표적 유방암 영상을 위한 다중 모드 생분해성 종양 미세 환경 민감성 나노 입자

초록

가스 충전 초음파(US) 조영제는 체내에서 쉽게 붕괴되고 가스가 쉽게 넘칠 수 있어 US 영상의 효과가 제한됩니다. 이 문제를 해결하기 위해 MR 음성 조영제 Fe₃를 운반하는 주입 가능한 가스 발생 다중 모드 시스템이 개발되었습니다. O₄ , 형광 염료 Cy5.5 및 CO₂ 기증자 방출 (Na₂ CO₃ ). 나노 입자는 지속적으로 이산화탄소(CO₂ ) 신체의 산성 종양 조직에 가스가 발생하여 초음파 영상에서 종양에 강한 에코 신호를 제공합니다. 또한, 나노 입자는 종양 조직의 MR 및 형광 이미징에 탁월한 효과를 부여합니다. 결과는 이 pH 반응성 NP 시스템이 MR/US/형광 이미징에서 좋은 효과를 제공함을 나타냅니다. 이 연구는 다중 모드 종양 이미징에 유용한 참고 자료를 제공합니다.

소개

임상에서 마이크로버블은 주로 다양한 장기와 혈관의 실시간 영상을 위한 초음파 조영제로 적용된다[1,2,3]. 기존의 초음파 조영제는 일반적으로 공기 또는 과불화탄소 가스를 둘러싸는 지질 또는 단백질과 같은 물질로 구성됩니다. 미세구체에 캡슐화된 가스종은 미세 기포 결함의 급속한 확산으로 인해 혈액 내 안정성이 낮고 반감기가 짧습니다[4,5,6]. 또한, 가스로 채워진 미세 기포의 입자 크기가 일반적으로 크기 때문에(약 1~8 μm), 미세 기포가 조직 유출에 의해 숙주 종양 환경으로 침투하기가 어렵습니다. 따라서, 혈관 내 영상화에서 마이크론 크기의 기포의 현재 적용은 제한적입니다[7]. 이상적인 초음파 조영제는 일반적으로 조직 혈관 공간을 통한 수송을 위한 최적의 크기, 적절한 음향 효과 지속 시간, 우수한 표적화 및 생체 적합성, 신체에서 쉽게 배출되어야 합니다[8, 9]. "가스 발생 나노 입자"의 개념은 이전 연구에서 제안되었으며 이러한 나노 입자는 초음파 조영제 영상에 사용될 가능성이 있습니다[10,11,12]. 이러한 가스 발생 나노 입자는 현재의 가스로 채워진 미세 기포보다 성능이 우수하며 지속적으로 발생하는 가스는 강렬한 초음파 이미징을 가능하게 합니다. 가스를 발생시키는 나노입자는 투과와 체류를 향상시킬 수 있으며, 혈액 내에서 안정적으로 순환하고 종양 조직에 효과적으로 축적될 수 있습니다[13, 14].

자기공명영상(MRI), 컴퓨터 단층촬영(CT), 초음파와 같은 전통적인 영상 방법으로 작고 잠복적인 종양을 감지하는 것은 긴 획득 시간, 높은 방사선량 및 낮은 감도로 인해 여전히 어려운 과제입니다[15 , 16]. 암의 조기 발견을 위한 통합 시너지를 달성하기 위해서는 서로 다른 영상 기법을 통합하고 다중 모드 영상 기술을 개발하는 것이 필요하다[17,18,19]. 초상자성 산화철(Fe₃ O₄ ) 나노 입자는 T2 강조 영상에서 음성 MRI 조영제로 사용될 수 있습니다[20, 21]. Fe₃ O₄ 작은 입자 크기, 강한 침투성, 높은 자화, 좋은 신진 대사 및 비교적 낮은 독성을 포함하여 매력적인 전반적인 특성을 가지고 있습니다 [22, 23]. Fe₃ O₄ 초기 암의 MRI 진단을 위한 조영제는 높은 이완성과 조영제 때문에 광범위하게 연구되어 왔다[24,25,26]. 또한 실시간 형광 영상은 해상도가 우수하여 종양 병기 정의, 종양 절제 안내 및 치료 효과 모니터링에 유용한 방법이 될 수 있습니다[27, 28].

