자가분해성 SiO2 나노입자 이용 정밀 라이소좀 pH 센서 개발

초록

라이소좀의 산성 pH는 자가포식과 밀접한 관련이 있으므로, 라이소좀의 정확한 pH 변화를 알면 자가포식 과정과 상태에 대한 더 많은 정보를 얻을 수 있다. 그러나 지금까지 상대적으로 넓은 범위의 pH 변화만 지시할 수 있었을 뿐, 정확한 라이소좀 pH 검출은 달성되지 못했다. 본 연구에서는 특정 합성 파라미터를 가진 자가분해성 SiO₂ 나노입자 시스템 기반 엔도/라이소좀 pH 지시약을 확립했다. 중심 공동 구조 나노입자 내 고농도 메틸렌 블루(MB)가 pH 4.0~4.8 범위에서 pH 값 함수로 민감하게 방출되었으며, 이는 정확히 라이소좀 pH 범위다. 광학 밀도(OD) 값과 pH 값 간 선형 상관관계가 구축되어 6가지 다른 세포주에서 라이소좀 pH 검출에 사용되었다. 또한 이 시스템으로 검은 다공성 실리콘(BPSi) 나노입자 포식 전후 라이소좀 pH 평균 변화를 정확히 검출하여 BPSi 포식 후 자가포식 종료 메커니즘을 규명했다. 따라서 자가분해성 나노입자 기반 루멘 pH 지시약은 라이소좀 pH를 더 잘 알 수 있는 새로운 방법론과 전략을 제공하며, 자가포식 과정이나 대사 관련 기타 중요한 신호 전달에 대한 더 자세한 정보를 지시할 수 있다.

서론

라이소좀은 거대분자의 최종 목적지로, 저산성 pH에서 활성화된 가수분해 효소에 의해 분해된다[1]. 라이소좀 산성 pH는 진공형 H⁺−ATPase(v-ATPase)[2]가 세포질에서 라이소좀 루멘으로 양성자 펌핑하여 ~60종 가수분해 효소[3] 활성 유지한다. 게다가 최근 문헌은 라이소좀 산성 pH가 자가포식과 밀접히 관련됨 보고[4], 정확한 라이소좀 pH 변화 파악이 자가포식 과정과 상태 정보 제공. 우리 연구와 문헌 검토 기반, 아민 양전하 나노입자 포식은 엔도/라이소좀 pH 변화 증가 유발 가능, 예: 1차, 2차 아민 PEG 장식 나노입자 또는 입자 표면 친수성 장식[5, 6].

아민 나노입자 포식 유도 pH 증가는 전사 인자 EB(TFEB) 핵 국소화 급격 증가[7], 경로 전사적 상향 조절뿐 아니라 라이소좀 기능 장애 초래, 궁극적으로 자가포식 플럭스 차단[7,8,9]. TFEB는 자가포식 조절, 과발현 시 배양 세포서 자가포식체 생성 유의미 증가.

따라서 자가포식 과정과 세부 사항 예측 위해 라이소좀 정밀 pH 및 변화 측정 매우 중요. 현재까지 엔도/라이소좀 pH 값 지시 문헌 검토[10]와 상용 엔도/라이소좀 pH 값 검출 제품서 상대적으로 넓은 범위 pH 변화만 지시 가능, 정확한 라이소좀 pH 검출 미도달. 따라서 자가포식 통찰 세부 사항 알기 위해 정밀 루멘 pH 변화 검출법 확립 중요 접근법.

자가분해성 SiO₂ 나노입자 이전 경험 기반, 본 연구에서 루멘 pH 변화 검출 가능한 정밀 pH 지시약 확립. SiO₂ 나노입자 조절 가능 크기와 생체적합성 장점[11]. 특정 합성 파라미터 설정으로 확립된 자가분해성 SiO₂ pH 지시약이 pH 4.0~4.8에서 페이로드 메틸렌 블루(MB) 민감하게 방출, 정확히 라이소좀 pH 범위. 게다가 MB 방출 pH 값 변화와 선형 상관관계 보임(구상도 1). 세포 수준에서 pH 지시약 타당성 테스트 위해 6가지 다른 세포주 도입, BPSi 나노입자 포식 전후 라이소좀 평균 pH 변화 결정 성공, BPSi 포식 후 자가포식 종료 메커니즘 규명. 따라서 자가분해성 나노입자 기반 루멘 pH 지시약은 라이소좀 pH 더 잘 아는 새 방법론과 전략 제공, 자가포식 과정이나 대사 관련 기타 중요 신호 전달 더 자세한 정보 지시 가능.

