신경 보호를 위한 뇌 표적 폴리소르베이트 80 유화 도네페질 약물 로딩 나노입자

자료 및 방법

자료

다음이 사용되었습니다. 콜레스테롤 소수성으로 변형된 풀루란(수제) [30]; 도네페질(Shanghai Ziqi Biotechnology Co., Ltd.); 폴리소르베이트 80(Tianjin Fuchen Reagent Institute); 인도시아닌 그린(ICG) 염료(Tianjin Baiying Biological Technology Co., Ltd.); 폴리소르베이트 80(Tween 80, PS)(Tianjin Fuchen Reagent Office); 검은 쥐(Hunan Slake Jingda Laboratory Animal Co., Ltd.); Aβ25-35(US Sigma); 테트라메틸 아조졸 염(MTT)(US Sigma); 신생아 소 혈청(U.S. Gibco); 젖산 탈수소효소 키트(LDH)(Nanjing Jiancheng Biological Co., Ltd.); AO/EB 이중 염색 형광 키트(Sino Pharmaceutical Group Chemical Reagent Co., Ltd.); 및 Central South University의 Second Xiangya Hospital 신경과에서 얻은 PC12 세포(쥐 부신 갈색세포종 세포). SH-SY5Y 세포(인간 골수 신경모세포종 세포)는 ATCC Cell Bank(Manassas, VA, USA)에서 구입했습니다.

나노입자의 준비

DZP 및 CHP 비율(w/w)(10:20, 4:20 및 2:20)이 서로 다른 세 가지 유형의 나노입자가 문헌에 보고된 방법에 따라 물 투석을 통해 먼저 성공적으로 준비되었습니다[31]. 일정 농도의 DZP-CHP 나노입자를 10mL의 일정한 부피로 비이커에 첨가한 다음, 폴리소르베이트 80(PS) 유화제(농도 0.7mmol)를 포함하는 다른 비커에 흡입하여 1시간 동안 침전시켰다. 그런 다음 혼합물을 EP 튜브에 넣고 3분 동안 초음파 처리했습니다(출력 전력 100W, 간헐적 펄스 작동 모드:펄스 폭 2.0초, 간헐적 시간 2.0초). 균일한 분산이 얻어질 때까지 작업을 3회 반복하였다[32]. 여과를 통해 불순물을 제거한 후 최종적으로 폴리소르베이트 80 유화 도네페질 약물 로딩 나노입자(PS-DZP-CHP)를 얻었다.

나노 입자의 특성

나노입자 형태

DZP 대 CHP 비율이 1:2, 1:5 및 1:10인 DZP-CHP 나노입자(DCP)의 모양, 표면 형태 및 크기를 Tecnai F20 투과 전자 현미경으로 분석했습니다. CHP, DZP-CHP 및 PS-DZP-CHP 나노입자 한 방울을 탄소가 코팅된 구리 메쉬에 놓아 얇은 액체 필름을 형성했습니다. 그 다음, 2%(w/v) 인텅스텐산 용액을 사용하여 필름의 자연 건조 후 샘플의 음성 염색을 얻었다. 새로 준비한 나노입자 수용액을 깨끗한 실리콘 웨이퍼에 적가하고 상온에서 건조시킨 후 JSM-6700F 전계방출 주사형 전자현미경으로 표면 구조를 관찰하였다.

나노입자 크기 및 제타 전위

DZP-CHP 및 PS-DZP-CHP 나노 입자의 크기, 다분산 계수(PDI) 및 제타 전위를 동적 광산란(DLS)을 사용하여 분석했습니다. 얻어진 균일 현탁액의 평균 입도 및 입도 분포를 각각 3회 측정하였다.

체외 약물 방출

도네페질의 방출은 동적 물 투석을 사용하여 측정되었습니다. DZP-CHP 및 PS-DZP-CHP 나노입자 1mg을 인산완충식염수(PBS, pH 7.4, 농도 0.01M) 5ml에 녹인 다음 투석백에 옮겨 동일한 용액에 100℃에서 보관했습니다. 자기 교반으로 37°C의 일정한 온도. 0, 0.5, 1, 2, 4, 8, 12, 24, 48, 72시간에 4밀리리터의 PBS를 동일한 pH에서 동일한 부피의 PBS로 희석했습니다. 자외선-가시광선 분광광도법을 사용하여 서로 다른 시간에 312nm에서 투석액의 흡광도를 감지했습니다. 용액의 함량은 표준곡선으로 결정하였고, 방출시험은 시험관내에서 3회 반복하였다. 도네페질의 방출 백분율은 다음 공식에 따라 계산되었습니다.

