6-메르캅토퓨린 및 뉴런 투과 펩티드로 변형된 금 나노입자에 의한 SH-SY5Y 세포 성장 촉진

방법/실험

6MP-AuNPs-RDP 접합체 합성

20nm 크기의 구연산염 코팅된 AuNP를 환원법으로 합성했습니다. 간단히 말해서, HAuCl₄ 수용액 ·3H₂ O(100mL, 0.01%)를 30분 동안 격렬하게 교반하면서 가열한 다음, 시트르산 나트륨 용액(10mL, 38.8mM)을 HAuCl₄에 빠르게 첨가했습니다. 해결책. 짙은 적색 용액이 얻어질 때까지 혼합물을 추가로 30분 동안 환류하고 자연적으로 실온으로 냉각했습니다.

6MP-AuNP는 이전 보고서에 따라 실온에서 5시간 동안 AuNP(0.33mM)와 6MP 용액(최종 농도 0.046nM)을 혼합하여 제조되었습니다[12]. 그런 다음, 혼합물을 17,000g에서 원심분리했습니다. 30분 동안 그 후 상층액은 버리고 펠렛(6MP-AuNPs)을 재현탁하고 탈이온수로 3회 세척하였다.

RDP 수정 6MP-AuNP를 얻기 위해 각각 최종 농도가 0.023nM인 RDP(FAM w/ CKSVRTWNEI IPSKGCLRVG GRCHPHVNGG GRRRRRRC, Shanghai Ji'er Biotech. Co., 중국에서 합성) 및 6MP를 AuNP 용액에 동시에 첨가했습니다. (0.33mM) 5시간 후 17,000g에서 원심분리 30분 동안 대조군으로 FAM-표지된 스크램블 펩타이드(FAM-SP; GRNECRIPRV GCVSRWRIGR KGRCHRLRPG GRVNRSHT GC)를 합성하고(Shanghai Ji'er Biotech. Co., China) 6MP-AuNPs-SP-FAM을 병렬로 준비했습니다. 그 후, 입자의 상층액을 버리고, 입자를 각각 탈이온수로 세척하였다. 입자 용액을 0.1M NaOH를 사용하여 각각 pH 9.0으로 조정한 다음 0.22μm 주사기 필터에 통과시키고 사용을 위해 4°C에서 보관했습니다.

입자의 특성

입자의 광학적 흡수를 감지하기 위해 UV/vis 분광광도계(UV-2450, Shimadzu Corp, Kyoto, Japan)를 사용하여 실온에서 흡수 스펙트럼을 측정하였다. 입자 크기 및 제타 전위는 각각 탈이온수로 희석한 후 동적 광산란(DLS) 장치(Zetasizer Nano ZS; Malvern)를 사용하여 측정하였다. 투과 전자 현미경(TEM; Shimadzu)을 사용하여 입자 구조를 관찰했습니다.

세포 배양

SH-SY5Y 세포는 Dulbecco의 변형된 Eagle 배지(DMEM)와 F-12 배지에서 1:1의 비율로 배양하였다. 배지에 각각 10% 송아지 태아 혈청(FCS), 100단위/mL 페니실린 및 100㎍/mL 스트렙토마이신을 보충했습니다. 세포는 5% CO₂와 함께 37°C에서 유지되었습니다. 가습 인큐베이터(Thermo Fisher Scientific, USA)에서. 세포 배양을 위한 모든 시약은 HyClone(미국)에서 구입했습니다.

세포 흡수

SH-SY5Y 세포를 5 × 10 ⁴ 의 밀도로 24웰 플레이트에 시딩했습니다. 세포/웰. 세포 합류율이 60%에 도달하면 FAM으로 표지된 6MP-AuNPs-RDP 및 6MP-AuNPs-SP 최종 농도 0.25μg/mL를 각각 세포 배지에 첨가하여 2시간 배양했습니다. 그런 다음 세포 배지를 버리고 새로운 배지로 교체했습니다. 형광현미경(Olympus, Japan)을 이용하여 세포를 관찰 및 사진촬영하였다.