MB@SiO₂ 살아있는 세포 라이소좀 pH 측정 개략도

재료 및 방법

재료

나트륨 실리사이드(NaSi)와 Si 웨이퍼(직경 20 cm, p+ (100), 0.01–0.02 Ω cm) 각각 SiGNa Chemistry Inc.와 Ocmetic Inc. 제공. 브로마이드 암모늄(NH₄Br, 99%), 브로마이드 나트륨(NaBr, 99%), 톨루엔(무수, 99.8%), 염산(HCl, 37%), MB, 테트라에틸 오르토실리케이트(TEOS) Sigma-Aldrich 구입. 0.5 kDa 메톡시-PEG-실란, 2 kDa 메톡시-PEG-실란 각각 Fluorochem Ltd., Laysan Bio Inc. 구입. RPMI 1640 배지 Life Technologies 제공. 태아 소 혈청(FBS) TianHang 생물기술 구입. 탄산나트륨, 황산 스트렙토마이신, 페니실린 G, HEPES, 라이소자임 용액, CellLight 조기 엔도좀-GFP, LysoTracker™ Red DND-99, Pierce® BCA 단백질 분석 키트, 향상된 화학발광, pHrodo™ Red 트랜스페린 컨쥬게이트, 라이브 셀 이미징 솔루션, Trizol 시약 Thermo Fisher Scientific 구입. 에탄올, 암모니아수 Sinopharm 제공. BioRT Master HiSensi cDNA First-Strand Synthesis kit Hangzhou Bioer Technology Co., Ltd. 구입. RIPA 용해액 Heart Biological Technology Co., Ltd. 구입. P62, TFEB, β-actin 항체 Proteintech Group, Inc. 구입. LC 3B 항체 Abcam 제공. 2-(4-피리딜)-5-((4-(2-디메틸아미노에틸-아미노카바모일) 메톡시) 페닐) 옥사졸(PDMPO) Yeasen Biotech Co., Ltd. 제공.

연구 목적, 설계, 설정

본 연구 목적: (1) BPSi 나노입자 HepG2 세포 자가포식 영향 탐구, (2) 라이소좀 pH 값 변화가 자가포식 영향주는 기저 메커니즘 규명, (3) 라이소좀 pH 정확히 측정 가능한 정밀 라이소좀 pH 지시약 확립, (4) pH 변동 자가포식 영향 지시. 위 연구 목적 실현 위해 전사체 시퀀싱 실험으로 BPSi 나노입자 공급 후 HepG2 세포 전사체 유전자 변화 탐구, RT-qPCR과 Western 실험으로 검증. PDMPO 등 형광 염료로 BPSi 공급 후 HepG2 세포 라이소좀 pH 변화 측정. 라이소좀 pH 정확히 측정 위해 10개 파라미터 가진 MB@SiO₂ 나노입자 개발, DLS, HR-TEM 등 실험으로 10종 나노입자 특성 분석. 10계열 자가분해성 나노입자 시스템 MB 로딩 효율과 방출 동역학 다른 pH 용액과 HepG2 세포서 테스트. 나노입자 세포 내 위치 확인 위해 세포 TEM 실험, 살아있는 세포 공초점 현미경 수행. 마지막으로 BPSi 공급 후 6종 세포 라이소좀 pH 변화 측정으로 MB@SiO₂ 나노입자 라이소좀 pH 변화 측정 보편성 검증.

BPSi 나노입자 합성

BPSi 나노입자 이전 방법[12]으로 제조, 협력자(Wujun Xu, 핀란드 동부 대학교 응용물리학과) 제공. BPSi, NaSi, 암모늄염, NaBr(NaSi:NH₄Br:NaBr = 1:4:4, w/w/w) 아르곤 분위기 글러브 박스서 분쇄. N₂ 분위기 튜브 오븐 240°C 5시간 반응(식 1). 실온 냉각 후 미세입자 0.5 M HCl, 1.0 M HF 용액 별도 세척 정제. 미세입자 에탄올 1000 rpm 15분 볼밀링, 원심분리 속도 조절로 원하는 직경 BPSi 나노입자 수집.

$$ \mathrm{NaSi}+{\mathrm{NH}}_4\mathrm{Br}\to \mathrm{NaBr}+{\mathrm{NH}}_3+\mathrm{Si}/\mathrm{H}+{\mathrm{H}}_2 $$ (1)

동적 빛 산란 실험으로 나노입자 직경 분포, 표면 전하 연구. 모든 나노입자 멸균 후 세포 도입 직전 약한 초음파(5초, 고르게 분산, 초음파 세척기 SB-5200DT, Ningbo Scientz Biotechnology Co., Ltd.)로 배지 분산.

10계열 자가분해성 나노입자 시스템 확립

10계열 자가분해성 나노입자 이전 보고 방법론[13,14,15,16]으로 수정 파라미터로 합성. 전형적 절차: 일정량 MB 에탄올(75 mL)과 암모니아수 용액(25%, 3.4 mL) 혼합물에 먼저 첨가, 이후 일정량 TEOS 첨가. 24시간 교반 후 3회 세척 건조로 계열 자가분해성 MB@SiO₂ NPs 획득. 프로토콜 첨가 MB, TEOS 양 표 1 기술. NPs_1.0/100 의미 나노입자 합성 시 MB, TEOS 인벤토리: 1.0 mg MB, 100 μL TEOS. NPs_1.5/100 등 의미 동일.

세포 배양

자가분해성 나노입자 기반 pH 지시약 효율성, 보편성 테스트 위해 특정 종양 유래 암세포주 테스트 시도. 간암, 폐암, 대장암, 흑색종 세포주 연구 대상 선정. 인간 대장암 세포 HCT116, HCT8, HCT15; 인간 간암 세포 HepG-2; 인간 폐암 세포 A549; 쥐 흑색종 세포 B16 RPMI 1640 배지(Life Technologies)에 10% 열불활성 FBS, 2.0 g/L 탄산나트륨, 0.1 g/L 황산 스트렙토마이신, 0.06 g/L 페니실린 G, 5.958 g/L HEPES 보충 유지. 세포 표준 배양기 37°C, 5% CO₂ 가습 분위기 유지.

