자체 분해성 나노 입자를 기반으로 한 정확한 리소좀 pH 지시약에 대한 확립 및 적용 연구

결과 및 토론

우리는 먼저 이중 PEG 기능성 흑색 다공성 실리카 나노입자(BPSi NPs)가 공급된 세포에서 차등 유전자 발현을 감지했습니다(우리 공동 연구실에서 제공 [12]). − 18.5에서 + 2.8 mV로의 제타 전위 변화는 표면 이중 PEG화가 성공적임을 나타냅니다(그림 S1a). BPSi 나노 입자의 평균 직경은 156 nm였습니다(그림 S1b). 차등 유전자 발현의 클러스터 히트 맵(그림 S2)을 기반으로 추가 조사를 위해 2배 이상의 차등 유전자 발현을 선택했습니다. Go와 KEGG는 차등 유전자를 분석하기 위해 도입되었습니다. Go 농축 버블 맵(그림 1a)에서 phagolysosome 조립, phagocytosis 및 xenobiotic 대사 과정을 포함한 대사 및 리소좀 관련 유전자가 추가 분석을 위해 선택되었습니다. 특히, TFEB-CLEAR [17] 관련 유전자 발현이 크게 증가했습니다. RT-PCR 결과(그림 1b)도 유전자 염기서열 분석 결과, CTSD, CTSF, TFEB, MFN1, LAMP2 및 TPP1과 같은 TFEB-coordinated lysosomal expression 및 CLEAR(coordinated lysosomal expression) 경로의 유전자가 유의하게 증가했음을 확인했습니다. . 이 유전자는 그림 S3과 같이 리소좀 경로에 표시되어 있습니다. 이들의 발현은 대조군보다 높고 통계적 유의성을 갖는다(P _{BPSi 대 제어} <0.05). 그리고 TFEB는 리소좀 유전자의 발현을 긍정적으로 조절하고, 리소좀 개체군을 조절하며, 리소좀 기질의 세포 분해를 촉진합니다.

Autophagy는 BPSi를 공급한 후 HepG-2 세포에서 활성화됩니다. 아 전사체 시퀀싱에 의해 발견된 차등적으로 발현된 유전자의 GO 농축 버블 맵. ㄴ RT-qPCT 실험으로 처리한 BPSi 후 TFEB-CLEAR 유전자 네트워크의 유전자 변화 확인. ㄷ BPSi 처리 후 P62, TFEB, LC3B II/I 단백질 발현. d 대조군에 따른 BPSi 처리군에서 P62, TFEB, LC3B II/I 단백질의 정규화된 밴드 그레이 강도. 데이터는 평균 ± SD로 표시되었습니다.

또한, TFEB는 자가포식을 조절하며, TFEB 유전자의 주요 기능은 리소좀의 생합성을 유도하고 자가포식의 발생을 촉진하기 때문에 과발현은 배양된 세포에서 자가포식소체 생산을 크게 증가시킨다[20]. 세포에 BPSi NP가 공급될 때 자가포식이 발생했는지 여부를 입증하기 위해 웨스턴 블롯 분석도 사용되었습니다. Western test의 목적은 BPSi 공급 후 TFEB의 발현이 증가하고 세포 자가포식의 발생을 추가로 확인하는 것이었습니다. LC3B 및 P62 단백질은 모두 자가포식 마커입니다. 자가포식이 발생하면 미세소관 관련 단백질 1A/1B-경쇄 3B(LC3B) II/I의 발현이 증가합니다. p62는 자가포식에 의해 분해되는 소포에 대한 수용체이자 유비퀴틴화된 단백질 응집체가 제거되는 수용체이기도 하며, 자가포식이 발생하면 그 발현이 감소합니다. 그래서 우리는 서양 실험에서 이들 단백질의 발현을 측정했습니다.

도 1c, d, TFEB(P _{80 μg/ml VS 대조군} =0.000008), LC3B II/I(P _{80 μg/ml VS 대조군} =0.000297) 및 p62(P _{80 μg/ml VS 대조군} =0.000016) 단백질은 모두 크게 상향 조절되었습니다. autophagy의 활성화를 나타내는 TFEB 및 LC3B II/I 단백질의 상향 조절 [18]로, 우리는 BPSi endocytosis가 autophagy의 발생을 촉진한다고 의심했습니다. 그러나 p62 단백질은 엔도좀을 리소좀으로 가져오고 최종적으로 분해되는 운반체 단백질 특성으로 인해 자가포식 과정에서 하향 조절되는 것으로 추정됩니다. 우리 연구에서 p62의 상당한 상향조절은 엔도-리소좀 융합 과정 동안 분해의 종료를 나타냈으며[21], 이는 아마도 엔도-리소좀 소포의 pH 증가에 의해 야기되었을 것입니다. 따라서 BPSi endocytosis는 먼저 autophagy의 발생을 유도한 다음 amide 알칼리성으로 인해 endo/lysosome pH 값을 증가시켜 autophagy 과정을 억제할 수 있습니다.