6MP-AuNPs-RDP가 신경 성장에 미치는 영향

SH-SY5Y 세포를 5 × 10 ⁵ 의 밀도로 24웰 플레이트에 시딩했습니다. 세포/웰 밤새. 그런 다음, 농도가 다른 RDP-6MP-AuNP(0, ​​0.125, 0.25, 0.5, 1.0μg/mL)를 각각 배지에 첨가하여 24시간 배양했습니다. 세포 수는 자동 세포 계수기(Bio-Rad, USA)를 사용하여 계산되었습니다.

또한, 세포 대사 활성은 이전 보고서에 따라 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay로 측정하였다[13]. 간단히 말해서, SH-SY5Y 세포는 5 × 10 ⁴ 밀도로 96웰 플레이트에 접종되었습니다. 세포/웰에 넣고 10% FBS를 포함하는 배지에서 밤새 배양했습니다. 그런 다음 입자를 24시간 동안 미디어에 각각 추가했습니다. 세포를 PBS로 3회 세척한 다음, 100μL의 새로운 배지와 10μL의 MTT(PBS 완충액 중 5mg/mL)를 각 웰에 첨가했습니다. 4시간 인큐베이션 후, 배지를 제거하고 200μL 디메틸 설폭사이드(DMSO)를 첨가하여 생성된 포르마잔을 용해시켰다. 상층액의 흡광도는 마이크로플레이트 리더(Bio-Rad, USA)를 사용하여 490nm에서 측정되었습니다. 첨가하지 않은 셀은 블랭크로 사용하고 용매(0.1M NaOH(pH 9.0)만 있는 셀은 0.1M HCl로 pH 7.4로 조절)만 대조군으로 사용합니다. 상대 세포 대사 활성은 대사 활성(%) =OD₄₉₀로 계산되었습니다. (샘플 공백)/OD₄₉₀ (컨트롤 공백). 각 값은 4개의 독립적인 실험에서 평균을 냈습니다.

신경돌기 성장에 대한 6MP-AuNPs-RDP의 효과를 결정하기 위해 SH-SY5Y 세포를 6웰 플레이트에 이식하고 30% 합류까지 성장시켰다. 그런 다음, 세포를 3일 동안 하루에 한 번 6MP-AuNPs-RDP(0.25μg/mL)로 처리했습니다. 신경돌기 길이는 광학현미경(Olympus, Japan)으로 관찰되었고 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 계산되었습니다[14].

6MP-AuNPs-RDP로 코팅된 표면의 세포 증식

6MP-AuNPs-RDP를 직경 3.5cm의 배양 접시 바닥에 균질하게 플레이팅한 다음 입자가 코팅된 접시에 세포를 이식했습니다. 배양 후, 세포를 광학 현미경으로 관찰하고 신경돌기 길이를 세었다. 용매만 있는 세포를 대조군으로 사용하였다. 각 실험은 독립적으로 4회 반복되었으며 신경돌기 길이 계산을 위해 200개의 신경돌기 평균을 냈습니다.

통계 분석

데이터는 평균 ± SEM으로 표시되었습니다. 데이터는 일원 분산 분석(ANOVA)에 의한 컴퓨터 프로그램으로 분석한 후 SPSS 13.0 소프트웨어를 사용하여 Dunnett의 다중 범위 테스트를 수행했습니다. p와의 차이점 <0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다.

결과

나노 입자의 모양 및 특성

AuNPs 수용액은 가시광선에서 주홍색을 보였다(Fig. 2a, 0s). 6MP를 첨가한 후, 6MP가 AuNPs에 접합될 때 색이 점차 어두워졌고, 최종적으로 5시간의 반응 후에 6MP-AuNPs의 청흑색 침전이 나타났다. pH를 9.0으로 조절하여 침전을 해결할 수 있었으며, 이때 6MP-AuNPs 수용액은 장미빛을 보였다. pH를 pH 7.4로 조정하면 침전이 다시 형성됩니다.