10계열 자가분해성 나노입자 시스템 특성 분석

모든 계열 나노입자 형태 HR-TEM STEM 모드, Si 매핑 EDS 원소 매핑으로 특성 분석. 나노입자 크기 분포 분석 ImageJ 소프트웨어로 무작위 선택 STEM 이미지 나노입자 직경 계산. 나노입자 제타 전위, 분산도 지수(PDI) 특정 pH 값 버퍼계열 동적 빛 산란(DLS) 연구로 측정. 데이터 SPSS15.0 분석, 통계 결과 평균 ± S.D. 제시.

10계열 자가분해성 나노입자 시스템 MB 로딩 효율 및 방출 동역학 연구

MB 로딩 효율, 방출 동역학 연구 위해 계열 농도 MB 표준 곡선 먼저 확립. MB 흡수 UV-Vis 스펙트럼 660 nm 파장서 수행, 단량체 MB λmax. MB 로딩 효율 아래 식 계산: MB 로딩 효율(%) = 캡슐화된 MB 양/(투입 총 MB 양).

10계열 나노입자 MB 방출 순수, pH 4.0, 6.86, 9.18 버퍼, 라이소자임 용액(Thermo Scientific™ #90082)서 연구. 또한 특정 지속 시간 후 다른 pH 버퍼서 MB 방출 동역학 조사. 660 nm OD 값, 시간 함수 MB 방출 백분율 연구.

상세: MB 방출 연구 아래 프로토콜 수행; 10계열 나노입자 pH 4.0, 6.86, 9.18 표준 버퍼 15 mL 각각 라이소좀 용액과 용해; 37°C 훌라 믹서서 MB 방출 수행. 이후 15일간 각 시료 1 mL 수집, 12000 rpm 10분 원심분리. 상등액, 침전물 200-800 nm 흡수 스펙트럼 측정.

또한 라이소자임 용액 포함 정밀 pH 버퍼서 pH 4.1-5.5 범위 MB 방출 위 프로토콜 동일하게 조사. 특정 시간(6 h, 12 h, 24 h) 관찰 시점 설정. 각 시료 660 nm 흡광도 기록. 각 시점별 각 pH 용액 흡광도 선형 관계, 잔차 제곱합 계산.

세포 내 MB 방출 프로파일 검출 위해 HepG-2 세포 75 cm² 배양 플라스크 배양, 세포 70% 증식 시 NPs(300 μg/mL) 공급. 30분마다 세포 수집. 세포 반복 동결-해동으로 세포 내 MB 완전 방출. 세포 용해액 12000 r/min 10분 원심분리. 상등액 획득 660 nm 흡광도 측정 총 방출 MB 양 계산. 본 연구 HepG2 세포 연구 대상으로 선택, 빠른 세포 증식으로 10개 테스트 그룹 간 분산 최소화.

10계열 나노입자 세포 내 공위치화 및 6가지 다른 세포주 방출 성능

세포 TEM으로 나노입자 엔도/라이소좀 내 공위치화 연구, 표준 세포 TEM 프로토콜 따름. 세포 1 × 10⁶ cells/flask 강도 파종, 24시간 배양 세포 부착 허용. 10계열 나노입자 동일 농도(100 μg/mL) 배지서 12, 24시간 각각 세포와 배양. 세포 PBS 3회 세척 과량 나노입자 제거, 2.5% 글루타르알데히드 용액 1일 이상 고정. 고정 세포 세척, 산화 오스뮴 1% 탈염수 1시간 염색, PBS 3회, DI 물 2회 세척. 고전적 세포 TEM 프로토콜[17, 18] 수행, 90 nm 두께 섹션 수집 TEM 관찰. MB 방출 pH 값 함수로 6 세포주서 NPs_6/100, NPs_7.5/80 둘 다 연구. 또한 MB 방출 OD 값, MB 방출 백분율 기록 데이터 분석용.

MB@SiO₂ 나노입자 세포 내 섭취 조사

살아있는 세포 공초점 현미경으로 MB@SiO₂ 나노입자 세포 섭취, 세포 내 운명 평가. HepG-2 세포 조기 엔도좀 염색(CellLight Early-endosomes-GFP, BacMam 2.0 ThermoFisher Scientific C10586, 여기/방출 ~488/510 nm) 16시간. 이후 세포 NPs_6/100(MB 여기/방출: 640/650-700 nm) 100 μg/mL 나노입자 농도 특정 시간 간격(2 h, 2.5 h, 3 h, 5 h, 6 h) 배양. 이미지 촬영 전 라이소트래커 LysoTracker™ Red DND-99(Thermo Fisher Scientific L7528, 여기/방출: 577/590 nm) 40분 염색. 염색 용액 제거, 세포 PBS 2-3회 세척. Nikon A1R 공초점 현미경으로 이미지 촬영.

BPSi 공급 후 유전자 발현 변화 평가 전사체 시퀀싱

대조군, BPSi 처리군 총 RNA 추출 Trizol 시약 표준 절차 수행. 시퀀싱 실험 초기 총 RNA 품질 NanoDrop ND-2000 분광광도계 검출. 품질 관리 통과 총 RNA 후속 시퀀싱 실험 사용. 차세대 시퀀싱으로 유전자 발현 비교. 모든 시퀀싱 프로그램 BGI-Shenzhen Corporation(심천, 중국) BGISEQ-500 플랫폼 수행. 시퀀싱 원시 데이터 품질 관리 수행 후속 분석 적합성 판단. 통과 시 유전자 발현 수준 기반 유전자 정량 분석, 선택 시료 간 차이 발현 유전자 유전자 온톨로지(GO) 기능 유의미 풍부 분석 수행.

