생분해성, 종양 반응성 나노입자를 이용한 이중 모달 유방암 영상

초록

가스 충전 초음파(US) 조영제는 체내에서 쉽게 붕괴되고 가스가 쉽게 넘쳐 US 영상 효과를 제한합니다. 이 문제를 해결하기 위해 자기공명(MR) 음성 조영제 Fe₃O₄, 형광 염료 Cy5.5, CO₂ 방출 도너(Na₂CO₃)를 탑재한 주사 가능한 가스 생성 다중 모드 시스템을 개발했습니다. 나노입자는 체내 산성 종양 조직에서 이산화탄소(CO₂) 가스를 지속적으로 생성해 초음파 영상에서 종양에 강한 에코 신호를 부여합니다. 또한 나노입자는 종양 조직의 MR 및 형광 영상에 탁월한 효과를 부여합니다. 결과는 이 pH 반응성 NP 시스템이 MR/US/형광 영상에서 좋은 효과를 제공함을 나타냅니다. 이 연구는 다중 모드 종양 영상에 유용한 참고자료를 제공합니다.

서론

임상 실무에서 마이크로버블은 다양한 장기와 혈관의 실시간 영상을 위한 초음파 조영제로 주로 적용됩니다[1-3]. 전통적 초음파 조영제는 일반적으로 공기나 퍼플루오로카본 가스를 둘러싼 지질이나 단백질 같은 물질로 구성됩니다. 마이크로스피어 내 캡슐화된 가스 종은 마이크로버블 결함의 빠른 확산으로 인해 혈액 내 안정성이 낮고 반감기가 짧습니다[4-6]. 게다가 가스 충전 마이크로버블 입자 크기가 보통 크기(약 1-8 μm)여서 조직 외사로 종양 미세환경으로 침투하기 어렵습니다. 따라서 미크론 크기 버블의 혈관 내 영상 적용은 제한됩니다[7]. 이상적 초음파 조영제는 일반적으로 조직 혈관 공간을 통한 수송에 최적 크기, 적절한 음향 효과 지속 시간, 좋은 타겟팅과 생체적합성, 체내 쉬운 배설 등을 가져야 합니다[8, 9]. "가스 생성 나노입자" 개념이 선행 연구에서 제안되었으며, 이러한 나노입자는 초음파 조영 영상용 잠재력을 가집니다[10-12]. 이 가스 생성 나노입자는 현재 가스 충전 마이크로버블보다 성능이 우수하며, 지속적으로 생성된 가스가 강한 초음파 영상을 가능하게 합니다. 가스 생성 나노입자는 투과 및 잔류 효과를 향상시키고, 혈액에서 안정적으로 순환하며 종양 조직에 효과적으로 축적될 수 있습니다[13, 14].

전통적 영상 방법인 자기공명영상(MRI), 컴퓨터 단층촬영(CT), 초음파로는 긴 획득 시간, 높은 방사선량, 낮은 감도 등으로 미세하고 잠복한 종양을 감지하는 것이 여전히 과제입니다[15, 16]. 암 조기 발견을 위해 다른 영상 방법을 통합하고 다중 모달 영상 기술을 개발해 통합 시너지를 달성할 필요가 있습니다[17-19]. 초상자성 산화철(Fe₃O₄) 나노입자는 T2 가중 영상에서 음성 MRI 조영제로 사용될 수 있습니다[20, 21]. Fe₃O₄는 작은 입자 크기, 강한 투과성, 높은 자화, 좋은 대사, 상대적으로 낮은 독성 등 매력적인 전반적 특성을 가집니다[22, 23]. 초기 암 MRI 진단을 위한 Fe₃O₄ 조영제는 높은 이완성과 조영성으로 광범위하게 연구되었습니다[24-26]. 또한 실시간 형광 영상은 우수한 해상도를 가지며 종양 병기 결정, 종양 절제 유도, 치료 효과 모니터링에 유용한 방법이 될 수 있습니다[27, 28].