여기서, 이러한 나노입자는 주로 식품의약국(FDA)에서 바이오안전 물질로 사용하도록 승인된 폴리(락트산-코-글리콜)산(PLGA)으로 캡슐화된다[29, 30]. PLGA 입자는 유방암 세포 표면의 αvβ3 인테그린에 결합할 수 있도록 RGD 펩타이드로 변형되고 생체 내 이미징을 위한 형광 염료인 Cy5.5로 변형되며 Fe₃로 캡슐화됩니다. O₄ MRI에서 T2-음성 조영제로 작용하는 것(도식 1a). 세포외 환경에서 더 많은 젖산과 양성자를 생성할 수 있는 종양 조직의 상향 조절된 해당작용으로 인해 종양 조직(6.8–7.2)의 pH는 정상 조직(pH 7.4)보다 낮습니다[31,32,33] . 따라서 우리는 탄산나트륨(Na₂ CO₃ ) CO₂를 생성하기 위해 PLGA에서 초음파 이미징을 위한 종양 조직의 낮은 pH에서 거품. 종양 이미징에서 유망한 응용 프로그램을 확인하기 위해 체외 이미징을 위한 이러한 다중 모드 나노 입자의 포괄적인 특성은 세 가지 이미징 모드로 세포 독성, 표적화 특이성 및 종양 조직의 생체 분포를 포함하여 체계적으로 특성화되었습니다.

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아 Fe₃의 기능 개략도 O₄ /나₂ CO₃ @PLGA/Cy5.5/cRGD NP는 종양으로 표적화된 축적을 통해 CO₂ 생성 산성 종양 조직의 거품, 유방암의 삼중 모드 MR/US/FI 영상화. ㄴ Fe₃ 준비의 개략도 O₄ / 나₂ CO₃ @PLGA/Cy5.5/cRGD NPs.

결과 및 토론

Na₂의 합성 및 특성화 CO₃ /Fe₃ O₄ @PLGA/Cy5.5/RGD NPs

나₂ CO₃ /Fe₃ O₄ @PLGA/Cy5.5/RGD NP는 PLGA의 생체 적합성 폴리머를 Fe₃로 캡슐화하여 RGD 표적 다중 모드 조영제로 설계되었습니다. O₄ 및 Na₂ CO₃ 및 생분해성 화학 결합을 통한 인테그린 표적 제제(도식 1b).

투과 전자 현미경 이미지는 Na₂ CO₃ /Fe₃ O₄ @PLGA/Cy5.5/RGD NP는 껍질에서 볼 수 있는 균일하게 분산된 산화철 입자가 있는 투명한 구체였습니다(그림 1a). 나노입자의 평균 유체역학적 크기는 동적 광산란에 의해 117.6 nm로 측정되었고, 평균 다분산 지수는 0.234였다(그림 1b). NP의 표면 전하는 제타 전위 측정에 의해 -21.7 mV인 것으로 확인되었습니다(그림 1c). 형광 스펙트럼 측정 결과 Na₂ CO₃ /Fe₃ O₄ @PLGA/Cy5.5/RGD는 685 nm에서 최대 방출 파장을 가졌으며 이는 Cy5.5가 PLGA 코어에 성공적으로 캡슐화되었음을 나타냅니다(그림 1d). Na₂의 포화 자화 값 CO₃ /Fe₃ O₄ @PLGA/Cy5.5/RGD 및 무료 Fe₃ O₄ NP는 각각 32.6 및 42.5 emu/g과 동일했습니다(그림 1e). 이러한 발견은 상온에서 나노입자의 초상자성 특성을 나타낸다. Na₂의 FITR 스펙트럼 CO₃ /Fe₃ O₄ @PLGA/Cy5.5/RGD는 N-H 신축 진동과 -OH 흡수 피크가 3432 cm^-1 부근에서 나타남을 보여주었습니다. . 또한 개선 사항(1628 cm⁻¹ )의 C =O 신축 진동. 비표적 NP와 비교하여 1735 cm^-1 에서 특징적인 피크(카복실) 대상 NP의 수가 크게 감소했습니다. 결과는 미소구체 표면의 카르복실기와 RGD 펩타이드의 아미노기 사이의 결합을 보여주었다. Na₂의 시험관 내 결합 CO₃ /Fe₃ O₄ @PLGA/Cy5.5/RGD NP는 그림 1f에 나와 있습니다.