나노입자의 반응과정과 특성. 아 6MP-AuNP를 제조하기 위한 반응 과정. 6MP를 AuNP 용액에 첨가한 후, 용액의 색이 변하고 5시간 내에 점차적으로 침전이 형성되었습니다. ㄴ 6MP-AuNPs-RDP 침전은 0.1M NaOH로 pH를 9.0으로 조정했을 때 용해되었습니다. ㄷ 입자 크기 분포의 DLS 측정. d AuNP, 6MP-AuNP 및 6MP-AuNPs-RDP의 제타 전위. 이 TEM 아래의 입자 구조

6MP-AuNPs-RDP는 AuNPs를 pH 9.0에서 6MP 또는 RDP의 티올기와 접합하여 제조했습니다. 6MP-AuNPs-RDP 수용액은 6MP-AuNP 수용액과 동일한 장미색을 나타냈다(Fig. 2b). 6MP-AuNPs-RDP 용액의 pH를 7.4로 조절하면 용액 바닥에 입자가 침전되었다.

6MP-AuNPs 및 6MP-AuNPs-RDP 용액(pH 9.0)의 크기와 제타 전위를 각각 DLS로 조사했습니다(그림 2c). 데이터는 6MP-AuNPs-RDP의 평균 크기가 6MP-AuNPs(24.6 대 20.5 nm)보다 약간 더 큰 반면 전자의 제타 전위는 후자(- 25.8 대 - 37.2 mV)보다 훨씬 더 높은 것으로 나타났습니다. 이는 양이온성 RDP가 입자의 표면 전위를 증가시켰음을 시사합니다. TEM 이미지는 두 나노입자가 모두 구형임을 보여주었습니다(그림 2d).

나노입자의 세포 흡수

입자 용액을 pH 7.4로 조정하고 세포 배지에 첨가하면 입자가 응집되기 시작하여 점차적으로 웰의 바닥으로 가라앉았다. 그러나 30분 후, 세포 주변에 명백한 빈 플라크가 나타났고, 6MP-AuNPs-RDP 처리된 세포의 간격은 6MP-AuNPs의 간격보다 입자 응집이 적었습니다(그림 3a). 또한 6MP-AuNPs를 처리한 세포에 비해 6MP-AuNPs-RDP를 처리한 세포 내부에서 더 많은 나노입자가 관찰되었다.

나노 입자의 세포 흡수. 아 0.25μg/mL의 6MP-AuNPs 및 6MP-AuNPs-RDP 용액을 각각 pH 7.4로 조정하고 30분 배양 동안 세포 배지에 첨가했습니다. 입자는 SH-SY5Y 세포로 내재화되거나 웰 바닥에 침전되었습니다. ㄴ 6MP 및 형광 표지 펩타이드 변형 AuNP의 개략도. SH-SY5Y 세포를 입자와 함께 2시간 동안 배양한 후 이미지를 촬영했습니다(c ) 및 형광 강도(d )을 측정하였다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시됩니다. 값은 4개의 독립적인 실험에 대해 평균화되었습니다. ^** 피 <0.01 6MP-AuNPs-SP 처리 세포와 비교

입자가 신경 세포에 들어갈 수 있음을 추가로 확인하기 위해 형광 표지된 펩티드를 입자와 접합했습니다(그림 3b). 이러한 나노 입자와 함께 세포를 2시간 동안 배양한 후, 6MP-AuNPs-RDP 처리된 세포에서 강한 형광이 관찰된 반면, 6MP-AuNPs-SP 처리된 세포에서는 상대적으로 약한 녹색 형광을 볼 수 있었습니다. (그림 3c). Fluorescence Spectrometer(Hitachi Ltd. Co. Tokyo, Japan)로 형광 강도를 측정한 결과 6MP-AuNPs-RDP 처리된 세포가 6MP-AuNPs-SP 처리된 세포보다 훨씬 더 높은 형광 강도를 나타냈다(그림 3d). )는 세포 투과 펩타이드(CPP)의 일종인 RDP가 입자의 세포 흡수 효율을 증가시킬 수 있음을 시사합니다.