Cn은 Tn 시점의 샘플 농도(μg/mL)입니다. V는 PBS 방출 용액의 총 부피, mL이고; Vn은 Ti 시점에서의 PBS 방출 액체 부피, mL이고; Ci는 Ti 시점에서의 도네페질 농도, μg/mL입니다.

등온 적정 열량계(ITC)

CHP 나노입자 용액에 일정 농도의 PS 용액을 적하하고 ITC(vip-itc, Microcal, Northampton, MA, USA)로 열 변화를 측정하였다. CHP 나노입자 용액은 DZP 대 CHP 비율(1:2, 1:5 및 1:10)이 서로 다른 세 가지 유형의 나노입자를 포함했습니다. 모든 용액은 적정 전에 탈기되었습니다. 전체 시스템의 온도는 25°C로 일정하게 유지되었습니다.

뇌 표적을 관찰하기 위한 동물 실험

ICG 표지 도네페질 CHP 나노입자의 제조

CHP-DZP 400mg과 ICG 20mg을 분석 저울로 칭량하고, DMSO를 적당량 첨가하여 충분히 혼합 및 용해시켰다. 그 후, 상기에서 얻은 용액을 피펫으로 투석백에 적가하고, 증류수를 매시간 1회 교체하였다. 3시간 후 증류수를 2시간마다 교체하고 DMSO가 완전히 투석될 때까지 48시간 동안 매번 400~800mL의 증류수를 추가했습니다. 그 후, 위의 용액을 피펫으로 메스플라스크에 옮겨 일정한 부피를 얻은 다음 초음파로 2분간 처리하였다. 0.45μm 필터 멤브레인을 통한 여과로 ICG 라벨이 부착된 DZP-CHP 나노입자(ICG-DZP-CHP)가 생성되었으며, 이를 별도로 포장하여 향후 사용을 위해 4°C의 냉장고에 보관했습니다.

유화 형광 도네페질 CHP 나노입자의 제조

10mL 비이커에 ICG-DZP-CHP 적당량을 넣고, 1‰(v/v) 폴리소르베이트 80(PS) 유화제를 첨가하였다. 비이커를 1시간 동안 보관한 다음 100W에서 2분 동안 초음파 처리를 위해 EP 튜브로 옮겼습니다. 균일한 나노 용액이 얻어질 때까지 위의 조작을 3회 반복했습니다. 마지막으로, 여과되고 ICG로 표지된 유화 도네페질 약물이 로딩된 나노입자를 얻었다(PS-ICG-DZP-CHP).

나노입자에 대한 APOE의 결합을 확인하기 위한 MST 실험

모든 MST 실험은 Monolith NT.115 시스템(201810-BR-N024)에서 수행되었습니다. 모든 용액은 탈이온수와 분석용 시약으로 준비되었습니다. 버퍼를 준비하고 실온에서 보관했습니다. 단백질 샘플은 사용할 때까지 얼음에 보관되었습니다[33]. PS-ICG-CHP 나노입자(55.6μM)를 탈이온수로 40nM으로 희석하고 형광을 위해 ICG를 로드했습니다. APOE 용액(30μl, 55.6μM)을 준비하고 16개의 모세관을 1에서 16으로 표시했습니다. 먼저, 튜브 1에 APOE 20μl, 튜브 2~16에 10μl를 가했습니다. 그런 다음 튜브 1에서 튜브 2로 용액 10μL를 옮기고 완전히 혼합했습니다. 그 후, 10μl의 용액을 튜브 2에서 제거하고 튜브 3으로 옮겼습니다. 이 작업을 튜브 16에서 최종적으로 10μL의 용액이 제거될 때까지 반복하여 각 튜브의 용액이 동일한 부피가 되도록 보장했습니다. 10 마이크로리터의 희석된 나노입자를 각 튜브에 첨가하고 완전히 혼합하여 측정을 시작했습니다. MST 테스트 데이터는 NT-analysis 소프트웨어로 분석되었고 KD 피팅은 소프트웨어 지침에 따라 질량 작용의 법칙에 따라 수행되었습니다.