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TEM 이미지(a ) 크기 분포(b ) 제타 전위(c )의 Fe₃ O₄ /나₂ CO₃ @PLGA/Cy5.5/cRGD NPs. d Fe₃의 형광 방출 스펙트럼 O₄ /나₂ CO₃ @PLGA/Cy5.5/cRGD 및 Fe₃ O₄ /나₂ CO₃ @PLGA/cRGD NPs. 이 Fe₃의 자기 히스테리시스 곡선 O₄ /나₂ CO₃ @PLGA/Cy5.5/cRGD NP 및 Fe₃ O₄ NP. 에 표적 Fe₃ 스펙트럼의 FTIR O₄ /나₂ CO₃ @PLGA/Cy5.5/cRGD 및 비표적 PLGA NPs

Na2CO3/Fe3O4@PLGA/Cy5.5/RGD 나노입자의 시험관내 결합

αvβ3 인테그린은 일반적으로 유방암 종양 내피 세포에서 높게 발현되며 종양 전이를 촉진할 수 있습니다[33,34,35,36]. MDA-MB-231 세포에서 αv 인테그린의 발현에 대한 세포 면역형광은 MCF-7 세포에서보다 훨씬 더 높았다; A549 세포는 양성 대조군으로 사용되었습니다(그림 2a). NP의 세포 흡수는 CLSM에 의해 연구되었습니다(그림 2b). 나₂ CO₃ /Fe₃ O₄ @PLGA/Cy5.5/RGD NP는 비표적 NP보다 MD-MB-231 세포에 훨씬 더 높은 결합율을 보였다. 형광 이미지는 또한 Na₂ CO₃ /Fe₃ O₄ @PLGA/Cy5.5/RGD NP는 세포질에 결합하고 병합된 이미지는 αv integrin의 발현과 동일한 위치를 보여주었다[37, 38].

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아 MB231, A549 및 Mcf-7 세포에서 αv 인테그린의 발현에 따른 공초점 형광 이미지. 파란색과 녹색은 각각 DAPI 및 αv 형광을 나타냅니다. ㄴ 표적 Fe₃와 함께 배양된 MB231 세포의 공초점 형광 이미지 O₄ /나₂ CO₃ @PLGA/Cy5.5/cRGD NP 및 비표적 NP. 파란색, 빨간색 및 녹색은 각각 DAPI, Cy5.5 및 α v 형광을 나타냅니다. ㄷ 다양한 농도의 Fe₃와 함께 배양된 MB231 세포의 상대적 생존력 O₄ /나₂ CO₃ @PLGA/Cy5.5/cRGD NPs

세포독성 분석

Na₂의 시험관내 세포독성 CO₃ /Fe₃ O₄ @PLGA/Cy5.5/RGD NP는 CCK8 분석을 사용하여 MDA-MB-231 세포에서 추정되었으며, NP로 처리된 A549 및 MCF-7 세포는 대조군으로 사용되었습니다(그림 2c). Fe 농도 5–80 μg/mL 범위에서 A549 및 MB231 세포의 세포 생존율은 크게 감소하지 않았으며 둘 다 70% 이상이었습니다. 대조적으로, MCF-7 세포는 40 μg/mL 이상의 Fe 농도에서 세포 생존율이 약 50%로 유의하게 감소하는 것으로 나타났습니다. CCK8 결과는 Na₂ CO₃ /Fe₃ O₄ @PLGA/Cy5.5/RGD NPs는 주어진 농도 범위에 걸쳐 MDA-MB-231 세포에서 유의하게 낮은 세포 독성을 나타냈습니다.

체외 조영제

Na₂의 성능을 연구하기 위해 한천 겔 팬텀을 사용했습니다. CO₃ /Fe₃ O₄ @PLGA/Cy5.5/RGD 다른 pH 값에서 시험관 내 NPs(그림 3a). Na₂의 초음파 대조 이미지 CO₃ /Fe₃ O₄ @PLGA/Cy5.5/RGD NP는 pH 7.2에 비해 약산성 pH(pH 6.8)에서 유의하게 향상되었는데, 이는 pH 7.2가 충분한 CO₂를 생성하지 않기 때문일 수 있습니다. 초음파 이미징을 위한 거품. 대조적으로, NP가 약산성 환경에 있을 때 초음파 이미징을 위해 충분한 기포가 생성될 수 있습니다. 이 특성은 생체 내에서 높은 조직 이질성과 다양한 pH 수준(pH 6.8–7.2)을 나타내는 종양과 관련이 있습니다[32, 39, 40]. 그런 다음 초음파 이미지의 신호 강도를 분석했습니다(그림 3b). 비표적화 NP(pH=7), 비표적화 NP(PH=5), 표적화 NP(PH=7), 표적화 NP(PH=5) 그룹의 신호 강도에 대한 신호 강도 비율 빈 그룹은 각각 112%, 145%, 167% 및 178 ± 4%였으며, 이는 표적 NP 그룹(PH =5)이 가장 강한 US 신호를 가졌음을 분명히 나타냅니다.

