자를 구동하는 전기영동력은 구멍의 가장자리를 통과할 때 이중 나노홀의 끝단 사이에 존재하는 자기유도 역작용 플라즈몬력이 전기영동력에 반대하여 나노입자의 속도를 감소시킨다. 결과는 광학 트래핑이 전기 영동 전위 시간을 4배까지 연장한다는 것을 보여주었습니다. Kim et al. [43] 단일 나노포어의 나노플라즈몬 구조를 이용하여 플라스미드 DNA와 람다 DNA의 광학적 포획을 실현하였다. 이 기술은 DNA 검출을 위한 잠재적 응용 프로그램이 있으며 병렬 검출을 실현하기 위해 다중 로컬 라이트 필드를 설정할 수 있습니다. 그러나 고주파 이온 전류 진동은 DNA의 전류 검출 결과에 영향을 미칠 수 있습니다. 이것은 나노포어의 입구를 통해 나노입자가 위아래로 뜨게 하는 전기영동과 자체 유도 역작용 힘 사이의 경쟁 때문일 수 있습니다.

아 광학 트랩 나노포어 칩의 개략도 [47]. ㄴ 자기유도 백액션 시스템의 개략도

광학 핀셋

광학 핀셋은 나노 기공을 통한 분자 전위를 제어하는 ​​데 사용할 수 있으며 최근 몇 년 동안 일반적으로 사용되었습니다. 2006년 Keyser et al. [48] ​​SiN_x를 통한 DNA 전위를 제어하기 위해 광학 핀셋을 적용함으로써 전기영동과 기계적 힘 사이의 분자 줄다리기를 처음으로 시연했습니다. 나노포어. 이 시스템은 단순한 후크 스프링으로 작동하며 비드의 장력은 후크의 법칙에 따라 계산할 수 있습니다. F _오 =-k _트랩 Z , 여기서 F _오 광학적 힘, k _트랩 는 변위 방향을 따른 트랩 강성이며 Z 는 비드[48]의 선형 변형입니다. 집속된 레이저 빔의 교차에서 DNA-tethered 폴리스티렌 비드를 가두는 광학 핀셋 방법은 3차원에서 DNA-tethered 폴리스티렌 비드를 조작할 수 있으며 그림 4a와 같이 피코-뉴턴 범위의 힘 감도를 가지고 있습니다. . 나노포어 내부에 전위 DNA를 가두기 위해 장력을 조정하여 전기장 힘(F _엘 ) DNA에. 따라서 장력은 DNA 전위의 속도를 줄이고 DNA 분자를 나노포어 밖으로 끌어내는 데 사용될 수 있습니다[52]. 이 시스템은 DNA 시퀀싱에서 상당한 진전을 이룬 핵산 및 단백질의 동시 공간 샘플링 및 고해상도 힘 측정을 허용합니다. 그러나 광학 핀셋 기술은 몇 가지 근본적인 어려움을 겪고 있습니다. 첫째, 많은 수의 나노포어까지 확장하기 어렵다. 둘째, 광학 핀셋의 레이저에 의한 가열은 나노포어를 통한 이온 전류와 노이즈 수준에 강한 영향을 미치므로 광학적으로 포획된 비드가 나노포어에서 수 마이크로미터 떨어져 있어야 합니다[53].

아 나노포어 DNA 검출에 사용되는 광학 핀셋의 개략도[48]. 광학 핀셋 시스템이 평형 상태일 때 광학적 힘(F_ot )는 전기장력(F_el)과 같습니다. ). ㄴ 나노포어 DNA 검출에 사용되는 자기 핀셋의 개략도[49]. 자기 핀셋 시스템이 평형 상태일 때 자기력(F_Mt )는 전기장력(F_el)과 같습니다. ). ㄷ 나노포어 DNA 검출에 사용되는 원자현미경의 개략도 [50]. d 나노포어 DNA 검출에 사용되는 TFFS의 개략도 [51]

마그네틱 핀셋

자기 핀셋은 장력에 의해 DNA 전위를 제어하는 ​​또 다른 방법을 제공하며 자기 핀셋 기술이 DNA 전위를 늦추는 데 효과적임이 입증되었습니다[49]. 이 시스템에서 그림 4b와 같이 DNA 분자는 강한 금-티올[54] 또는 스트렙타비딘-비오틴[49] 상호작용을 사용하여 마이크로미터 크기의 자기 비드에 부착될 수 있습니다. 그런 다음, 인가된 전기장에 의해 DNA의 자유 말단이 나노포어에 포획될 수 있다. 그 후, 작은 간격을 가진 두 개의 자석을 사용하여 자기장의 기울기를 생성할 수 있습니다. 이 기술은 갇힌 DNA에 가해지는 전기력의 균형을 맞춰 전위 속도와 역전기영동을 감소시킬 수 있습니다. 광학 핀셋과 비교하여 자기 핀셋은 대규모 평행력 분광법의 유망한 후보입니다. 이 시스템에서 수백 개의 비드 및 이에 따른 DNA 분자는 수백 개의 나노포어 내에서 동시에 제어될 수 있으며, 이는 많은 주소 지정 가능한 나노포어로 쉽게 확장 가능합니다. 이렇게 하면 분석 프로세스의 속도가 몇 배나 빨라질 수 있습니다. 그러나 광학 핀셋과 비교할 때 자기 핀셋 방식의 한 가지 명백한 단점은 분자의 3차원 제어가 부족하다는 것입니다[55].