뇌 표적 관찰을 위한 생체 내 형광 이미징 기술

체중이 각각 약 18~22g인 건강한 검은색 마우스를 선택하고 PS-ICG-DZP-CHP 그룹과 ICG-DZP-CHP 그룹의 2개 그룹으로 무작위로 나누었습니다. 모든 마우스에 꼬리 정맥을 통해 200μg/ml의 위 그룹 약물 200μl를 주입하고 0.5시간 후 1% 펜토바르비탈 나트륨(50mg/kg)으로 마우스를 마취시켰다. 그 후 모든 마우스를 여기 파장 765nm-815nm 및 흡수 파장 815nm-845nm로 설정한 이미징 매개변수를 사용하여 라이브 이미저의 촬영 영역에 배치하여 전체 동물의 형광 이미지를 얻었습니다. . 이미징 후 모든 마우스를 해부하고 신장, 심장, 비장, 폐, 간 및 뇌를 제거하여 형광 이미지를 얻었다. 이미징 매개변수는 위에서 설명한 것과 일치했습니다.

나노입자의 조직 분포에 관한 연구

쥐 그룹화 및 샘플링

45마리의 C57BL/6 마우스를 무작위로 15개 그룹으로 나누었습니다:5개 그룹에는 유리 도네페질(유리 그룹), 5개 그룹에는 도네페질 나노입자(나노 그룹), 그리고 다른 5개에는 PS-변형 도네페질 나노입자(PS 그룹)가 주입되었습니다. 정맥 꼬리를 통해 0.25mg/kg. 그런 다음, 주사 후 1시간, 3시간 및 6시간에 혈액을 채취했습니다. 그 후 모든 동물을 희생시키고 심장, 뇌, 간, 신장 조직을 채취하여 파쇄하였다. 그 다음, 상기 조직 0.2g을 정밀히 달아 0.9% NaCl 용액 약 1ml에 가하고 균질화기(65Hz, 150초)로 균질화하였다. 100마이크로리터의 조직 균질액을 0.7mL의 메탄올이 포함된 1.5mL EP 튜브에 정확하게 끌어넣고 볼텍싱하여 단백질 침전을 위해 30초 동안 혼합한 다음 12,000r·min ^-1 에서 원심분리합니다. 10분 동안 마지막으로 100μL의 상층액을 분석을 위해 주입 병에 옮겼습니다.

결정 방법

처음에는 HPLC를 이용하여 검사를 하였지만 감도가 충분히 높지 못하였다. 따라서 후속 LC-MS 실험이 수행되었으며, 이는 강한 특이성과 약물 결정을 방해하는 내인성 물질이 없음을 보여주었습니다. LC-MS 프로토콜은 생물학적 시료 측정 지침을 준수했습니다. 크로마토그래피 조건은 다음과 같았다:이동상 A, 물(0.1% 포름산 함유); 이동상 B, 메탄올(0.1% 포름산 함유); 등용매 용리:A30%-B70%; 유속, 0.3 mL· min ⁻¹ ; 컬럼 온도, 35°C; 주입 부피, 10 μL. 충돌 조건은 다음과 같습니다. 전자분무 이온화 소스(ESI) 온도, 150°C; 황폐화 가스 유량, 550L·h ⁻¹ ; 황폐화 가스 온도, 500°C. 양이온 검출을 위한 조건은 다음과 같았다:모세관 전압, 3kV; 콘 전압, 30V; 스캐닝 모드, 다중 반응 모니터링(MRM).

세포 실험

세포 배양 및 계대

PC12 및 SH-SY5Y 세포를 10%(v/v) 열불활성화 소태아혈청(FBS) 및 1%(v/v) 페니실린 및 스트렙토마이신이 보충된 고당 DMEM에서 배양한 다음 5를 포함하는 인큐베이터에 보관했습니다. % CO₂ 37°C에서 세포는 80% 합류에 도달하자마자 다양한 실험에 사용되거나 계대되었습니다. 실험 전에 PC12 및 SH-SY5Y 세포를 실험 규모에 따라 필요한 세포 밀도로 콜라겐 유형 I 사전 코팅 플레이트에 접종했습니다.

세포 동결보존

현미경하에서 대수기로 성장하는 것이 관찰되면, PC12 및 SH-SY5Y 세포를 동결시키고 PBS로 2회 세척하고, 트립신 처리하여 세포 현탁액을 형성하고 원심분리 수집을 위해 멸균 원심분리 튜브에 넣었다(1000 r x min ^{- 1} , 3분). 그런 다음 세포 동결보존 용액을 첨가하고 세포 이름과 날짜가 표시된 튜브에 세포를 보관했습니다. 세포를 4°C에서 1시간, − 20°C에서 2시간, − 80°C(동결)의 냉장고에 하룻밤 두어 최종적으로 액체 질소 탱크로 옮겼습니다.