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아 다른 pH 값(7.2 및 6.8)에서 기록된 표적 NP 및 비표적 NP의 초음파 이미지, 대조군으로서 PBS. ㄴ 신호 강도 비율은 샘플/블랭크로 계산되며, 샘플은 타겟 및 비 타겟 NP의 에코 강도를 나타내고, 블랭크는 PBS의 에코 강도를 나타냅니다. ㄷ Fe₃의 T2 강조 MR 이미지 O₄ /나₂ CO₃ 서로 다른 Fe 농도(0.0625, 0.125, 0.25, 0.5, 1 mM)를 가진 @PLGA/Cy5.5/cRGD NP. d 가로 상대성 이론(r2)은 19.597 mM⁻¹ 입니다. s⁻¹ Fe₃용 O₄ /나₂ CO₃ @PLGA/Cy5.5/cRGD NPs

시험관 내 MRI 연구의 경우 Na₂의 Fe 농도 CO₃ /Fe₃ O₄ @PLGA/Cy5.5/RGD NP가 증가하고 T2 강조 신호 강도가 유의하게 감소하여 이러한 NP가 T2 MR 조영제로 사용할 가능성을 나타냅니다(그림 3c). Na₂의 가로 이완율(r2) CO₃ /Fe₃ O₄ @PLGA/Cy5.5/RGD NP는 19.597 mM⁻¹ 으로 계산되었습니다. s⁻¹ . Na₂의 가로 이완율(r2)이 CO₃ /Fe₃ O₄ @PLGA/Cy5.5/RGD NPs는 Fe₃ 구성인 다른 많은 MRI 초상자성 물질보다 낮습니다. O₄ 임상에서 사용하는 SPIO 입자의 r2보다 2.94배 높은 r2를 증가시킬 수 있습니다.

Na₂의 초음파 조영제 영상 CO₃ /Fe₃ O₄ @PLGA/Cy5.5/RGD NPs

Na₂의 잠재력을 보여주기 위해 CO₃ /Fe₃ O₄ 종양의 초음파 영상을 위한 @PLGA/Cy5.5/RGD NPs, 우리는 Na₂의 꼬리 정맥 주사를 투여했습니다. CO₃ /Fe₃ O₄ @PLGA/Cy5.5/RGD NP를 유방암 이종이식 누드 마우스에 적용하고 시간의 함수로 초음파 이미지를 모니터링했습니다(그림 4a). 주사하기 전에 종양, 간 및 피하 영역의 이미지를 기록했습니다. 주사 직후 종양 조직 부위는 조영증강을 나타내지 않았다. 종양 영역의 향상은 주사 후 30분에서 시작하여 90분 동안 지속되는 것으로 관찰되었습니다. 생체 내 초음파 결과는 Na₂ CO₃ /Fe₃ O₄ @PLGA/Cy5.5/RGD NP는 산성 종양 조직에서 충분한 기포를 생성하여 초음파 이미징을 위한 에코 반사율을 생성합니다. 대조군으로서 우리는 또한 표적 NP를 주사한 후 다른 시간에 간 및 피하 조직의 이미지를 얻었다. 관찰기간 내내 피하주사 부위에서는 유의한 조영증강이 관찰되지 않았고, 시간이 지남에 따라 감소하는 간에서의 조영증강도 종양보다 유의하게 낮았다(Fig. 4b). 이 결과는 Na₂ CO₃ /Fe₃ O₄ @PLGA/Cy5.5/RGD 생리학적 pH에서 체내 순환하는 나노입자는 상당한 양의 CO₂를 생성하지 않습니다. 초음파 대비 향상을 위한 거품.

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아 Fe₃ 주입 후 다른 시간에 종양, 간 및 피하 부위의 생체 내 초음파 영상화 O₄ /나₂ CO₃ @PLGA/Cy5.5/cRGD NPs. ㄴ 시간의 함수로서의 에코 강도 비율은 조직/블랭크로 계산되며, 조직은 종양, 간 또는 피하 영역의 에코 강도를 나타내며, 블랭크는 주입 전 에코 강도를 나타냅니다.