본 연구에서 이 나노입자는 주로 FDA 승인 생체안전 소재인 폴리(락트산-공-글리콜산)(PLGA)로 캡슐화됩니다[29, 30]. PLGA 입자는 유방암 세포 표면 αvβ3 인테그린에 결합하기 위해 RGD 펩타이드로 수정되고, 체내 형광 영상용 Cy5.5 형광 염료로, MRI에서 T2 음성 조영제 역할을 하는 Fe₃O₄로 캡슐화됩니다(도식 1a). 종양 조직에서 상향 조절된 해당작용으로 더 많은 젖산과 양성자가 세포외 환경에서 생성될 수 있으므로, 종양 조직 pH(6.8-7.2)는 정상 조직(pH 7.4)보다 낮습니다[31-33]. 따라서 PLGA 내 탄산나트륨(Na₂CO₃)을 설계해 종양 조직의 낮은 pH에서 CO₂ 기포를 생성해 초음파 영상에 활용했습니다. 종양 영상에서의 유망한 응용을 검증하기 위해 이 다중 모드 나노입자의 시험관 내 영상 포괄적 특성을 체계적으로 특성화했습니다. 세포독성, 타겟팅 특이성, 종양 조직 내 생체분포를 세 영상 모드로 분석했습니다.

결과 및 논의

Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NP 합성 및 특성 분석

Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NP는 생체적합성 폴리머 PLGA에 Fe₃O₄와 Na₂CO₃, 생분해성 화학 결합을 통한 인테그린 타겟팅 제제를 캡슐화해 RGD 타겟팅 다중 모드 조영제로 설계했습니다(도식 1b).

투과 전자 현미경 이미지는 Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NP가 쉘에서 균일하게 분산된 산화철 입자가 보이는 투명한 구형임을 보여줍니다(그림 1a). 평균 수동적 크기는 동적 빛 산란으로 117.6 nm로 측정됐으며, 평균 분산 지수는 0.234였습니다(그림 1b). 제타 전위 측정으로 NP 표면 전하가 -21.7 mV로 확인됐습니다(그림 1c). 형광 스펙트럼 측정에서 Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD 최대 방출 파장이 685 nm로 나타나 Cy5.5가 PLGA 코어에 성공적으로 캡슐화됐음을 나타냅니다(그림 1d). Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD와 자유 Fe₃O₄ NP 포화 자화 값은 각각 32.6, 42.5 emu/g로 동일했습니다(그림 1e). 이 결과들은 실온에서 나노입자 초상자성 특성을 나타냈습니다. Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD FTIR 스펙트럼에서 N-H 신축 진동과 -OH 흡수 피크가 3432 cm⁻¹ 근처에 나타났습니다. 또한 C=O 신축 진동 강화(1628 cm⁻¹)를 발견했습니다. 비타겟팅 NP와 비교해 타겟팅 NP에서 1735 cm⁻¹ 카르복실기 특성 피크가 현저히 감소했습니다. 결과는 마이크로스피어 표면 카르복실기와 RGD 펩타이드 아민기 간 결합을 보여줍니다. Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NP 시험관 내 결합은 그림 1f에 나와 있습니다.

Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NP 시험관 내 결합

αvβ3 인테그린은 일반적으로 유방암 종양 내피 세포에서 고발현되며 종양 전이를 촉진할 수 있습니다[33-36]. MDA-MB-231 세포에서 αv 인테그린 발현 세포면역형광이 MCF-7 세포보다 훨씬 높았으며, A549 세포를 양성 대조군으로 사용했습니다(그림 2a). NP 세포 섭취는 CLSM으로 연구했습니다(그림 2b). Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NP는 비타겟팅 NP보다 MD-MB-231 세포에 훨씬 높은 결합률을 보였습니다. 형광 이미지는 Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NP가 세포질에 결합함을 드러냈으며, 병합 이미지는 αv 인테그린 발현 위치와 동일함을 보였습니다[37, 38].