BPSi 엔도사이토시스에 의한 엔도/리소좀의 pH 증가 특성을 입증하기 위해 두 개의 상용 pH 형광 프로브인 pHrodo™ Red Transferrin Conjugate(Thermo Fisher ^# P35376) 및 RatioWorks™ PDMPO.

상용 세포내 pH 지시약인 pHrodo™ Red는 일반적으로 중성 pH에서 약한 형광성을 나타내지만 pH가 떨어지면 형광성이 증가합니다. 560/585 nm의 여기/방출과 함께 ~ 6.5의 pKa로 9-4 범위의 세포 세포질 pH를 정량화해야 했습니다. 우리는 6개의 세포주 결정에서 BPSi NP의 엔도사이토시스가 약화되는 적색 형광 신호로 인해 엔도/리소좀의 pH 값을 증가시키는 능력이 있다는 질적 분석 결론을 얻을 수 있었습니다(그림 S4 및 S5). 그러나 제품 작동 프로토콜에 따라 여러 번 실험을 반복한 후에 강도와 설정된 pH 값 사이에 상관 관계가 없기 때문에 BPSi NP를 공급하기 전후에 서로 다른 세포주에서 감소한 정확한 pH 값을 거의 정량적으로 분석하지 못했습니다.

그런 다음 PDMPO는 BPSi 엔도사이토시스 후 pH 값 변화를 나타내는 더 나은 솔루션으로 사용되었으며, 이는 pH 정량적 측정에서 비율 이미징 기술을 도입합니다. PDMPO [2-(4-피리딜)-5-((4-(2-디메틸아미노에틸-라미노카르바모일)메톡시)페닐)옥사졸]은 산성 이중 여기 및 이중 방출 pH 프로브로 특징지어집니다. 낮은 pH에서 강렬한 녹색 형광을 방출하고 높은 pH에서 강렬한 파란색 형광을 나타냅니다. 이 독특한 pH 의존적 형광으로 인해 PDMPO는 pKa =4.47인 산성 소기관에 이상적인 pH 프로브가 됩니다. PDMPO는 살아있는 세포의 산성 소기관(예:리소좀)에 선택적으로 레이블을 지정하고 두 개의 뚜렷한 방출 피크를 사용하여 비율 측정에서 살아있는 세포의 pH 변동을 모니터링할 수 있습니다. 그러나 우리는 BPSi 공급 전후에 6개의 세포주에서 pH 값을 측정하는 데 여전히 실패했습니다. 그림 S6에 나타난 결과와 같이, BPSi 공급 전후에 모든 6개 세포주에서 유의한 차이가 관찰되지 않았다. Blue/Green 비율과 pH 값 사이에 상관 관계가 설정되었지만(그림 S7) pH 4–5의 비선형 상관 관계로 인해 PDMPO 방법은 BPSi 공급 전후의 엔도/리소좀 정량 분석에 실패했습니다.

위의 두 가지 상용 pH 지표 데이터에서 우리는 먼저 PEG 사슬에 아미드가 있는 PEG 장식 나노입자가 아미드의 알칼리성 특성으로 인해 엔도/리소좀 pH를 증가시킬 수 있다는 의심을 입증했습니다. 그러나 정확한 pH 변화(0.1 pH 범위)에 대한 정량 분석 ​​없이는 autophagy 상태와 endo/lysosome pH 값 간의 상관 관계를 설정할 수 없으므로 autophagy 예측에 실패했습니다.

자기 분해성 나노 입자에 대한 이전 연구 [13, 14] [15, 22]를 기반으로 하여 75% 에탄올에서 동일한 농도의 수산화 암모늄을 유지했지만 MB 및 TEOS 농도를 조정했습니다. 서로 다른 쉘 두께와 기공 크기를 얻기 위해 두 가지 시리즈의 TEOS 양을 100 μL 및 80 μL로 설정했습니다. 10개의 시리즈 MB 양은 센터 중공 구조와 MB 로딩 효율의 다른 크기를 얻기 위해 설정되었습니다.

프로토콜에 추가된 MB 및 TEOS 양은 아래 표 1과 같습니다.

그림 2a, b에서 볼 수 있듯이 TEOS 농도(100 μL 및 80 μL) 모두에서 MB 양이 증가함에 따라 나노입자 크기가 증가했습니다. 동일한 MB 농도에서 입자 크기는 TEOS 양이 증가함에 따라 증가했습니다. Moreover, with the increase of the TEOS amount, the shell thickness grew up, which has been proved by the element mapping (shown as Fig. 2c). The polydispersity index (PDI) and surface charge of the nanoparticles are shown in Fig. S8 and Table S1. The morphology studies predicted that with the increase of MB amount, the loading efficiency will grow up, leading to the faster release profile, while with the increase of TEOS amount, the release will slow down. And we need to find out the appropriate MB and TEOS concentration, with which we could obtain the optimized nanoparticle systems, that we may be able to make the MB release profile linear correlated with the pH changes.