Na₂의 MRI CO₃ /Fe₃ O₄ @PLGA/Cy5.5/RGD NPs

생체 내 MRI의 경우 NP가 종양 특이적 영상화에 사용될 수 있음을 입증하기 위해 Na₂ CO₃ /Fe₃ O₄ @PLGA/Cy5.5/RGD NP는 종양과 근육에 직접 주입되었습니다. 그 결과 종양 영역은 표적 나노입자 주입 후 T2-MR 대비가 유의하게 감소했으며 신호 강도는 주입 후 0분에서 8875에서 120분에서 5972로 유의하게 감소했음을 보여주었다(그림 5a, b). 그러나 같은 양의 나노입자를 주입했을 때, 피하 근육 부위는 훨씬 더 낮은 T2 신호 감소를 보였다. 이 발견은 Na₂의 효과를 보여줍니다. CO₃ /Fe₃ O₄ 종양 표적 영상에 사용하기 위한 과민성 인테그린 표적 T2-MR 조영제가 포함된 @PLGA/Cy5.5/RGD NP. 꼬리 정맥 주사 그룹에서 T2-MR 영상은 주사 후 24시간째에 종양의 명암 대비 뚜렷한 감소를 보여 Na₂의 높은 종양 축적을 보여줍니다. CO₃ /Fe₃ O₄ @PLGA/Cy5.5/RGD NPs(그림 5c, d). 또한 간과 신장에서 감소된 T2 신호가 관찰되어 NP의 철 이온이 신체에서 빠르게 제거될 수 있음을 나타냅니다. 따라서 MRI는 PLGA로 감싼 Fe₃ O₄ 나노입자는 EPR(Enhanced Permeability and Retention) 효과, 특히 RGD 매개 표적화를 통해 효율적인 수동 종양 표적화를 나타내었지만 분해되어 생체 내에서 빠르게 배설될 수 있었습니다.

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아 Fe₃ 주입 전후의 정상 및 종양 피하 조직의 생체 내 T2-MR 이미지 O₄ /나₂ CO₃ @PLGA/Cy5.5/cRGD NPs. ㄴ Fe₃ 주입에 대한 근육 및 종양의 평균 신호 강도 O₄ /나₂ CO₃ @PLGA/Cy5.5/cRGD NPs. ㄷ Fe₃ 정맥 주사 전후의 MDA-MB-231 종양 보유 마우스의 축 및 관상에 대한 T2-MR 이미지 O₄ /나₂ CO₃ @PLGA/Cy5.5/cRGD NPs. d 신호강도비는 조직/근육으로 계산되며, 조직은 표적 나노입자 주입 전후의 종양, 간, 신장의 신호강도, 근육은 동시에 근육의 신호강도를 나타냅니다.

형광 이미징 및 조직학

생체내 형광 영상화를 위해 200 마이크로리터의 NP를 마우스에 정맥내 주사하였다. RGD 표적 나노입자를 주입한 그룹에서 Cy5.5의 형광 신호는 종양 부위에서 점차 증가하여 주입 후 4 h에 피크에 도달하여 Na₂ CO₃ /Fe₃ O₄ @PLGA/Cy5.5/RGD NP는 종양에 효과적으로 축적될 수 있습니다. 비표적 그룹에서 NP는 주사 후 몸 전체에 분포하고 빠르게 제거되었으며 장기간 종양에 축적되지 않았습니다(그림 6a). 그런 다음 마우스를 해부하고 시험관 내 형광 이미징을 위해 주요 기관과 종양을 수집하여 표적 NP의 높은 종양 흡수를 나타냈다(그림 6b, c). 표적 나노입자를 주사한 쥐의 종양에서 Cy5.5의 형광 강도는 비표적 나노입자를 주사한 쥐의 1.5배였습니다.

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아 표적 및 비표적 NP 주입 후 0, 0.5, 1, 2 및 3 h 주입 후 동물의 생체 내 형광 형광 이미징. b 동물에서 수집한 종양 및 주요 기관(간, 비장, 폐, 심장 및 신장)의 생체외 형광 이미지. ㄷ 다양한 장기 및 종양의 평균 형광 강도