나노입자가 신경세포 성장에 미치는 영향

입자가 신경 성장에 영향을 미치는지 여부를 조사하기 위해 MTT 분석과 세포 계수를 모두 사용하여 입자와 함께 24시간 동안 배양한 후 세포 대사 활성과 세포 수를 측정했습니다. 결과는 RDP 단독은 세포 성장에 영향을 미치지 않는 반면, 0.125 및 0.5 μg/mL 이상의 농도에서 6MP-AuNPs-RDP 및 6MP-AuNPs는 용량 의존적으로 세포 대사 활성 및 세포 수를 증가시키는 것으로 나타났습니다(그림 1b). 4a, b). 또한, 6MP-AuNPs-RDP 처리 세포는 6MP-AuNPs 처리 세포보다 대사 활성이 더 높았는데, 이는 6MP-AuNPs-RDP의 세포 투과 효율이 6MP-AuNPs보다 높은 것과 관련이 있는 것으로 보인다.

입자는 세포 대사 활동을 증가시켰습니다(a ) 및 숫자(b ), 6MP-AuNPs 및 6MP-AuNPs-RDP의 농도는 0에서 1.0μg/mL까지 다양합니다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시됩니다. 용매 {0.1M NaOH(pH 9.0)만 있는 세포는 0.1M HCl에 의해 pH 7.4로 조정됨}이 대조군으로 사용되었습니다. 값은 4개의 독립적인 실험에 대해 평균화되었습니다. ^* 피 <0.05, ^** 피 <0.01 RDP 처리 세포와 비교, ^# 피 <0.05 및 ^## 피 <0.01 6MP-AuNPs 처리 세포와 비교

나노입자가 신경돌기 길이에 미치는 영향

입자가 세포 대사 활동을 증가시킬 수 있다는 것 외에도 신경돌기 길이에 대한 입자의 영향은 입자의 고농도(1μg/mL)에서도 관찰되었습니다. 이미지(그림 5a)는 응집된 나노입자가 웰의 바닥에 정착하고 6MP-AuNPs-RDP 처리된 세포 주변에 더 큰 빈 플라크 영역이 나타남을 보여줍니다.

나노 입자는 신경 돌기 성장을 촉진했습니다. 이미지(a ) 및 신경돌기 길이(b ) 세포를 각각 RDP, 6MP-AuNPs 및 6MP-AuNPs-RDP로 24시간 동안 처리한 후. 용매만 있는 세포를 대조군으로 사용하였다. 값은 200개의 신경돌기에 대해 평균화되었습니다. ^* 피 <0.05 및 ^** 피 <0.01 대조군과 비교

24시간 배양 후, 입자를 처리한 세포가 대조군 세포보다 신경돌기의 길이가 긴 반면, RDP 처리 세포와 대조군 사이에는 유의한 차이가 없었습니다. 또한, 6MP-AuNPs-RDP 처리 세포의 신경염은 6MP-AuNPs 처리 세포보다 현저하게 길었다(그림 5b).

도 5의 결과로부터, 6MP는 그의 세포독성으로 인해 모든 SH-SY5Y 세포를 죽였고; 따라서 6MP를 사용하여 플레이트를 코팅하지 않았습니다. 또한, Fig. 도 3, 4 및 5에 도시된 바와 같이, 상대적으로 적은 양의 6MP-AuNPs가 세포에 들어갔고, 신경돌기 길이와 세포 수 모두 6MP-AuNPs-RDP보다 분명히 낮았다. 따라서 6MP-AuNPs-RDP가 세포 성장에 미치는 영향을 조사하기 위한 추가 연구를 위해 선택되었습니다.

