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트리콜로마 크라수스 유래 단백질 코팅 금 나노입자의 그린 합성: 항균, 아폽토시스, 유전자 전달 잠재력

초록

식용 외생균근 곰팡이 Tricholoma crassum을 이용한 단백질 코팅 금 나노입자(AuNP)의 최초 그린 합성을 보고한다. 직경 5-25 nm의 다양한 형태 AuNP가 28 °C에서 1시간 내 형성된다. UV-vis 분광법은 552 nm에서 특성 SPR 피크를 보이며 반응 시간과 pH에 따라 이동한다. SEM, TEM, AFM, XRD, DLS 상세 특성 분석으로 단분산성과 천연 40 kDa 단백질 코로나 확인. 입자는 다제내성 균주를 포함한 그람음성, 그람양성, 진균 병원체에 강력한 항균 활성을 보이며 포자 발아 억제. 혜성 분석은 식물 세포에서 용량 의존적 아폽토시스 유도 나타냄. 40 kDa 단백질 코팅은 육종 180 세포로 효율적 유전자 전달을 촉진하며 GFP 발현으로 입증. 용혈 시험은 20 µl mL⁻¹ 미만에서 무시할 만한 혈액 독성 보여 안전한 치료 창 제시. 발효조 대량 생산 가능으로 이 AuNP를 항균, 항암, 유전자 전달용 다기능 제제로 위치시킴.

배경

농업, 의학, 소비재에서 나노입자의 급속한 채택으로 안전성 프로필 이해 필요성 증대. 생물이나 효소를 이용한 그린 합성은 유해 화학물질 배제로 친환경적, 비용 효율적 경로 제공. 다량의 효소 분비하는 사상균은 세포외 금속 나노입자 생산에 특히 적합. 여러 곰팡이가 금 나노입자(AuNP) 생성 보고되었으나, 이 입자들의 천연 단백질 코팅을 설명한 보고는 드물며, 이는 콜로이드 안정성과 기능화에 중요. 금 나노입자는 내성 유발 없음과 향상된 투과성 및 보유(EPR) 효과로 종양 세포 표적화 가능하여 치료용으로 매력적. 단백질 캡핑 AuNP는 세포 흡수 증진과 약물 또는 유전자 도킹 자리 제공으로 추가 화학적 캡핑 단계 불필요. 그럼에도 생체적합성, 세포독성, 응집 위험은 임상 적용 전 신중히 평가되어야 함.

방법

곰팡이, 세균, 식물 배양 조건

Tricholoma crassum을 나노입자 합성에 배양. 항균 시험에 E. coli(DH5α), A. tumefaciens(LBA4404) 및 다제내성 유도체, 식물 병원체 M. oryzae, A. solani 사용. 토마토와 담배 묘목은 통제 조건(28 ± 1 °C, 16:8 h 명암, 50 µmol m⁻² s⁻¹)에서 배양.

AuNP 합성

균사 매트를 감자 데스트로스 배지(PDB)에서 7일간 28 °C 배양. 24, 48, 72시간 후 1 g 균사를 10 mL 탈수에 24시간 50 RPM 진탕. 여과액(pH 5.2)을 1 mM HAuCl₄와 혼합하여 28 °C 암흑에서 1시간 교반. 여과액 pH(3.5-9)와 반응 온도(0-100 °C) 조절로 입자 크기와 형태 조절. 여과액 부피(×0.5-×2)와 Au3+ 농도(0.5-2 mM) 변화로 합성 추가 정제.

특성 분석 기법

항균 및 항진균 분석

디스크 확산법과 생장 곡선 분석으로 세균 및 진균 균주 억제 정량. 진균 포자 발아는 다양한 AuNP 농도로 평가. 표준 배양 및 현미경 관찰법 사용.

아폽토시스 평가

담배와 토마토 잎 핵에 AuNP 노출 후 혜성 분석으로 DNA 단편화 측정. 다양한 농도(0-30% v/v)와 배양 시간(15-30분) 시험.

육종 180 세포 유전자 전달

플라스미드 pCAMBIA1302(GFP 마커)를 AuNP와 복합화하여 육종 180 세포와 배양. GFP 발현으로 성공적 형질도입 확인. 인간 적혈구로 용혈 분석하여 혈액 적합성 평가.

결과 및 고찰

AuNP 형성 및 분광학적 특성

연노랑에서 보라색으로 1시간 내 전이는 AuNP 형성 지시. UV-Vis 스펙트럼은 24시간 여과액에서 552 nm SPR 피크, 더 긴 배양에서 적색 편이, 높은 pH에서 청색 편이. 최적 합성은 28 °C, 1 mM HAuCl₄로 30일 이상 안정적인 단분산 입자 생성.

합성 파라미터 효과

여과액 부피 또는 Au3+ 농도 증가는 색 강도와 흡광도 상승, ×2 여과액에서 약간 청색 편이. 고온(75-100 °C)은 더 크고 덜 안정적인 입자 생성. 광노출은 입자 크기 증가와 SPR 피크 확대.

형태 및 크기 분포

SEM과 TEM은 구형, 마름모, 육각형, 삼각형 등 5-22 nm AuNP 나타냄. AFM은 10 nm 미만 높이 확인, XRD는 38.23°에서 주요 {111} 회절로 면심입방 금 확인.

항균 활성

AuNP는 E. coli, A. tumefaciens, M. oryzae 성장을 용량 의존적 억제 구역으로 저해. 다제내성 균주도 억제되어 광범위 효능 입증. 생장 곡선 분석은 AuNP 처리 시 대수기 지연과 세포 밀도 감소 보임.

진균 포자 발아

AuNP 농도 증가에 따라 A. solani 포자 발아와 발아관 길이 점진적 감소로 항진균 효능 입증.

아폽토시스 유도 특성

혜성 분석에서 >20% AuNP 노출 시 유의한 DNA 손상, 5-10%에서는 무시할 만한 아폽토시스. 항균 또는 유전자 전달 용도로 세포독성 없는 치료 창 존재.

단백질 코로나 확인

끓인 나노입자의 SDS-PAGE는 T. crassum 세포외 단백질과 동일한 단일 40 kDa 밴드 표시. 단백질 코팅은 입자 안정화와 DNA 결합 자리 제공.

유전자 전달 및 용혈

AuNP-플라스미드 복합체는 육종 180 세포에서 GFP 발현 달성, 무처리 플라스미드는 실패. 용혈은 20 µl mL⁻¹까지 8% 미만으로 낮은 혈액 독성 확인.

결론

식용 외생균근 곰팡이 Tricholoma crassum이 다양한 형태와 견고한 항균, 아폽토시스, 유전자 전달 특성을 가진 단백질 코팅 AuNP의 신속한 그린 합성 가능케 함. 천연 40 kDa 단백질 코로나는 콜로이드 안정성과 기능화 보장, 용혈 데이터는 안전한 치료적 사용 지지. 발효조 대량 생산 가능으로 항균, 항암, 나노의학 응용을 위한 확장 가능한 플랫폼 제공.

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