Morphology characterization of 10 different self-decomposable nanoparticles with specific MB or TEOS amount. 아 STEM figures. ㄴ Nanoparticle size distribution analysis. c Si mapping of 10 self-decomposable nanoparticles. Scale bars in all figures are 100 nm. The size distribution analysis was performed by randomly chosen 100 nanoparticles from STEM figures and measured by ImageJ software. Data was presented as mean ± S.D.

The MB loading efficiency was determined by UV-Vis spectrum. The standard curve (Fig. S9) of MB was firstly drawn using series concentrations of MB solution (from 6.25 to 46.88 μg/mL), with the equation as y  = 67.63x  + 0.10919, R ²  = 0.9987. As calculated with the equation above, we obtain MB loading efficiency of 10 self-decomposable nanoparticles with specific parameters, detailed data shown in Fig. S10.

Before the study of the MB release profiles in different pH solutions, the release profiles in pure water have been studied. As shown in Fig. S11 and Fig. S12, all the nanoparticles with TEOS amount of 80 μL presented increased MB release along with the duration increase, which was reflected by the UV–Vis absorption. Moreover, with the MB encapsulated amount increase, the growth trend of MB release becomes more significant. Also, the release velocity grows faster. However, as the TEOS amount increase to 100 μL, the particle surface became more densed and the release becomes slower when the MB amount below 3.0 mg; almost no increase trend could be observed in the MB release in water during 14 days of release. As long as the MB amount increases to above 4.0 mg, an obvious increase trend of MB release could be observed. One thing to be noticed is that the nanoparticle parameter of both NPs_7.5/80 and NPs_6.0/100 presented solid growth as the time prolongs, almost showed a linear increase trend during the first 7 days, and then reached the platform.

Then, we focused on the MB release behavior in different pH buffers to figure out whether self-decomposable nanoparticles with specific parameters could have the linear pH-dependent MB release.

Firstly, we carried out the MB release experiments at pH 4.0 buffer solution. From Fig. S13, we could easily reach the conclusion that with the same TEOS amount of 100 μL, the MB release velocity presented a similar trend was observed in the 5 nanoparticle systems of TEOS at 80 μL (Fig. S14), the center positive correlation with the MB encapsulated amount.

Concentrated MB diffuses into the surrounding solution via diffusion due to concentration difference. The bigger concentration gradient makes the faster MB release. Compared with the MB release in pure water, we found that the acidic environment speeded up the release of MB (Fig. S13 and S14 compared with Fig. S11 and S12), indicating that the MB release is not only driven by diffusion; however, in acidic solutions, electrostatic repulsion is also an important driven force due to the positive charge nature of MB. We then calculated the release percentage of each nanoparticle parameter according to the MB loading efficiency, MB standard curve, and the dilution ratio at measurements. The release percentage reflected the release speed of MB in pH 4.0 acidic solution, and the results (Fig. 3) showed that only the release percentage of NPs_7.5/80 presented linear release in pH 4.0 solution. Other nanoparticle systems with specific MB and TEOS parameters showed similar release trends, and the release percentage did not have a linear growth. One exception is NPs_6/100 , and the MB release reached the platform in only 72 h; thus, it was hard to tell whether the MB release could grow linear before that duration at this stage.

MB release percentage of 10 series self-decomposable nanoparticles after a specific duration in pH 4.0 buffer. All experiments were triple repeated, and the data were shown as mean ± S.D.

Meanwhile, we tested the MB release profiles in near-neutral and alkali buffers (pH 6.86 and pH 9.18). The results in both Fig. S15, S16, Fig. S17, and S18 demonstrated that the MB release slowed down with the solution pH increase to 6.86; moreover, with the central MB concentration increased, the MB release percentage decreased. At pH 9.18, all nanoparticles with 10 specific parameters presented a very slow MB release (Fig. S19 and S20); no matter in UV–Vis absorption or the release percentage, the trend was similar with the one in pH 6.86 buffer, but with even lower release percentage. So, it was clear that the self-decomposable nanoparticles only presented MB release linear growth in acidic solutions. We thought back to the endo/lysosomes pH, from 4 to 5, which is exactly the pH range of MB linear growth as a function of time in a specific MB/TEOS parameter. Thus, we get more confident that the self-decomposable nanoparticle system may be an accurate measuring tool for quantitative determining the endo/lysosome average pH, then provide evidence on the exact pH value of autophagy status.