6MP-AuNPs-RDP의 반복 투여 후 세포 증식 및 신경돌기 성장

세포 증식 및 신경돌기 성장에 대한 6MP-AuNPs-RDP의 결과를 추가로 확인하기 위해, 6-웰 플레이트에서 세포를 배양한 후 1일, 2일 및 3일에 3회 동안 6MP-AuNPs-RDP를 세포 배지에 첨가하였다(day 0). 그 결과 입자를 처리한 세포의 신경돌기 길이가 대조군보다 확실히 길어졌고(Fig. 6a, b), 세포에 입자를 처리했을 때 세포 대사 활성이 증가하는 것으로 나타났다(Fig. 6c). <그림>

나노 입자는 세포 증식과 신경돌기 성장을 유도했습니다. 아 1, 2, 3, 4일차의 세포 이미지. b 6MP-AuNPs-RDP 처리 세포 및 대조군의 신경돌기 길이. 값은 200개의 신경돌기에 대해 평균화되었습니다. ^** 피 대조군과 비교하여 <0.01. ㄷ 6MP-AuNPs-RDP 처리 세포의 대사 활성. 세포는 3일 동안 하루에 세 번씩 치료를 받았습니다. 처음에는 세포 이식 후 24시간 동안 세포를 배양한 후 6MP-AuNPs-RDP를 세포 배지에 첨가했습니다. 입자의 각 농도는 0.25μg/mL였습니다. d 6MP-AuNPs-RDP로 코팅된 표면에서 세포의 신경돌기 성장 이미지. 6MP-AuNPs-RDP를 직경 3.5cm의 배양접시 바닥에 플레이팅한 후 세포를 접시에 이식하였다. 이 신경돌기 길이는 0~3일에 측정되었습니다. 용매만 있는 세포를 대조군으로 사용하였다. 값은 200개의 신경돌기에 대해 평균화되었습니다. ^** 피 대조군과 비교하여 <0.01, ^* 피 <0.05, ^** 피 <0.01 1일차의 세포와 비교. 파란색 화살표는 대표적인 신경돌기를 가리킵니다.

6MP-AuNPs-RDP 입자를 표면 코팅재로 사용했을 때 신경돌기 성장에 미치는 영향을 알아보기 위해 배양접시 바닥을 6MP-AuNPs-RDP로 코팅한 후 세포를 이식하였다. 이미지는 입자가 세포막에 빠르게 부착된 다음(그림 6d) 입자가 내재화되어 세포질, 핵막 및 세포 핵을 포함한 전체 세포에 분포하는 것을 보여줍니다. 결과는 또한 입자 처리된 세포가 대조군보다 유의하게 더 긴 신경돌기를 가지고 있음을 보여주었습니다(그림 6e).

냉동 보관 후 세포 성장에 대한 나노입자의 영향

입자에 대한 세포 내성을 조사하고 세포가 분리된 성장 상태 후에도 증식 능력을 유지하는지 확인하기 위해, 6MP-AuNPs-RDP 처리된 세포를 지수 성장기에 도달했을 때 동결하고 며칠 동안 보관하였다. 그런 다음 세포를 회수하여 24웰 플레이트에서 배양했습니다(그림 7a). 그 결과 입자 처리된 세포의 수가 유의하게 증가하고 신경돌기가 대조군보다 길어지는 것으로 나타났으며(그림 7b, c), 이는 입자 처리된 세포의 성장이 동결 및 회복 과정에 영향을 받지 않음을 시사한다. .

나노입자는 냉동 보관 후 신경돌기 길이와 세포 수를 증가시켰습니다. (아 ) 세포를 보관하기 전에 6MP-AuNPs-RDP(1.0μg/mL)로 처리하고, 세포를 회수하여 3일 동안 계속 배양하였다. 신경돌기 길이(b ) 및 셀 번호(c ) 6MP-AuNPs-RDP 처리된 세포의 저장 후 유의하게 증가하였다. 용매만 있는 세포를 대조군으로 사용하였다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시됩니다. ^** 피 대조군과 비교하여 <0.01. 파란색 화살표는 대표적인 신경돌기를 가리킵니다.