세포 생존율 검출을 위한 MTT 방법

세포 생존율은 MTT 감소 분석을 사용하여 측정되었습니다. 간단히 말해서, PC12 및 SH-SY5Y 세포를 1 × 10 ⁴ 의 밀도로 96웰 플레이트(I형 콜라겐으로 미리 코팅)에 접종했습니다. 세포가 각 웰에 부착될 수 있도록 세포/mL. 24시간 동안 배양한 후 세포를 다양한 농도의 도네페질 CHP 나노용액 또는 유리 도네페질 용액과 함께 2시간 동안 사전 배양했습니다. 그 후, Aβ25-35(최종 농도 20μM)를 각 웰에 첨가했습니다. 처리된 96웰 플레이트를 37°C에서 24시간 동안 인큐베이션했습니다. 그 후, MTT(50μL, 5mg/mL)를 첨가하고 처리된 세포와 함께 37°C에서 4시간 동안 인큐베이션했습니다. 마지막으로 배지를 조심스럽게 제거하고 포르마잔 결정을 DMSO 150μL에 녹였습니다. 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 490nm에서 흡광도를 얻었습니다. 세포 생존율은 처리군의 살아있는 세포의 백분율과 처리되지 않은 대조군의 살아있는 세포의 백분율로 표시됩니다.

세포 상청액의 LDH 활성 측정

PC12 및 SH-SY5Y 세포를 2 × 10 ⁵ 의 밀도로 96웰 배양 플레이트(유형 I 콜라겐으로 미리 코팅됨)에 접종했습니다. 및 3 × 10 ⁵ 세포/mL, 각각. 24시간 동안 배양한 후 세포를 다양한 농도의 도네페질 CHP 나노용액 또는 유리 도네페질 용액과 함께 2시간 동안 사전 배양했습니다. 그 후, Aβ25-35(최종 농도 20μM)를 각 웰에 첨가했습니다. LDH 활성은 키트에 제공된 지침에 따라 측정되었습니다. 간단히 말해서, 배지와 함께 배양된 세포를 수집한 다음 3500rpm에서 원심분리했습니다. 상등액(50 μL)을 동일한 부피의 반응물과 혼합하여 LDH 반응을 개시하였다. 마이크로플레이트 리더를 사용하여 450nm에서 흡광도를 구하고 LDH 활성을 계산했습니다.

아폽토시스 형태를 관찰하기 위한 AO/EB 염색 방법

AO/EB 형광 염료를 사용하여 세포 사멸 세포의 특성을 평가했습니다. PC12 및 SH-SY5Y 세포를 3 × 10 ⁵ 의 밀도로 검은색 12웰 배양 플레이트(I형 콜라겐으로 미리 코팅)에 접종했습니다. 및 4 × 10 ⁵ 세포/웰, 각각. 24시간 동안 배양한 후 세포를 다양한 농도의 도네페질 CHP 나노용액 또는 유리 도네페질 용액과 함께 2시간 동안 사전 배양했습니다. 그 후, Aβ25-35(최종 농도 20μM)를 각 웰에 첨가했습니다. 치료 후 키트에 따라 수술을 진행하였다. 실험 내내 빛을 피했습니다. 마지막으로 세포의 형태를 관찰하였다.

미토콘드리아 막 전위 검출을 위한 로다민 123 염색 방법

MMP는 로다민 123(Rh123) 형광 염료를 사용하여 측정되었으며, 이는 매우 부정적인 특성으로 인해 미토콘드리아에 우선적으로 분포하는 세포 투과성 양이온 염료입니다. PC12 및 SH-SY5Y 세포를 2 × 10 ⁵ 의 밀도로 검은색 24웰 배양 플레이트(유형 I 콜라겐으로 미리 코팅)에 접종했습니다. 및 3 × 10 ⁵ 세포/웰, 각각. 24시간 동안 배양한 후 세포를 다양한 농도의 도네페질 CHP 나노용액 또는 유리 도네페질 용액과 함께 2시간 동안 사전 배양했습니다. 그 후, Aβ25-35(최종 농도 20μM)를 각 웰에 첨가했습니다. 처리 후, 세포를 PBS로 세척하고 10μg/mL 로다민 123과 함께 37°C의 암실에서 30분 동안 인큐베이션했습니다. 배양 후 세포를 PBS로 3회 세척하고 형광 플레이트 리더를 사용하여 488 nm 및 510 nm에서 형광 강도를 측정했습니다.

통계 처리 및 데이터 분석

모든 실험은 3회 반복하였으며, 그 결과를 평균 ± 표준편차로 나타내었다. GraphPad Prism 통계 소프트웨어가 사용되었으며 일원 ANOVA, Student's t 테스트 및 기타 방법을 사용하여 통계적 분석을 수행했습니다. 피 <0.05는 차이가 통계적으로 유의함을 나타냅니다.