TFEB-CLEAR 유전자 네트워크 활성화 확인 역전사 정량 중합효소 연쇄 반응(RT-qPCR) 분석

대조군, BPSi 처리군 배양 HepG-2 세포 총 RNA Trizol 시약 추출, BioRT Master HiSensi cDNA First-Strand Synthesis Kit(Hangzhou Bioer Technology Co., Ltd.) 랜덤 프라이머로 cDNA 역전사. cDNA Applied Biosystems™ 7500 실시간 PCR 시스템(Applied Biosystems, Life Technologies, Carlsbad, CA) 액틴 참조 대조로 TFEB-CLEAR 유전자 네트워크 증폭 정량 PCR. 정량 RT-PCR 프라이머 표 S4 나열.

BPSi 공급 후 자가포식 활성화 확인 웨스턴 블롯 분석

대조군, 다른 농도 BPSi 처리군 세포 단백질 RIPA 용해액(Heart Biological Technology Co., Ltd.) 추출. 프로테아제 억제제 RIPA 용해액 첨가 얼음 위 예냉. 세포 전냉 PBS 3회 세척. 액체 완전히 버리고 접시 얼음 위 2분 방치. RIPA 용해액 400 μl 접시 전체 표면 첨가, 피펫 여러 번 흡인, 얼음 위 30분 배양, 접시 여러 번 흔들어 세포 완전 용해. 용해 세포액 1 ml Eppendorf 튜브 이동, 13,000 rpm 10분, 4°C 원심분리. 획득 상등액 끓는 물 10분 끓인 후 -20°C 보관. 단백질 농도 Pierce® BCA Protein Assay Kit(Thermo scientific) 정량.

25 μg 총 단백질 함유 세포 추출물 직접 SDS-PAGE 전기영동, 전이. 막 5% 탈지분유 차단, P62(Proteintech #18420-1-AP), TFEB(Proteintech #13372-1-AP), LC 3B(Abcam #ab192890), β-actin(Proteintech #20536-1-AP) 인식 1차 항체 탐침. 2차 항체 1차 항체 기원 종 따라 선택, 향상된 화학발광(Pierce) 또는 Bio-Rad ChemiDoc XRS+ Gel Imaging System(Bio-Rad, USA) 검출. BPSi 그룹서 P62, TFEB, LC 3B β-actin 상대 정규화 밴드 강도 ImageJ 소프트웨어 농도 분석, 데이터 3회 독립 실험 평균 ± S.D.

PDMPO, pHrodo™ Red 트랜스페린 컨쥬게이트 공초점 현미경 세포 pH 측정

PDMPO 연구

1 × 10⁵ HepG-2 세포 멸균 공초점 플레이트 하룻밤 배양, BPSi 나노입자 100 μg/mL 농도 공급. 다음 날 면역형광 염색 전 슬라이드 0.01 M 인산완충염수(PBS), pH 7.4, 3회 세척, 1 μM PDMPO 염료(Ex/Em = 329/440) 첨가. PBS 3회 세척 후 신선 RPMI-1640 배양 배지 첨가, 형광 현미경(Nikon A1R, 일본) CCD 카메라 5분 내 촬영, Chen 등[19] 절차 따라 라이소좀 청색/녹색 형광 강도 비율 계산.

pHrodo™ Red 트랜스페린 컨쥬게이트 연구

HepG-2 세포 동일 방식 공초점 플레이트 24시간 배양 부착, 플레이트 얼음 위 10분 보관. 차가운 라이브 셀 이미징 솔루션(20 mM 포도당, 1% BSA) 세포 세척. 라이브 셀 이미징 솔루션 25 μg/mL pHrodo™ Red 트랜스페린 컨쥬게이트(Ex/Em = 560/585 nm) 첨가, 37°C 20분 배양, 라이브 셀 이미징 솔루션 세포 세척. 관찰 공초점 현미경 수행. 현미경 이미지 강도 정량 분석 ImageJ 소프트웨어 수행.

세포 라이소좀 pH 검출

A549, HepG-2, HCT8, HCT15, HCT116, B16 세포 75 cm² 배양 플라스크 배양, 세포 70% 증식 시 NPs 공급, 6시간 후 세포 수집. 세포 반복 동결-해동으로 세포 내 MB 완전 방출. 세포 용해액 12000 r/min 10분 원심분리. 상등액 획득 660 nm 흡광도 측정 총 방출 MB 양 계산. 표준 pH서 NPs_6.0/100 흡광도 비교해 각 세포 pH 값 획득.

통계 분석

통계 분석 SPSS15.0 소프트웨어 독립 그룹 이원 분산 분석(ANOVA), Tukey HSD 다중 비교 테스트 사용. 통계적 유의성 P < 0.05 기준.