힘 감지 프로브

광학 핀셋과 마그네틱 핀셋에 의한 DNA 전위 속도 조절에 상당한 진전이 있었지만, 비드 트래핑 방법은 브라운 운동에 문제가 있어 10nm 미만의 분해능으로 비드의 운동을 제어하기 어렵다[51] . 이를 극복하기 위해 AFM을 사용하여 DNA 전위의 속도를 제어하고[50], 힘과 차단 전류를 동시에 측정할 수도 있습니다. 이 시스템을 사용한 연구에서는 그림 4c와 같이 AFM 프로브 끝에 DNA를 묶은 다음 프로브 홀더에 고정했습니다. 프로브의 움직임을 제어함으로써 DNA 전위를 제어하여 속도를 줄이고 전기영동을 역전시킬 수도 있습니다. 또한, 분자의 길이에 해당하는 표면 위의 높이로 팁을 수축하여 측정을 반복할 수 있습니다. 원자현미경의 도움으로 DNA 탐지는 차단 전류와 원자현미경 힘 측정의 결합된 신호에 의해 탐지 분해능이 크게 향상될 수 있기 때문에 실제와 이론에서 발전했습니다[56]. 그러나 DNA 검출에 나노포어 기술을 적용하는 데에는 여전히 장애물이 있습니다. 즉, DNA 분자가 표면을 통해 상대적으로 마찰이 없는 방식으로 미끄러질 때 0.35–0.72 nm마다 힘(및 전류)의 규칙적인 변동이 간헐적으로 발생합니다. 나노포어. 이러한 변동은 개개의 뉴클레오티드가 개찰구와 같은 움직임으로 나노포어를 통해 번역되기 때문입니다[50].

연구에 따르면 힘 감지 센서로 사용할 수 있는 소리굽쇠는 나노미터 미만의 속도로 나노포어를 통과하도록 DNA를 제어할 수 있습니다[51, 57]. 이 통합 장치를 사용한 연구에서 그림 4d와 같이 소리굽쇠의 한 갈래에 붙은 프로브 팁에 DNA 분자가 부착되었습니다. 서브 나노미터 정확도를 갖는 나노 위치 결정 시스템이 소리굽쇠를 잡는 데 사용되었습니다[51]. 프로브 팁의 위치는 소리굽쇠 기반 피드백 힘 센서로 감지할 수 있으며 나노미터 위치 지정 시스템을 조작하여 제어할 수 있습니다. 이 이동 속도는 광학 핀셋으로 조작된 DNA보다 10배 느리고 고체 상태의 나노 기공을 자유롭게 통과하는 DNA보다 1000배 느립니다[57]. 기존 원자현미경과 비교할 때 소리굽쇠는 더 빠른 스캔 동작을 제공할 수 있고 액체에 잠겼을 때 높은 힘 감도를 가질 수 있습니다. TFFS를 나노포어와 통합함으로써 나노포어를 통한 이온 전류, 팁 위치 및 팁 진동 진폭은 나노포어를 통해 DNA 분자가 통과하는 동안 동시에 측정될 수 있습니다.

Si 프로브

위의 모든 방법, 즉 자기 핀셋, 광학 핀셋, AFM 및 TFFS는 나노포어 위치를 스캔해야 합니다. 그들은 DNA가 나노포어를 통과할 수 있도록 하기 위해 DNA의 유효 길이 내에 나노포어를 위치시켜야 합니다. 나노포어 주소 지정은 이러한 방법의 중요한 부분이지만 칩의 면적보다 큰 실리콘 프로브(그림 5)의 넓은 표면에 DNA를 연결하는 것은 어렵습니다. 이는 고정된 DNA를 쉽게 삽입할 수 있음을 의미합니다. 멤브레인에서 나노포어의 위치를 ​​스캔하지 않고 나노포어. DNA 고정된 Si 프로브와 위치 컨트롤러를 사용하여 나노포어 안팎으로 DNA의 이동을 제어하는 ​​가능성이 입증되었습니다. 이 방법의 어려움은 Si 프로브가 용액에 잠기고 펩타이드 커플링에 의해 DNA에 연결된다는 것입니다. 프로브 표면의 DNA 밀도는 조절이 어려워 나노포어를 동시에 통과하는 여러 개의 DNA가 발생하여 검출 전류에 영향을 미칠 수 있습니다.

나노포어 DNA 검출에 사용되는 DNA 고정된 Si 프로브 시스템의 개략도 [32]

광학 핀셋, 자기 핀셋, 원자력 현미경(AFM) 및 소리굽쇠 기반 힘 감지(TFFS)는 나노포어에서 분자의 실제 힘과 위치를 감지할 수 있으며, 이는 적절한 속도로 나노포어를 통한 DNA 통과를 제어할 수 있을 것으로 기대됩니다. 나노포어를 다루는 어려움은 Si 프로브를 사용하여 피할 수 있습니다. 또한, 2-나노포어 시스템의 사용은 나노포어를 통한 DNA 통과를 제어하고 속도를 늦추는 실행 가능한 방법입니다. 또한, 광학 트랩 나노포어는 미래에 DNA 검출 가능성이 있습니다. 여기에서 우리는 2-나노포어 시스템, 광학 트랩 나노포어, 광학 핀셋, 자기 핀셋, AFM, TFFS 및 Si 프로브와 같은 일부 DNA 제어 방법과 통합된 고체 상태 나노포어의 DNA 전위 속도를 요약했습니다(표 1) .