결과

나노입자의 특성

CHP는 DZP를 탑재할 수 있는 소수성 코어가 있는 나노입자를 형성하기 위해 자체 응집합니다. 약물 대 나노물질 비율이 1:2, 1:5 및 1:10인 DZP가 장착된 CHP 나노입자(DCN)는 DCN1, DCN2 및 DCN3으로 명명되었습니다. 주사전자현미경 결과에 따르면, CHP 나노입자는 구형 구조를 나타내었고, DZP 로딩 후 DCN도 그림 1과 같이 구형이었다. CHP 나노입자의 평균 크기와 제타 전위는 257 ± 3.05 nm 및 -2.81이었다. 각각 ± 0.27mV입니다. DZP 로딩 후, 평균 크기는 각각 273 ± 3.72, 260.7 ± 1.76 및 266.8 ± 4.56 nm이었고, DCNm, DCNm, N 에 대해 1, N , 0.40, − . , 표 1에 나타난 바와 같다. 약물의 포집율은 42.00 ± 5.65%, 86.54 ± 1.31% 및 59.71 ± ,.3,.3,.3,.2,12.02 .90± 12.02 .9± 각각.

주사 전자 현미경 이미지(a , a-CHP, b-DCN1, c-DCN2, d-DCN3), 크기 분포(b a-CHP, b-DCN1, c-DCN2, d-DCN3) 및 제타 전위(c a-CHP, b-DCN1, c-DCN2, d-DCN3) 나노입자

ITC 측정

DCN의 경우 전체 반응 과정에서 반응이 주로 상향 피크를 보였고(그림 2), 상향 피크가 열 방출 반응을 나타내기 때문에 흡열 반응이었다. 따라서 PS는 DCN 표면에 자발적으로 흡착될 수 있습니다. PS 친화도는 (14.7 ± 2.76) × 10 ⁴ M ⁻¹ , (29.8 ± 1.66) × 10 ⁴ M ⁻¹ 그리고 (36.7 ± 3.84) × 10 ⁴ M ⁻¹ , 그리고 PS 커버리지의 정도는 DCN1, DCN2 및 DCN3에 대해 각각 2.65 ± 0.193, 2.70 ± 0.372 및 1.49 ± 0.434였습니다. 이 결과는 PS가 DCN 표면에 높은 친화력으로 흡착되고 DCN2에 더 많은 커버리지를 가짐을 나타냅니다. ∆H> 0 및 ∆S> 0은 세 입자가 주로 PS와의 소수성 상호작용을 통해 결합되었음을 나타냅니다.

a로의 PS(0.9mM) 적정을 위한 등온 열량계 데이터 DCN1, b DCN2 및 c 25°C에서 DCN3(0.02mM) 솔루션 NP 용액으로 적정한 후 PS가 나노입자(NP)와 결합하는 범위, 친화도(KA), 엔탈피 및 엔트로피 변화

세 가지 나노입자 유형의 특성

투석으로 제조된 CHP NP와 DCN은 균일한 구형을 보였다(그림 3a). 위의 연구에 따라 우리는 약물 대 나노 물질의 비율이 1:5인 DZP-CHP 나노 입자를 다음 실험의 대상으로 선택했습니다. DZP-CHP 나노입자는 260.7 ± 1.76nm의 비교적 균일한 입자크기를 가지며, 분산지수는 0.196 ± 0.019였다. 입자 크기는 약물 로딩 후 비교적 안정적으로 유지되었지만 PS 흡착 후 335.2 ± 5.46 nm로 급격히 증가했습니다. DZP-CHP 나노입자의 제타 전위는 -0.66 ± 0.04mV였으며, 폴리소르베이트 80으로 코팅한 후 제타 전위는 -2.22 ± 0.86mV로 떨어졌습니다(그림 3b).