결과 및 논의

먼저 이중 PEG 기능화 검은 다공성 실리카 나노입자(BPSi NPs)(협력 연구실 제공[12]) 공급 시 세포 차이 유전자 발현 검출. 제타 전위 -18.5에서 +2.8 mV 변화로 표면 이중 PEG화 성공 입증(그림 S1a). BPSi 나노입자 평균 직경 156 nm(그림 S1b). 차이 유전자 발현 클러스터 히트맵 기반(그림 S2), 2배 이상 차이 유전자 발현 추가 조사 선정. Go, KEGG 차이 유전자 분석 도입. Go 풍부 버블맵(그림 1a)서 대사, 라이소좀 관련 유전자(식균소체 조립, 식균작용, 이물질 대사 과정) 추가 분석 선정. 특히 TFEB-CLEAR[17] 관련 유전자 발현 유의미 증가. RT-PCR 결과(그림 1b) 유전자 시퀀싱 결과 검증, TFEB-조정 라이소좀 발현 조절(CLEAR) 경로 유전자 유의미 증가: CTSD, CTSF, TFEB, MFN1, LAMP2, TPP1. 이 유전자들 라이소좀 경로 표시(그림 S3). 발현 대조군보다 높고 통계적 유의성(P_{BPSi VS Control} < 0.05). TFEB 라이소좀 유전자 발현 양성 조절, 라이소좀 개체군 제어, 라이소좀 기질 세포 분해 촉진.

BPSi 공급 후 HepG-2 세포 자가포식 활성화. a 전사체 시퀀싱 발견 차이 발현 유전자 GO 풍부 버블맵. b BPSi 처리 후 TFEB-CLEAR 유전자 네트워크 유전자 변화 RT-qPCR 실험 검증. c BPSi 처리 후 P62, TFEB, LC3B II/I 단백질 발현. d 대조군 대비 BPSi 처리군 P62, TFEB, LC3B II/I 단백질 정규화 밴드 회색 강도. 데이터 평균 ± S.D. 제시.

또한 TFEB 자가포식 조절, 과발현 시 라이소좀 생합성 유도, 자가포식 발생 촉진 주요 기능으로 배양 세포서 자가포식체 생성 유의미 증가[20]. 웨스턴 블롯 분석으로 BPSi NPs 공급 시 세포 자가포식 발생 여부 추가 입증. 웨스턴 테스트 목적 TFEB 발현 증가, BPSi 공급 후 세포 자가포식 발생 추가 확인. LC3B, P62 단백질 모두 자가포식 마커. 자가포식 발생 시 미세소관 관련 단백질 1A/1B-라이트 체인 3B(LC3B) II/I 발현 증가. p62 소포체 라이소좀 운반 수용체, 유비퀴틴화 단백질 응집체 제거 수용체, 자가포식 발생 시 발현 감소. 그래서 웨스턴 실험서 이 단백질들 발현 측정.

그림 1c, d 웨스턴 블롯 결과서 TFEB(P_{80 μg/ml VS control} = 0.000008), LC3B II/I(P_{80 μg/ml VS control} = 0.000297), p62(P_{80 μg/ml VS control} = 0.000016) 단백질 모두 유의미 상향 조절. TFEB, LC3B II/I 단백질 상향 조절 자가포식 활성화 지시[18], BPSi 포식 자가포식 발생 촉진 의심. 그러나 p62 단백질 자가포식 과정 중 감소해야 함, 엔도좀 라이소좀 운반 캐리어 단백질 성격으로 최종 분해되기 때문. 본 연구서 p62 유의미 상향 조절 엔도-라이소좀 융합 과정 중 분해 종료 지시[21], 엔도/라이소좀 소포 pH 증가 때문일 수 있음. 따라서 BPSi 포식 최초 자가포식 발생 유도, 아미드 알칼리성으로 엔도/라이소좀 pH 값 증가시켜 자가포식 과정 억제 가능.

BPSi 포식 엔도/라이소좀 pH 증가 특성 입증 위해 두 상용 pH 형광 프로브 사용. pHrodo™ Red 트랜스페린 컨쥬게이트(Thermo Fisher #P35376), RatioWorks™ PDMPO.

pHrodo™ Red 상용 세포 내 pH 지시약 보통 중성 pH 약한 형광, pH 낮아질수록 형광 증가. ~6.5 pKa, 560/585 nm 여기/방출로 9-4 범위 세포질 pH 정량 가능. 6 세포주 결정서 BPSi NPs 포식 엔도/라이소좀 pH 값 증가 능력 정성적 분석 결론 도출, 적색 형광 신호 약화로(그림 S4, S5). 그러나 제품 조작 프로토콜 따라 여러 번 반복 실험 후 서로 다른 세포주 BPSi NPs 공급 전후 정확한 pH 값 감소 정량 분석 어려움, 강도와 pH 값 간 상관관계 확립 안 됨.

PDMPO BPSi 포식 후 pH 값 변화 지시 더 나은 해결책으로 사용, 비율 이미징 기술 pH 정량 측정에 도입. PDMPO[2-(4-피리딜)-5-((4-(2-디메틸아미노에틸-아미노카바모일) 메톡시) 페닐) 옥사졸] 산성 친화성 이중 여기, 이중 방출 pH 프로브 특성. 낮은 pH 강렬한 녹색 형광, 높은 pH 강렬한 청색 형광 방출. 이 독특한 pH 의존 형광으로 pKa = 4.47 산성 소기관(라이소좀 등) 이상적 pH 프로브. PDMPO 살아있는 세포 산성 소기관 선택적 표지, 두 개별 방출 피크 비율 측정으로 살아있는 세포 pH 변동 모니터링 가능. 그러나 BPSi 공급 전후 6 세포주 pH 값 측정 여전히 실패. 그림 S6 결과서 BPSi 공급 전후 6 세포주 모두 유의미 차이 미관찰. 청색/녹색 비율과 pH 값 간 상관관계 확립됐으나(그림 S7), pH 4-5 비선형 상관관계로 PDMPO 방법 엔도/라이소좀 BPSi 공급 전후 정량 분석 실패.