또한, Na₂의 종양 특이적 표적화 CO₃ /Fe₃ O₄ @PLGA/Cy5.5/RGD NP는 동결된 종양 절편의 조직 형광 영상화에 의해 확인되었습니다(그림 7a). αv 및 β3 인테그린에 대한 항체를 사용한 종양 절편의 면역형광 염색은 종양 조직에서 αvβ3 인테그린의 유의한 발현을 나타내었다. αv 및 β3 인테그린의 형광은 Na₂의 Cy5.5 형광과 병합되었습니다. CO₃ /Fe₃ O₄ @PLGA/Cy5.5/RGD NPs는 colocalization을 나타내는 면역 염색 이미지를 얻습니다. 종양 조직의 면역형광 결과는 Na₂ CO₃ /Fe₃ O₄ @PLGA/Cy5.5/RGD NP는 MB231 악성 유방암에서 αvβ3 인테그린에 특이적으로 결합합니다. 또한, Na₂의 H&E 염색 CO₃ /Fe₃ O₄ @PLGA/Cy5.5/RGD NP는 비 표적 그룹과 비교하여 모든 장기 조직 섹션이 정상적인 병리학 적 형태를 가지고 조직 병리학 적 손상 반응이 없음을 보여주었습니다 (그림 7b). 위의 세포독성 및 조직학적 분석의 모든 결과는 Na₂ CO₃ /Fe₃ O₄ @PLGA/Cy5.5/RGD NP는 생체 내 주요 장기 조직에 심각한 독성을 유발하지 않았으며, 이들의 우수한 생체적합성은 합리적으로 PLGA에 기인할 수 있습니다.

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아 표적 및 비표적 NP를 주사한 마우스의 MDA-MB-231 종양 동결 절편의 형광 영상. 녹색, 빨간색, 보라색 및 파란색은 각각 αv, β3, Cy5.5 및 DAPI 형광을 나타냅니다. ㄴ 표적 및 비표적 NP를 주사한 후 마우스에서 수집한 H&E 염색 종양 조각

결론

결론적으로, 위의 결과는 자기 표적화와 종양 미세 환경에서 활성화되는 가스 발생 시스템을 통해 유방암의 MRI에 대한 창의적이고 성공적인 접근 방식을 보여줍니다. 나₂ CO₃ /Fe₃ O₄ @PLGA/Cy5.5/RGD NP는 MR/초음파/형광 이미징 모드에서 우수한 이미징 성능과 우수한 생체 적합성을 나타냅니다. 우리의 연구는 개선된 다중 모드 이미징으로 종양 진단의 강력한 잠재력을 보여줍니다.

자료 및 방법

자료

Poly(lactic-co-glycolic acid)(PLGA)(lactide:glycolide =75:25, Mw =20,000), Cyanine 5.5 염료 및 폴리비닐 알코올(PVA)은 Sigma-Aldrich Company(Shanghai, China)에서 구입했습니다. RGD 펩타이드는 GenicBio BioTech Co. Ltd.(중국 상하이)에서 맞춤 합성했습니다. Fe₃ O₄ 나노입자 및 탄산나트륨(Na₂ CO₃ ) Xian Ruixi Biological Technology Co. Ltd.(중국 허난)에서 구입했습니다. 디클로로메탄(CH₂ Cl₂ ) 및 디메틸 설폭사이드(DMSO)는 Solarbio Company(Beijing, China)로부터 입수하였다. 모든 화학 물질은 분석 등급이었습니다.

Fe3O4/Na2CO3@PLGA/Cy5.5/cRGD 나노입자 합성

먼저, 12.5 mg의 PLGA와 0.25 mL의 클로로포름을 함께 혼합했습니다. 그런 다음 5 μL의 Cy5.5, 15 μL의 올레산 변성 자성 나노입자가 클로로포름(OA@Fe₃ O₄ , 10 mg/mL), 탄산나트륨 5 μL(Na₂) CO₃ ), 1% PVA 용액 1.5 mL를 차례로 첨가하고 초음파 처리기로 2 분 동안 유화시켰다. 그런 다음, 0.3% PVA 용액 12.5mL를 첨가하고 상온에서 3-4시간 동안 교반하고, 0.4% PVA 용액 12.5mL를 밤새 첨가하여 교반(500 rpm/min)하여 잔류 유기 용매를 제거하였다. 위의 용액을 ddH₂로 여러 번 한외여과 세척했습니다. O 그런 다음 PB 완충액(pH =7.4)으로 최종 부피 1.25 mL로 희석합니다. 다음으로, 상기 혼합 용액에 EDC 0.25 mg 및 NHS 1.25 mg을 첨가하였다. 혼합물을 25℃에서 30분 동안 교반한 다음 한외여과로 3회 세척하고 PB 완충 용액(pH =7.4)에 재현탁시켰다. 다음으로, 1.25 mg의 cRGD를 용액에 첨가하고 4 ℃에서 밤새 교반하였다. EDC, NHS 및 잔류 cRGD를 제거하기 위해 투명한 용액을 한외여과 튜브로 여과했습니다. 마지막으로 Fe₃ O₄ /나₂ CO₃ @PLGA/Cy5.5/cRGD NP를 1.25 mL의 탈이온수에 재현탁하고 4 °C에서 보관했습니다.