다른 나노 입자의 특성화. 아 a CHP NP의 투과 전자 현미경 사진, b DZP-CHP NP의 투과 전자 현미경 사진, c PS-DZP-CHP NP의 투과 전자 현미경 사진. B:CHP-DZP NP(공급비 1:5) 및 폴리소르베이트 80(공급비 1:5)으로 변형된 DZP-CHP NP의 입자 크기 다이어그램 및 제타 전위 다이어그램

나노입자의 체외 약물 방출

결과는 유리 도네페질과 비교하여 DZP-CHP NP 및 PS-DZP-CHP NP가 72시간 동안 DZP를 방출하고 분명한 제어 방출 효과가 있음을 보여주었습니다. 약물이 담지된 나노입자의 빠른 빠른 방출 속도는 약물 분자의 빠른 용해와 방출로 인한 것일 수 있으며, 그 다음에는 약물 농도의 감소로 인해 약물 농도의 저하가 발생할 수 있으며, 이는 용해 및 확산에 의해서만 영향을 받을 수 있습니다. 그런 다음 폴리소르베이트 80으로 코팅 및 코팅되지 않은 DZP-CHP NP의 시험관 내 약물 방출을 연구했습니다. PS-DZP-CHP NPs의 느린 방출은 폴리소르베이트 80이 작은 소수성 분자 약물에 강하게 흡착되기 때문일 수 있습니다(그림 4).

DZP, DZP-CHP NP(1:5) 및 PS-DZP-CHP NP에 대한 시험관 내 약물 방출 곡선

나노입자 뇌 표적 효과

라이브 형광 이미징 기술을 사용한 뇌 표적화 관찰

유리 ICG를 주사한 쥐의 뇌는 형광을 나타내지 않았지만 PS로 유화된 나노입자를 주사한 뇌는 비유화 나노입자를 주사한 뇌보다 뇌에서 더 강한 형광을 나타냈다. . 5a). 이를 확인하기 위해 ICG-DZP-CHP 및 PS-ICG-DZP-CHP 용액을 정맥 주사한 후 30분 후에 마우스를 해부하고 연구에 필요한 모든 장기를 제거한 다음 형광 이미징을 수행했습니다. PS-ICG-DZP-CHP 나노 입자는 뇌에서 강한 형광을 나타내었지만 다른 기관에서는 관찰되지 않았습니다(그림 5b). 이미지는 PS로 변형된 나노입자가 뇌 조직에서 가장 강한 형광을 나타내는 반면 변형되지 않은 나노입자는 약한 형광을 나타냄을 보여주었다. 유리 ICG를 주입한 마우스의 뇌 조직에서는 형광이 관찰되지 않았습니다(그림 5c).

꼬리 정맥을 통해 다양한 용액을 주입한 후의 생체 내 형광 이미지. 아 200μg/ml DZP-CHP 또는 PS-DZP-CHP 나노입자가 ICG를 얼룩으로 로드한 꼬리 정맥을 통해 주입된 전체 동물의 형광 이미지. 무료 ICG 용액(형광 강도 × 10 ⁹ ), b ICG-DZP-CHP 나노입자(형광 강도 × 10 ⁷ ), ㄷ PS에 의해 변형된 ICG-DZP-CHP 나노입자(형광 강도 × 109). ㄴ Fluorescence images of various organs after injection of DZP-CHP nanoparticles modified by PS via the tail vein. ㄷ Fluorescence images of the brain after dissection. d Brain of mice injected with ICG-PS-DZP-CHP nanoparticles, e brain of mice injected with ICG-DZP-CHP nanoparticles modified with PS, f brain of mice injected with free ICG

Tissue Distribution of Nanoparticles in Mice

Donepezil was distributed in various tissues and mainly in the brain after injection of PS-DZP-CHP nanoparticles. Because it is metabolized through the kidney, the concentration of donepezil is very high in the kidney at certain times (Fig. 6a). In the brain, the concentration of free donepezil reached a peak in a very short time and then decreased rapidly. However, the concentration of donepezil nanoparticles reached a peak much more slowly and then decreased, especially nanoparticles modified with PS, which indicates a sustained-release effect with a delayed peak and prolonged retention time. Obviously, the nanoparticles improved the bioavailability of the drug (Fig. 6b).

아 The concentration of donepezil in the brain, heart, liver and kidney at different times. ㄴ The concentrations of free DZP, DZP-CHP nanosolution and DZP-CHP nanosolution modified with PS in brain tissue at different times

MST Results

MST results showed that the thermal surge changed regularly with increasing ligand concentration, and the K_D value was 3.63 μM, indicating that the ligand effectively binds to the target protein, which verifies that PS can bind to Apo E and is relatively stable. After surface modification with PS, CHP nanoparticles can promote adsorption of Apo E, theoretically confirming that the nanoparticles we designed can specifically target brain tissue because the nanoparticles adsorbed Apo E, which may mediate passage through the blood–brain barrier (Fig. 7).