세포독성 분석

Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NP 시험관 내 세포독성을 MDA-MB-231 세포에서 CCK8 분석으로 추정했으며, NP 처리한 A549와 MCF-7 세포를 대조군으로 사용했습니다(그림 2c). Fe 농도 5-80 μg/mL 범위에서 A549와 MB231 세포 생존율은 현저히 감소하지 않았고 둘 다 70% 이상이었습니다. 대조적으로 MCF-7 세포는 Fe 농도 40 μg/mL 이상에서 세포 생존율이 약 50%로 현저히 감소했습니다. CCK8 결과는 Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NP가 주어진 농도 범위에서 MDA-MB-231 세포에 현저히 낮은 세포독성을 보임을 입증했습니다.

시험관 내 조영 영상

아가로스 겔 팬텀을 사용해 서로 다른 pH 값(그림 3a)에서 Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NP 시험관 내 성능을 연구했습니다. Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NP 초음파 조영 이미지는 약산성 pH(pH 6.8)에서 pH 7.2에 비해 현저히 향상됐으며, 이는 pH 7.2가 초음파 영상용 충분한 CO₂ 기포를 생성하지 못하기 때문일 것입니다. 대조적으로 NP가 약산성 환경에 있을 때 초음파 영상용 충분한 기포가 생성될 수 있습니다. 이 특성은 종양이 체내에서 높은 조직 이질성과 다양한 pH 수준(pH 6.8-7.2)을 보이는 것과 관련이 있습니다[32, 39, 40]. 초음파 이미지 신호 강도를 분석했습니다(그림 3b). 비타겟팅 NP(pH 7), 비타겟팅 NP(pH 5), 타겟팅 NP(pH 7), 타겟팅 NP(pH 5) 그룹의 블랭크 그룹 대비 신호 강도 비율은 각각 112%, 145%, 167%, 178±4%로, 타겟팅 NP 그룹(pH 5)이 가장 강한 US 신호를 가짐을 명확히 나타냅니다.

시험관 내 MRI 연구에서, Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NP 내 Fe 농도 증가에 따라 T2 가중 신호 강도가 현저히 감소해 이 NP들이 T2 MR 조영제로 사용될 가능성을 나타냈습니다(그림 3c). Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NP 횡방향 이완율(r2)은 19.597 mM⁻¹s⁻¹로 계산됐습니다. 많은 다른 MRI 초상자성 제제보다 횡방향 이완율(r2)이 낮지만, Fe₃O₄ 조성은 r2를 증가시켜 임상용 SPIO 입자 r2보다 2.94배 높았습니다.

Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NP 초음파 조영 영상

Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NP 종양 초음파 영상 잠재력을 입증하기 위해 유방암 이종이식 누드 마우스에 꼬리 정맥 주사로 Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NP를 투여하고 시간에 따른 초음파 이미지를 모니터링했습니다(그림 4a). 주사 전 종양, 간, 피하 영역 이미지를 기록했습니다. 주사 직후 종양 조직 영역은 조영 향상을 보이지 않았습니다. 주사 30분 후부터 종양 영역 향상이 관찰돼 90분간 지속됐습니다. 체내 초음파 결과는 Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NP가 산성 종양 조직에서 충분한 기포를 생성해 초음파 영상용 반향 반사율을 생성함을 보여줍니다. 대조군으로 타겟팅 NP 주사 후 서로 다른 시간에서 간과 피하 조직 이미지도 얻었습니다. 관찰 기간 내내 피하 주사 영역에서 유의한 향상은 발견되지 않았고, 시간이 지남에 따라 감소하는 간 향상은 종양보다 현저히 낮았습니다(그림 4b). 이 결과는 Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NP가 생리적 pH에서 체내 순환 시 초음파 조영 향상용 상당한 양의 CO₂ 기포를 생성하지 않음을 나타냅니다.

Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NP MRI

체내 MRI에서 NP가 종양 특이적 영상에 사용될 수 있음을 입증하기 위해 Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NP를 종양과 근육에 직접 주사했습니다. 결과는 타겟팅 NP 주사 후 종양 영역에서 T2-MR 조영이 현저히 감소했으며, 신호 강도가 주사 후 0분 8875에서 120분 5972로 현저히 감소했습니다(그림 5a, b). 그러나 같은 양 나노입자 주사 시 피하 근육 영역은 훨씬 낮은 T2 신호 감소를 보였습니다. 이 발견은 Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NP가 과민성 인테그린 타겟팅 T2-MR 조영제로 종양 타겟팅 영상에 효과적임을 입증합니다. 꼬리 정맥 주사 그룹에서도 주사 후 24시간 종양에서 T2-MR 영상 조영 현저 감소가 관찰돼 Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NP 높은 종양 축적을 입증했습니다(그림 5c, d). 게다가 간과 신장에서 T2 신호 감소가 관찰돼 NP 내 철 이온이 체내에서 빠르게 청소될 수 있음을 나타냅니다. 따라서 MRI는 PLGA 포장 Fe₃O₄ 나노입자가 향상된 투과성 및 잔류(EPR) 효과를 통한 효율적 수동 종양 타겟팅, 특히 RGD 매개 타겟팅을 보이나 체내에서 분해되고 빠르게 배설됨을 드러냈습니다.

형광 영상 및 조직학

200 μL NP를 마우스에 정맥 주사해 체내 형광 영상을 수행했습니다. RGD 타겟팅 NP 주사 그룹에서 Cy5.5 형광 신호가 종양 영역에서 점진적으로 증가해 주사 후 4시간 피크에 도달해 Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NP가 종양에 효과적으로 축적될 수 있음을 나타냈습니다. 비타겟팅 그룹에서 NP는 주사 후 전신에 분포하고 빠르게 청소돼 장기간 종양에 축적되지 않았습니다(그림 6a). 마우스를 해부해 주요 장기들과 종양을 수집해 시험관 외 형광 영상을 수행했으며, 타겟팅 NP 높은 종양 섭취를 드러냈습니다(그림 6b, c). 타겟팅 NP 주사 마우스 종양 Cy5.5 형광 강도는 비타겟팅 NP 주사 마우스보다 1.5배 높았습니다.

또한 Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NP 종양 특이적 타겟팅을 냉동 종양 절편 조직 형광 영상으로 검증했습니다(그림 7a). αv와 β3 인테그린 항체로 종양 절편 면역형광 염색 결과 종양 조직에서 αvβ3 인테그린 유의한 발현이 드러났습니다. αv와 β3 인테그린 형광을 Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NP Cy5.5 형광과 병합해 공위치 이미지를 얻었습니다. 종양 조직 면역형광 결과는 Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NP가 MB231 악성 유방암에서 αvβ3 인테그린에 특이적으로 결합함을 나타냈습니다. 게다가 Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NP와 비타겟팅 그룹 H&E 염색 비교에서 모든 장기 조직 절편이 정상 병리 형태를 보이고 조직병리학적 손상 반응이 없었습니다(그림 7b). 위 모든 세포독성 및 조직학 분석 결과는 Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NP가 체내 주요 장기 조직에 유의한 독성을 유발하지 않으며, 좋은 생체적합성은 PLGA에 합리적으로 기인할 수 있음을 나타냈습니다.

결론

결론적으로, 위 결과들은 종양 미세환경에서 활성화되는 자기 타겟팅과 가스 생성 시스템을 통한 유방암 MRI에 대한 창의적이고 성공적인 접근법을 입증합니다. Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NP는 MR/초음파/형광 영상 모드에서 우수한 영상 성능과 좋은 생체적합성을 보입니다. 우리 연구는 향상된 다중 모달 영상으로 종양 진단에 강한 잠재력을 보여줍니다.