The precondition of using the specific self-decomposable nanoparticles as an endo/lysosome pH indicator is that the nanoparticles stay stable in the endo/lysosome during the whole measurement process. Secondly, the MB release in endo/lysosome should occur smoothly when the measurement carried out.

The colocalization of the nanoparticle in the endo/lysosomes by cell TEM study and the MB release in 6 different cell lines were studied. From the cell TEM results, all of the 10 series nanoparticles stayed in the endo/lysosomes without escaping, after 24-h incubation with the HepG-2 cells (Fig. 4). Since the diameter of HepG2 cells used in Fig. 4 is about 10–20 μm and the diameter of MB@SiO₂ nanoparticles is between 75 and 200 nm, it will be very difficult to clarify the nanoparticle morphologies using the images with low magnification (as shown in Fig. S21). We also investigated the intracellular location of the nanoparticles in the other 5 cell lines, and 4 nanoparticles were randomly selected to demonstrate the nanoparticles were trapped in the endo/lysosomes (Fig. S22). The nanoparticles with all parameters showed a central hollow structure in all other 5 cell lines after 24-h incubation, indicating the MB release. Moreover, under more precise observation, we noticed the MB release may be different due to different hollow sizes, pointing to the fact that (1) the endo/lysosome pH in different cells is different and (2) the MB release from the nanoparticles is very sensitive to the endo/lysosomes pH, especially for the NPs_6/100 and NPs_7.5/80 . From Fig. S23, we can find that nanoparticles have already realized the endocytosis and stayed in the vesicles 2 h after nanoparticle feeding, then nanoparticles gradually accumulated in lysosomes.

The colocalization of the nanoparticle in the endo/lysosomes by cell TEM study after 12 and 24 h incubation with the 10 series nanoparticles. The scale bar is 200 nm in the TEM images

We then evaluated the correlation between the pH values and the OD values in pH 4.0–4.8. From the results in Fig. 5 and Fig. S24, for NPs_6/100 and NPs_7.5/80 nanoparticle systems, the MB release presented a linear decrease as a function of pH in the pH range from 4.0 to 4.8.

MB release as a function of pH values in NPs6/100 and NPs7.5/80 after specific incubation duration, 6 h, 12 h, and 24 h. The linear correlation equations were also calculated for 6 h and 12 h for MB release from both NPs6/100 and NPs 7.5/80 as a function of pH values. All experiments were carried out triplicated, and the data were shown as mean ± S.D.

We then converted the OD value to the MB release percentage according to the MB loading efficiency and feeding amount. As shown in Fig. S25, in the first 6 h, the MB release percentage in NPs_6/100 and NPs_7.5/80 nanoparticle systems also presented as a function of pH values. We then calculated the residual sum of squares and Pearson’s related coefficient at 6 h and 12 h release duration, respectively, as the residual sum of squares present a negative correlation with closeness of linear fitting, while the closer the absolute value of Pearson’s related coefficient to 1, the more linear it is. As shown in Table S2 and S3, the highest degree of linearity is the fitting of NPs_6.0/100 nanoparticle systems, followed by the one of NPs_7.5/80 at 6 h release.

Till then, we were so excited by the results that the method for precisely monitoring the pH values has been established, especially with the accuracy less than or equal to 0.1 pH value interval. That means, we have great possibilities to figure out the correlation between endo/lysosome pH values and the autophagy status, which is of great significance for better studying the autophagy mechanism and predicting the autophagy process. As we can see in Fig. S26, the MB release in HepG-2 cells have already reached the plateau after incubation for 4 h. Thus, we chose 6 h as the observation time point.

We then carefully investigated the MB release of NPs_6.0/100 in 6 cell lines in the nanoparticle cell interaction duration of 6 h, including liver cancer HepG-2 cell line, colon cancer HCT8, HCT 15, and HCT 116 cell lines, lung cancer A549 cell line, and myomelanocytic cancer B16 cell line.

As shown in Table 2, we clearly differentiate the endo/lysosomes in 6 cancer cell lines, with the accuracy at 0.01 pH values, which is impossible to be done with the commercial intraocular pH indicator kits.

Moreover, we re-evaluated pH values in endo/lysosomes of the HepG2 cells before and after cultured with BPSi nanoparticles. We reached the conclusion that BPSi uptake significantly increases the endo/lysosome pH values, from 4.70 ± 0.09 to 5.59 ± 0.05, perfectly illustrating the reason for BPsi uptaken induced the autophagy initially then terminated the autophagy flux. The intracellular uptake of BPSi makes the quantities of the endo/lysosomes increased, which was consistent with the results of gene sequencing, that autophagy-related genes (TFEB-CLEAR) were activated. Meanwhile, the autophagy termination by the increased pH values in endo/lysosomes also coincide with the results of p62 proteins upregulation in Western blot study.