아 Raw MST data. The fluorescently labeled molecules were observed for 5 s. At this time, the infrared laser was turned on, and a small part of the capillary tube was heated to 2–5 °C. The molecules migrated along a thermal gradient, resulting in changes in fluorescence intensity. When the infrared laser is turned off, the molecules diffuse along the concentration gradient. ㄴ The binding curve is generated by the difference between the initial fluorescence intensity and the intensity in the presence of heat, and the curve conforms to the standard 1:1 binding model

Establishment of a Nerve Injury Model Induced by Aβ_25–35

MTT tests were used to detect the effect of different concentrations of Aβ25-35 on the activity of PC12 and SH-SY5Y cells [Fig. 8a (i), Fig. 8b (i)], and the results showed that with increasing Aβ_25–35 concentration, PC12 and SH-SY5Y cell proliferation activity gradually decreased compared with that in the normal control group. When PC12 and SH-SY5Y cells were treated with 20 μM Aβ_25–35 , PC12 cell activity decreased to 49.5 ± 3.3% that observed in the control group (P  < 0.01), and SH-SY5Y cell activity decreased to 49.7 ± 0.8% (P  < 0.01). An LDH kit was used to detect the effect of different concentrations of Aβ_25–35 on LDH activity in both cell supernatants. Colorimetric tests showed that activity in both supernatants increased gradually with increasing Aβ25–35 concentration. After treatment of the cells with 20 μM Aβ_25–35 , PC12 cell LDH release increased to 359.3 ± 18.3% that in the control group (P  < 0.01), and SH-SY5Y cell LDH release increased to 360.0 ± 18.2% (P  < 0.01). Rhodamine 123 staining was used to detect the effect of different concentrations of Aβ_{25– 35} on the mitochondrial membrane potential in both cell lines [Fig. 8a (ii), b (ii)]. The test showed that the mitochondrial membrane potential in both cell lines decreased gradually with increasing Aβ_{25– 35} concentration (5, 10, 20, 40 μmol/L). Treatment of the cells with 20 μM Aβ_25–35 decreased the PC12 cell mitochondrial membrane potential to 51.3 ± 1.6% that in the control group (P  < 0.01); for SH-SY5Y cells, the MMP decreased to 47.9 ± 1.7% that in the control group (P  < 0.01).

Effects of different concentrations of Aβ_25–35 on injury to PC12 and SH-SY5Y cells. 아 , b The effect of different concentrations of Aβ_25–35 on the cell survival rate, LDH activity and cell mitochondrial membrane potential in PC12 cells and SH-SY5Y cells (*P  < 0.05, ** P < 0.01 vs control group). ㄷ The effect of different concentrations of Aβ_{25– 35} on damage to the morphology of PC12 cells:a control group, b Aβ_{25– 35} (5 μM) injury group, c Aβ_{25– 35} (10 μM) injury group, d Aβ_{25– 35} (20 μM) injury group, e Aβ_{25– 35} (40 μM) injury group. D:the effect of different concentrations of Aβ_{25– 35} on injury to the morphology of SH-SY5Y cells:f—control group, g Aβ_{25– 35} (5 μM) injury group, h—Aβ_{25– 35} (10 μM) injury group, i—Aβ_{25– 35} (20 μM) injury group, j—Aβ_{25– 35} (40 μM) injury group

Inverted fluorescence microscopy was used to observe morphological changes of PC12 and SH-SY5Y cells injured by different concentrations of Aβ_{25– 35} (Fig. 8c, d). The PC12 and SH-SY5Y cells in the control group had higher density, fusiform shapes, fuller cell bodies and longer protrusions. As the concentration of Aβ_{25– 35} increased (5, 10, 20, 40 μmol/L), the number of cells in both cell lines gradually decreased, the cell bodies shrank slightly, and the protrusions began to shrink sharply. When the concentration of Aβ_{25– 35} was increased to 40 μmol/L, the protrusions broke significantly, most of the cells contracted sharply, their shape became irregular, and some cells detached and became suspended in the solution.

Therefore, we treated PC12 and SH-SY5Y cells with 20 μM Aβ25-35 for 24 h to establish a nerve injury model.

Neuroprotective Effect of Drug-Loaded Nanoparticles (DZP-CHP)

MTT assays were used to detect the activity of different concentrations of DZP and DZP-CHP (2.5 μM, 5 μM, 10 μM) in PC12 and SH-SY5Y cells [Fig. 9a (i), b(i)]. Tests showed that treatment of PC12 cells with 20 μM Aβ25-35 alone resulted in a significant reduction in cell viability to 48.4 ± 2.8% that in the control group (P  < 0.01). However, after pretreatment with DZP and DZP-CHP (2.5 μM, 5 μM, 10 μM) solutions, the viability of PC12 cells increased significantly. The viability of PC12 cells in the DZP-CHP group was higher than that in the DZP group (P <0.05). Similarly, treatment of SH-SY5Y cells with 20 μM Aβ_{25– 35} alone resulted in a significant reduction in cell viability to 48.5 ± 4.0% that in the control group (P  < 0.01), while after pretreatment with DZP and DZP-CHP solution (2.5 μM, 5 μM, 10 μM, respectively), the viability of SH-SY5Y cells increased significantly. The viability of SH-SY5Y cells in the DZP-CHP group was higher than that in the DZP group (P <0.05).

