한 쌍의 압타머를 사용한 샌드위치 측면 흐름 스트립 분석을 통한 Rongalite의 신속한 검출

방법

재료 및 시약

Rongalite는 Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.에서 제공했습니다. HAuCl₄ (trisodium citrate dehydrate)는 Sigma Aldrich(USA)에서 구입했습니다. NaCl, BSA, 자당, 포르말린, PEG20000 및 Tween20은 Beijing Biotopped Science and Technology Co., Ltd.

NC 멤브레인(즉, pall 90, pall 170 및 Millipore 135)은 Pall Corporation 및 Millipore Corporation에서 각각 제공하며 Jiening Biotech Company에서 구입합니다.

음식 샘플, ersi(중국의 얇은 사각형 떡), 국수, 두부, glucono-δ-lactone-tofu는 인근 시장에서 구입했습니다.

지수적 농축에 의한 리간드의 체계적인 진화를 통한 앱타머 준비(SELEX)

SELEX 과정은 다음 단계로 구성됩니다(그림 1):(i) 무작위 DNA 라이브러리를 사용한 표적 배양, (ii) 표적에 결합된 DNA 분리, (iii) 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의한 DNA 증폭 , (iv) 다음 라운드 라이브러리를 위한 단일 가닥 DNA 준비, (v) 비특이적 ssDNA를 제거하기 위해 비표적 물질로 간격 카운터 스크리닝을 포함하는 5-15 주기 동안 i-iv 단계 반복, 및 (vi) 강화 라이브러리의 최종 복제 및 시퀀싱 [16].

일반적인 앱타머 선택(SELEX) 프로세스

압타머는 앞에서 설명한 단계에 따라 스크리닝되었습니다. 간단히 말해서, 각 앱타머의 중앙 40개 기반의 긴 무작위 서열을 갖는 82-mer 뉴클레오티드로 구성된 초기 ssDNA 앱타머 라이브러리가 합성되었습니다(Tsingke Biological Technology). ssDNA 앱타머 풀의 무작위 서열은 5'-GACATATTCAGTCTGACAGCG-N40-GATGGACGAATCGTCTAGC-3'이며, 여기서 N은 A, G, C 또는 T의 무작위 뉴클레오티드를 의미합니다.

이 연구에서는 프라이머 1(5'-GACATATTCAGTCTGACAGC-3')과 프라이머 2(5'-GCTAGACGATATTCGTCCATC-3')를 라이브러리 증폭에 사용했습니다.

rongalite에 특이적으로 결합하는 앱타머를 스크리닝하기 위해 합성된 무작위 ssDNA 라이브러리를 rongalite가 있는 플레이트에 추가했습니다. 다음으로, 결합되지 않은 ssDNA를 세척하여 제거했습니다. 결합된 ssDNA를 회수하고 PCR에 의해 증폭시켰다. 선택 라운드가 증가함에 따라 앱타머의 결합 친화도가 점차 증가했습니다.

특이성과 K _d 개별 앱타머의 값은 Tang의 방법과 유사하게 결정되었습니다[17].

이 작업에 사용된 앱타머 시퀀스는 다음과 같습니다.

<리>

1차 압타머 A09,

5'-비오틴-GACATATTCAGTCTGACAGCGGAAGCGGGTCAGTCCAACTCACGGTCTCGCATGCACGGGAGATGGAACGAATATCGTCTAGC

<리>

이차 압타머 B09,

5'-비오틴-GCTAGACGATATTCGTCCATCTCCCGTGCATGCGAGACCGTGAGTTGGACTGACCCCCTCCGCTGTCAGACTGAATATGTC-HS-3'

이 앱타머 서열(A09 및 B09)은 Tsingke Biological Technology에서 합성 및 구입했습니다.

AuNP 생산

AuNPs는 HAuCl₄의 구연산염 환원을 통해 합성되었습니다. 프로토콜 [18]. UV/Vis 분광광도법(Thermo Scientific™ Evolution 60S)으로 적절한 크기의 AuNPs의 단분산 생산을 확인했습니다. 구형(직경 약 40nm) 및 짙은 붉은색 AuNP가 합성되었습니다. 이러한 수정되지 않은 AuNP의 크기는 530 ± 2 nm에서 Beer-Lambert 법칙과 투과 전자 현미경을 사용하여 추정되었습니다(그림 2)(JEOL Ltd. JEM-1011).