나노입자 특성화

나노 입자의 동적 직경과 제타 전위는 Zetasizer Nano-ZS(Malvern Instruments, UK)로 측정되었습니다. FEI Tecnai F20 투과 전자 현미경을 사용하여 나노 입자의 형태를 얻었다. Cy5.5 로딩은 Hitachi F-7000 형광 분광계에 의해 기록되었습니다. FTIR은 푸리에 변환 적외선 분광기(Alpha II, Bruker, Switzerland)를 사용하여 수행되었습니다. 진동 샘플 자력계(VSM, Lake Shore 7410)를 적용하여 나노입자와 자유 Fe₃의 히스테리시스 곡선을 결정했습니다. O₄ .

세포 및 동물

인간 유방암 MDA-MB-231 세포는 중국 과학원의 줄기 세포 은행에서 친절하게 제공되었습니다. 세포는 95% 공기 및 5% CO₂에서 37 °C로 유지되었습니다. . 암컷 BALB/c 마우스(4 주)를 Shanghai Slaccas Laboratory Animal Co. Ltd.에서 구입하고 Guangxi Medical University Laboratory Animal Center에서 승인한 프로토콜에 따라 유지했습니다. 동물 실험은 Guangxi 의과대학 실험동물센터 동물윤리위원회에서 발표한 실험동물 관리 및 사용에 대한 지침서에 따릅니다. MDA-MB-231 유방암 세포를 BALB/c 마우스의 오른쪽 옆구리에 이식하고(마우스당 200 μl 세포에서 2 × 106) 10-14일(평균 직경 5 mm) 동안 성장한 후 이미징했습니다.

αv 인테그린의 세포 발현

MDA-MB-231 세포에서 αv 인테그린의 높은 발현을 확인하기 위해 세포 면역형광법을 수행하였다. A549 및 MCF-7 세포를 대조군으로 사용하였다. 세포를 35 mm 유리 바닥 배양 접시(MatTek, USA)에 2 × 10⁴ 에서 시딩했습니다. 세포 mL⁻¹ 24 시간 동안. 인큐베이션 후, 세포를 4% 파라포름알데히드로 실온에서 20분 동안 고정시켰다. 그런 다음, 토끼 단일클론 항인테그린 αv 항체(ab179475, Abcam)와 함께 4°C에서 밤새 배양하고 항 토끼 IgG 항체와 함께 실온에서 1시간 동안 항온처리했습니다. 마지막으로 DAPI로 세포를 염색했습니다. 이미지는 공초점 레이저 스캐닝 현미경(TCS SP8, Leica, Germany)으로 획득했습니다.

나노 입자의 표적화 효능을 평가하기 위해 공초점 레이저 주사 현미경(CLSM)을 사용하여 세포 흡수 연구를 수행했습니다. 세포를 35 mm 유리 바닥 배양 접시(MatTek, USA)에 2 × 10⁴ 에서 시딩했습니다. 세포 mL⁻¹ 24 시간 동안. 그런 다음, 세포를 RGD 표적 NP(30 μg mL^-1 , 0.5 mL) pH 7.4에서 2 시간 동안 비표적화 NP를 대조군으로 사용했습니다. 인큐베이션 후, 세포를 4% 파라포름알데히드로 20분 동안 고정한 다음 αv 항체와 함께 인큐베이션하였다. colocalization을 통해 세포의 인테그린에 나노입자의 표적 결합을 확인했습니다.

CCK8 분석

Na₂의 생체적합성 CO₃ /Fe₃ O₄ @PLGA/Cy5.5/RGD 나노입자는 세포독성 연구에 의해 평가되었습니다. MDA-MB-231, A549 및 MCF-7 세포를 96웰 플레이트에 5 × 10³ 으로 시딩했습니다. 세포 mL⁻¹ 24 시간 동안. 그런 다음 0.1 mL의 Na₂ CO₃ /Fe₃ O₄ 5, 10, 20, 40 및 80 μg/mL의 Fe 농도에서 @PLGA/Cy5.5/RGD NP 현탁액을 각 웰에 첨가하고 24시간 동안 배양했습니다. 마지막으로, 10 μL의 CCK8 용액을 첨가하고, 현탁액을 추가로 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 결과는 450 nm에서 마이크로플레이트 리더(Thermo Scientific, USA)로 측정되었습니다.