위 두 상용 pH 지시약 데이터서 PEG 장식 나노입자(PEG 사슬 아미드) 알칼리성 아미드 특성으로 엔도/라이소좀 pH 증가 유발 최초 입증. 그러나 정밀 pH 변화(0.1 pH 범위) 정량 분석 없이 자가포식 상태와 엔도/라이소좀 pH 값 간 상관관계 확립 못해 자가포식 예측 실패.

자가분해성 나노입자 이전 연구[13, 14][15, 22] 기반, 75% 에탄올 암모니아수 농도 동일 유지, MB, TEOS 농도 조절. TEOS 양 두 계열 100 μL, 80 μL 설정, 다른 쉘 두께, 기공 크기 얻기 위함. MB 양 10계열 설정, 중심 공동 구조 크기, MB 로딩 효율 다르게 얻기 위함.

프로토콜 첨가 MB, TEOS 양 아래 표 1 기술.

그림 2a, b서 나노입자 크기 MB 양 증가 따라 증가, 두 TEOS 농도(100 μL, 80 μL) 모두서. 동일 MB 농도서 TEOS 양 증가 따라 입자 크기 증가. 또한 TEOS 양 증가 따라 쉘 두께 증가, 원소 매핑으로 입증(그림 2c). 나노입자 분산도 지수(PDI), 표면 전하 그림 S8, 표 S1. 형태 연구 예측: MB 양 증가 따라 로딩 효율 증가, 더 빠른 방출 프로파일 유도, TEOS 양 증가 따라 방출 느려짐. MB 방출 프로파일 pH 변화와 선형 상관관계 가질 최적 나노입자 시스템 얻기 위해 적절한 MB, TEOS 농도 찾아야 함.

특정 MB 또는 TEOS 양 10가지 다른 자가분해성 나노입자 형태 특성. a STEM 이미지. b 나노입자 크기 분포 분석. c 10 자가분해성 나노입자 Si 매핑. 모든 그림 눈금 막대 100 nm. 크기 분포 분석 무작위 선택 100 나노입자 STEM 이미지서 ImageJ 소프트웨어 측정. 데이터 평균 ± S.D. 제시.

MB 로딩 효율 UV-Vis 스펙트럼 결정. 표준 곡선(그림 S9) 계열 MB 용액 농도(6.25-46.88 μg/mL) 사용 먼저 그림, 식 y = 67.63x + 0.10919, R² = 0.9987. 위 식 계산으로 특정 파라미터 10 자가분해성 나노입자 MB 로딩 효율 획득, 상세 데이터 그림 S10.

다른 pH 용액서 MB 방출 프로파일 연구 전 순수 물서 방출 프로파일 연구. 그림 S11, S12서 TEOS 80 μL 모든 나노입자 지속 시간 증가 따라 MB 방출 증가, UV-Vis 흡광도 반영. 또한 MB 캡슐화 양 증가 따라 MB 방출 증가 추세 더 유의미. 방출 속도도 더 빨라짐. 그러나 TEOS 양 100 μL 증가 시 입자 표면 더 치밀해져 MB 양 3.0 mg 미만서 방출 느려짐, 14일 방출 동안 물서 MB 방출 증가 추세 거의 관측 안 됨. MB 양 4.0 mg 이상 증가 시 뚜렷한 MB 방출 증가 추세 관측. 주목할 점: NPs_7.5/80, NPs_6.0/100 나노입자 파라미터 둘 다 시간 경과 따라 견고한 성장, 최초 7일 거의 선형 증가 추세 보인 후 플랫폼 도달.

다른 pH 버퍼서 MB 방출 거동 연구해 특정 파라미터 자가분해성 나노입자 pH 의존 선형 MB 방출 여부 파악.

먼저 pH 4.0 버퍼 용액서 MB 방출 실험 수행. 그림 S13서 동일 TEOS 100 μL 조건 5 나노입자 시스템 MB 방출 속도 유사 추세 관찰. TEOS 80 μL 5 나노입자 시스템(그림 S14)서도 MB 캡슐화 양과 양의 상관관계 관찰.

고농도 MB 농도 차이 확산으로 주변 용액 확산. 큰 농도 기울기 빠른 MB 방출 유도. 순수 물 MB 방출 비교 시 산성 환경 MB 방출 가속화 발견(그림 S13, S14 vs 그림 S11, S12), MB 방출 확산만 구동 아님 나타냄; 산성 용액서 MB 양전하 특성으로 정전기적 반발도 중요한 구동력. MB 로딩 효율, MB 표준 곡선, 측정 희석 비율 기반 각 나노입자 파라미터 방출 백분율 계산. 방출 백분율 pH 4.0 산성 용액 MB 방출 속도 반영, 결과(그림 3) NPs_7.5/80 방출 백분율만 pH 4.0 용액서 선형 방출 보임. 다른 특정 MB, TEOS 파라미터 나노입자 시스템 유사 방출 추세, 방출 백분율 선형 성장 아님. 예외 NPs_6/100, MB 방출 72시간만 플랫폼 도달, 그 지속 시간 전 선형 성장 여부 현 단계서 판단 어려움.