Effect of DZP-CHP on Aβ25-35-injured PC12 and SH-SY5Y cells. 아 and b The effects of DZP-CHP on the cell survival rate, LDH activity, and mitochondrial membrane potential of PC12 and SH-SY5Y cells injured by Aβ25-35 (#P  < 0.05, ## P  < 0.01 vs Aβ25-35 group; ▲ P < 0.05 vs DZP group). ㄷ The effect of DZP-CHP on the apoptosis morphology of PC12 cells injured by Aβ25-35; a—control group, b—Aβ25-35 injury group, c—DZP (5 µM), d—DZP -CHP (5 µM), e—DZP (10 µM), f—DZP-CHP (10 µM). D:the effect of DZP-CHP on the apoptosis morphology of SH-SY5Y cells injured by Aβ25-35; g—control group, h—Aβ25-35 injury group, i—DZP (5 µM), j—DZP-CHP (5 µM), k—DZP (10 µM), l—DZP-CHP (10 µM). E:red/green fluorescence ratio

LDH kits were used to detect the effects of different concentrations of DZP and DZP-CHP (5 μM and 10 μM) on the release of LDH from PC12 and SH-SY5Y cells into the culture medium [Fig. 9a (ii), b (ii)]. Colorimetric measurements showed that the release of LDH from PC12 cells that were exposed to 20 μM Aβ25-35 alone increased significantly by 355.1 ± 16.6% (P  < 0.01). In the presence of DZP and DZP-CHP (5 μM and 10 μM), LDH release from PC12 cells dropped significantly. The effect in the DZP-CHP group was higher than that in the DZP group (P  < 0.01). Similarly, the release of LDH from SH-SY5Y cells exposed to 20 μM Aβ25-35 increased significantly to 357.8 ± 12.5% (P  < 0.01). However, after pretreatment with DZP and DZP-CHP (5 μM and 10 μM), LDH release from SH-SY5Y cells decreased significantly. The effect in the DZP-CHP group was higher than that in the DZP group (P <0.05).

According to previous reports, depolarization of the MMP leads to loss of Rh123 from mitochondria, which in turn leads to a decline in intracellular fluorescence. Therefore, to characterize changes in the mitochondrial membrane potential in PC12 and SH-SY5Y cells treated with Aβ25-35, DZP, and DZP-CHP (5 μM, 10 μM), rhodamine 123 was used for detection [Fig. 9a (iii), b (iii)]. The results showed that the fluorescence intensity of rhodamine 123 decreased significantly to 44.3 ± 3.8% (P  < 0.01) after incubation of PC12 cells with 20 μM Aβ25-35 for 24 h. However, pretreatment with DZP and DZP-CHP (5 μM, 10 μM) solutions resulted in a significant increase in fluorescence intensity in a dose-dependent manner, and the effect in the DZP-CHP group was higher than that in the DZP group (P <0.05). Similarly, after treatment of SH-SY5Y cells with 20 μM Aβ25-35 for 24 h, the fluorescence intensity of rhodamine 123 significantly decreased to 42.5 ± 4.6% (P  < 0.01). However, after pretreatment with DZP and DZP-CHP (5 μM, 10 μM), the fluorescence intensity increased significantly, and the effect in the DZP-CHP group was higher than that in the DZP group.

An AO-EB double staining kit was used to detect morphological changes of PC12 and SH-SY5Y cells treated with different concentrations of DZP and DZP-CHP (5 μM and 10 μM) (Fig. 9c, d). After AO-EB double staining, the nuclei of living cells presented green fluorescence under a fluorescence, and the fluorescence of apoptotic cells was orange-red; the higher the degree of apoptosis is, the brighter the fluorescence. Compared with the untreated control group, PC12 and SH-SY5Y cells treated with Aβ25-35 alone showed typical apoptotic characteristics, such as highly condensed and broken nuclei and obvious cell injury. However, pretreatment with DZP and DZP-CHP solution (5 μM and 10 μM) significantly inhibited cell damage and improved cell morphology.