조영제 강화 초음파 영상

나노입자의 초음파 영상은 Vevo 2100(Fujifilm Visual Sonics Inc., Canada) 초음파 시스템을 사용하여 수행하였다. RGD 표적화 및 비표적화 NP를 아가로스 모델에 추가하고 PBS를 대조군으로 사용하였다. 이미지는 7.2 및 6.8의 서로 다른 pH 버퍼를 사용하여 B 모드 및 CEUS 모드에서 기록되었습니다. B모드 영상에서 관심영역을 그리고 평균 회색값을 측정하였다.

생체 내 초음파 영상화를 위해 마우스를 2% isoflurane(Hebei Yipin Pharmaceutical Co., Ltd., China)으로 마취시키고, 체온을 가열 패드로 37 °C로 유지하였다. 총 200 μL의 RGD 표적 NP가 꼬리 정맥을 통해 주입되었습니다. 대조군 동물은 동일한 양의 NP로 피하 주사를 받았다. 7MHz 변환기를 사용하여 초음파 이미지를 기록하여 종양, 간 및 피하 영역의 초음파 이미지를 지속적으로 획득했습니다. Acoustic focus zone은 단면이 가장 큰 종양의 중앙에 위치하였고, 종양과 그 인접 조직을 포함하는 시야를 확보하였다.

자기공명영상

Na₂의 MRI 검사 CO₃ /Fe₃ O₄ @PLGA/Cy5.5/RGD NP는 3.0 T MR(GE Healthcare, USA)과 동물 코일(RF TECH LIMITED, 중국)을 사용하여 수행되었습니다. Fe 농도가 0.031, 0.063, 0.125, 0.25, 0.5 및 1 mM인 나노입자를 1 mL Eppendorf 튜브에서 스캔하고 PBS를 대조군으로 사용했습니다. T2 가중 FSE 시퀀스(슬라이스 두께 3 mm, TR/TE 2000/74.4 ms, 8 × 8 cm FOV 및 320 × 256 매트릭스)를 사용하여 각 튜브에 대해 T2 MRI를 수행했습니다. 이완율(r2)은 Fe 농도의 함수로서 역 이완 시간의 선형 피팅에 의해 계산되었습니다.

생체 내 MRI의 경우 마우스를 무작위로 두 그룹(n =3) (1) Na₂의 국소 주입을 받은 MR 스캐닝의 경우 CO₃ /Fe₃ O₄ @PLGA/Cy5.5/RGD 피하 근육 및 종양 조직 내의 나노입자 또는 (2) Na₂ 꼬리 정맥 주사 CO₃ /Fe₃ O₄ @PLGA/Cy5.5/RGD NPs. 나노 입자를 주입하기 전에 마우스의 기준선 이미지를 촬영했습니다. 1군은 피하조직과 종양조직에 같은 양의 나노입자를 주입하고 30분마다 MRI를 촬영하여 조직의 신호전이를 기록하였다. 그룹 2의 경우, 종양 영상은 축 및 관상 위치에서 수행되었으며 MR 매개변수는 시험관 내 영상에 사용된 것과 동일했습니다. 관심 영역(ROI)의 신호 강도(SI)를 측정하고 주사 전후 다른 시간의 조직 신호와 비교했습니다.

종양 형광 이미징

생체 내 형광 이미징의 경우 생체 내 형광 이미징 시스템(FX PRO, Bruker, Switzerland)을 스캔에 사용했으며 마우스를 무작위로 두 그룹(n =3):(1) RGD 표적 NP 및 (2) 비 표적 NP. 이미지는 주사 후 4 시간 동안 30 분마다 캡처되었습니다. 그 후, 중요한 장기와 종양을 채취하여 영상화하고, 신체 장기의 형광 분포를 관찰하였다. Quantitative analysis of fluorescence intensity was performed using molecular imaging software (Bruker, Switzerland). These important organs then underwent H&E staining to evaluate the tissue toxicity. Frozen tumour sections were also subjected to fluorescence immunostaining with antibodies against αv integrin and β3 integrin.