특정 지속 시간 후 pH 4.0 버퍼 10계열 자가분해성 나노입자 MB 방출 백분율. 모든 실험 3회 반복, 데이터 평균 ± S.D. 표시.

동시 근중성, 알칼리 버퍼(pH 6.86, 9.18) MB 방출 프로파일 테스트. 그림 S15, S16, S17, S18 결과 pH 6.86 증가 시 MB 방출 둔화; 중심 MB 농도 증가 시 MB 방출 백분율 감소. pH 9.18서 10 특정 파라미터 모든 나노입자 매우 느린 MB 방출(그림 S19, S20); UV-Vis 흡광도, 방출 백분율 모두 pH 6.86 버퍼 유사 추세, 더 낮은 방출 백분율. 따라서 자가분해성 나노입자 산성 용액서만 MB 방출 선형 성장 보임 명확. 엔도/라이소좀 pH 4-5 범위, 정확히 특정 MB/TEOS 파라미터 시간 함수 MB 선형 성장 pH 범위와 일치. 따라서 자가분해성 나노입자 시스템 엔도/라이소좀 평균 pH 정량 결정 정확 측정 도구 가능성 높음, 자가포식 상태 정확 pH 값 증거 제공.

특정 자가분해성 나노입자 엔도/라이소좀 pH 지시약 전제조건: 나노입자 전체 측정 과정 동안 엔도/라이소좀서 안정적 유지. 둘째, 측정 수행 시 엔도/라이소좀서 MB 방출 원활 발생.

세포 TEM 연구 나노입자 엔도/라이소좀 공위치화, 6 다른 세포주 MB 방출 연구. 세포 TEM 결과 10계열 모든 나노입자 HepG-2 세포 24시간 배양 후 엔도/라이소좀 내 탈출 없이 잔류(그림 4). 그림 4 사용 HepG2 세포 직경 약 10-20 μm, MB@SiO₂ 나노입자 직경 75-200 nm 사이, 저배율 이미지서 나노입자 형태 명확히 하기 어려움(그림 S21 참조). 다른 5 세포주 나노입자 세포 내 위치 추가 조사, 4 나노입자 무작위 선정 나노입자 엔도/라이소좀 내 포획 입증(그림 S22). 모든 파라미터 나노입자 24시간 배양 후 다른 5 세포주서 중심 공동 구조 보임, MB 방출 나타냄. 더 정밀 관찰서 다른 공동 크기로 MB 방출 다를 수 있음 발견, (1) 다른 세포 엔도/라이소좀 pH 다름, (2) 나노입자 MB 방출 엔도/라이소좀 pH 매우 민감, 특히 NPs_6/100, NPs_7.5/80 지적. 그림 S23서 나노입자 공급 2시간 후 이미 엔도사이토시스 실현, 소포체 내 잔류, 이후 나노입자 점진적 라이소좀 축적 확인.

10계열 나노입자 12, 24시간 배양 후 세포 TEM 연구 엔도/라이소좀 내 나노입자 공위치화. TEM 이미지 눈금 막대 200 nm

pH 값과 OD 값 간 상관관계 pH 4.0-4.8 범위 조사. 그림 5, S24 결과 NPs_6/100, NPs_7.5/80 나노입자 시스템서 MB 방출 pH 4.0-4.8 범위 pH 함수로 선형 감소 보임.

특정 배양 지속 시간(6 h, 12 h, 24 h) 후 NPs6/100, NPs7.5/80 MB 방출 pH 값 함수. 6 h, 12 h NPs6/100, NPs 7.5/80 MB 방출 pH 값 함수 선형 상관 방정식도 계산. 모든 실험 3회 반복, 데이터 평균 ± S.D. 표시.

OD 값 MB 로딩 효율, 공급량 기반 MB 방출 백분율 변환. 그림 S25서 최초 6시간 NPs_6/100, NPs_7.5/80 나노입자 시스템 MB 방출 백분율도 pH 값 함수로 나타남. 6 h, 12 h 방출 지속 시간 각각 잔차 제곱합, 피어슨 상관계수 계산, 잔차 제곱합 선형 피팅 밀도와 음의 상관관계, 피어슨 상관계수 절댓값 1에 가까울수록 더 선형. 표 S2, S3서 최고 선형도 NPs_6.0/100 나노입자 시스템 피팅, 그 다음 6 h 방출서 NPs_7.5/80.

이때 정밀 pH 값 모니터링 방법 확립, 특히 0.1 pH 값 간격 이하 정확도. 즉 엔도/라이소좀 pH 값과 자가포식 상태 간 상관관계 파악 큰 가능성, 자가포식 메커니즘 연구, 자가포식 과정 예측 큰 의의. 그림 S26서 HepG-2 세포 MB 방출 4시간 배양 후 이미 플랫폼 도달. 따라서 6 h 관찰 시점 선택.

나노입자 세포 상호작용 지속 시간 6 h NPs_6.0/100 6 세포주 MB 방출 신중 조사. 간암 HepG-2, 대장암 HCT8, HCT 15, HCT 116, 폐암 A549, 근육흑색종 B16 세포주 포함.

표 2서 6 암세포주 엔도/라이소좀 0.01 pH 값 정확도로 명확히 구별, 상용 안구 내 pH 지시약 키트론 불가능.

또한 BPSi 나노입자 배양 전후 HepG2 세포 엔도/라이소좀 pH 값 재평가. BPSi 섭취 엔도/라이소좀 pH 값 유의미 증가, 4.70 ± 0.09에서 5.59 ± 0.05로, BPSi 섭취 유도 자가포식 최초 발생 후 자가포식 플럭스 종료 이유 완벽 설명. BPSi 세포 내 섭취 엔도/라이소좀 양 증가, 유전자 시퀀싱 결과 일치, 자가포식 관련 유전자(TFEB-CLEAR) 활성화. 한편 엔도/라이소좀 pH 값 증가에 의한 자가포식 종료 웨스턴 블롯 연구 p62 단백질 상향 조절 결과와도 일치.

논의

나노입자 일반적으로 세포 자가포식 유발[23], 연구서 중성 또는 음이온 표면 나노입자 자가포식 반응 자가포식 화물 강화된 청소 관련. 반면 양이온 표면 나노입자 세포 노출 TFEB 경로 전사적 상향 조절, 라이소좀 기능 장애, 궁극적 자가포식 플럭스 차단[7]. 우리 결과 이전 결론과 일치. 본 연구 전사체 시퀀싱, RT-qPCR, 웨스턴 실험 통해 BPSi 나노입자 공급 후 HepG2 세포 자가포식 관련 유전자, 단백질 발현 증가 발견. 그러나 자가포식 활성화 시 자가포식 관련 P62 단백질 발현 수준 감소 안 함. BPSi 나노입자 표면 PEG-아민 라이소좀 pH 값 상승시켜 P62 분해 억제 의심. 기존 라이소좀 pH 지시약 우리 추측 검증 못 함. 살아있는 세포 라이소좀 pH 정확히 측정 위해 자가분해성 나노입자 시스템 기반 엔도/라이소좀 pH 정성 결정 새 방법 확립. 특정 MB/TEOS 파라미터 10 나노입자 시스템 최적 pH 민감 반응 측정법 얻기 위해 사용. 내측에서 외측 방사형 MB 농도 기울기 MB 방출 주요 구동력. 약물 방출 캐리어 분해 동시 진행, 확산 조절 메커니즘 구동. 게다가 pH 값 감소 시 수소 이온 농도 증가, 강화된 정전기적 상호작용 내측 MB 중성 용액보다 빠른 방출 촉진[24]. 최적화 중심 공동 나노입자 시스템 중심 고농도 MB 정밀 pH 값 범위 pH 4.0-4.8 선형 함수로 방출, 정확히 라이소좀 pH. 마지막으로 자가분해성 나노입자 기반 정성 pH 지시약으로 6 세포주 라이소좀 평균 pH 값 검출 성공. 또한 이 시스템으로 HepG-2 세포 BPSi 나노입자 포식 전후 라이소좀 pH 변화 정성 구별, BPSi 포식 후 자가포식 발생 후 종료 메커니즘 규명. 자가분해성 나노입자 시스템 루멘 pH 값 연구 새 길 개척, 세포 신호 전달, 대사 더 잘 아는 새 도구 제공, 암 치료 새 방법, 길 제공[25, 26].

결론

본 연구서 BPSi 전사체 시퀀싱 통해 세포 자가포식 촉진 발견, 나노입자 표면 아미노기 라이소좀 pH 증가시켜 자가포식 플럭스 분해 억제. 따라서 라이소좀 pH 자가포식 단계 유의미 영향. 정확한 라이소좀 pH 정보 획득 자가포식 인식 촉진. 그러나 기존 형광 라이소좀 pH 지시약 넓은 라이소좀 pH 범위만 결정 가능, 자가해리 시스템 기반 정밀 라이소좀 pH 지시약 확립. MB@SiO₂ 합성 파라미터 조절로 나노입자 탑재 MB 방출 pH와 선형, 음의 상관관계. 나노입자 세포 진입 후 주로 라이소좀 잔류. 세포 내 방출 MB 양 측정으로 라이소좀 pH 값 선형 함수 따라 정확히 계산 가능. 확립된 정밀 pH 지시약 라이소좀 pH 값 정밀 연구 새 도구, 방법론 제공, 자가포식 추가 정보 획득 촉진.

데이터 및 재료 가용성

본 연구 생성, 분석된 모든 데이터 본 게재 논문 및 보충 정보 파일에 포함.

약어

BPSi:

검은 다공성 실리콘 (Black mesoporous silicon)

FBS:

태아 소 혈청 (Fetal bovine serum)

GO:

유전자 온톨로지 (Gene ontology)

HCl:

염산 (Hydrochloric acid)

KEGG:

교토 유전체 백과사전 (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)

MB:

메틸렌 블루 (Methylene blue)

NaBr:

브로마이드 나트륨 (Sodium bromide)

NaSi:

나트륨 실리사이드 (Sodium silicide)

NH4Br:

브로마이드 암모늄 (Ammonium bromide)

NPs:

나노입자 (Nanoparticles)

OD:

광학 밀도 (Optical density)

PBS:

인산완충염수 (Phosphate-buffered saline)

PDMPO:

2-(4-피리딜)-5-((4-(2-디메틸아미노에틸-아미노카바모일) 메톡시) 페닐) 옥사졸

RT-qPCR:

역전사 정량 중합효소 연쇄 반응 (Reverse transcription quantitative polymerase chain reaction)

TEOS:

테트라에틸 오르토실리케이트 (Tetraethyl orthosilicate)