AuNPs와 접합된 이차 앱타머 B09는 보고된 프로토콜에 따라 준비되었습니다[18]. 간단히 말해서, 1mL의 준비된 AuNP를 4μL의 2차 앱타머 B09 용액(100μM)과 함께 배양하고, 혼합물을 실온에서 최소 16시간 동안 서랍에 보관했습니다. 혼합물에서 0.1M의 최종 농도에 도달할 때까지 부드럽게 손을 흔들면서 1몰의 NaCl을 이어서 바이알에 적가했습니다. 바이알을 사용하기 전에 최소 1일 동안 서랍에 보관했습니다. 접합되지 않은 티올화 압타머는 12,000g에서 원심분리에 의해 제거되었습니다. 4°C에서 20분 동안 튜브를 원심분리기에서 제거하고 나노입자가 튜브 바닥에 있는 투명한 상청액을 얻었다. 혼합물을 붉은 색 상등액의 경우 추가로 5분 동안 원심분리했습니다. 상층액을 부드럽게 피펫으로 제거하고 나노입자를 최종적으로 5% BSA, 5% 자당, 1% PEG20000 및 0.05% Tween20을 함유하는 0.01M PBS(인산염 완충 식염수) 완충액(pH =7.4) 1mL에 분산시켰다. /P>

측면 흐름 스트립 디자인

LFSA는 그림 3과 같이 설계되었습니다. 간단히 말해서 스트립에는 뒷면 카드 샘플(GF-08, 20 × 300 mm), 금 결합체, 니트로셀룰로오스(NC) 멤브레인(Pall 90, 60 × 300)에 여러 개의 겹치는 패드가 포함되어 있습니다. mm) 및 흡수(H-5076, 20 × 300 mm) 패드. 겹침의 길이는 2mm였습니다. 샘플 패드를 3% BSA 및 0.05% Tween20을 포함하는 0.01M PBS 완충액(pH =7.4)에 담그고 37°C에서 2시간 동안 건조했습니다. 금 접합체 패드는 5% BSA, 5% 자당, 1% PEG20000 및 0.05% Tween20을 포함하는 0.01M PBS 완충액(pH =4)으로 처리되었습니다. 기능성 AuNP는 처리된 금 접합체 패드에 분무기(XYZ3010-1429)로 연속적으로 분무되었습니다. 1마이크로리터의 비오틴-A09 앱타머(10μM)를 4°C에서 1시간 동안 10μL의 스트렙타비딘(1mg/mL)과 함께 배양했습니다. 앱타머가 결합된 스트렙타비딘은 이후에 NC 멤브레인의 디스펜서(XYZ3010-1429)로 라이닝되어 테스트 라인을 형성하는 반면, 스트렙타비딘(1mg/mL)은 기기와 함께 라이닝되어 대조군 라인을 형성했습니다. 그 후, 처리된 NC 멤브레인을 고정화를 위해 37°C에서 2시간 동안 건조했습니다. 마지막으로 스트립을 조립하고 LFSA를 40mm 너비의 스트립으로 자르고 사용할 때까지 37°C에서 밤새 보관했습니다.

AuNP(40nm)의 TEM 이미지

일반적인 측면 흐름 테스트 스트립 구성(샌드위치 형식)

특이성 테스트

80 마이크로리터의 롱갈라이트 용액(10μg/mL)을 조립된 스트립의 샘플 패드에 첨가했습니다. 이 단계는 특이성 테스트를 위해 포르말린 및 탈이온수를 포함한 다른 상대 표적에 대해 반복되었습니다. 탈이온수를 대조군으로 사용하였다. 예상되는 선 영역에 빨간색 선이 나타나야 합니다. 각 컨트롤은 두 번 반복되었습니다.

용량 의존적 테스트

특정 테스트와 유사하게 다양한 농도(0.8, 1, 5, 10μg/mL)의 롱갈라이트 용액을 준비했습니다. 80 마이크로리터의 롱갈라이트 용액을 조립된 스트립의 샘플 패드에 첨가했습니다. 테스트 라인에서 15분 이내의 붉은색 관찰을 검출한계 판단 기준으로 삼았다.

식품 샘플 테스트

이 새로운 LFSA의 실용성과 정확성을 평가하기 위해 연구소 주변의 시장에서 롱갈라이트가 첨가되었을 가능성이 있는 5가지 식품 샘플을 수집했습니다. 1g의 샘플을 10mL의 물로 추출했습니다. 그런 다음 80μL의 각 샘플 추출 용액을 rongalite 검출을 위해 앱타머 기반 측면 흐름 스트립에 적용했습니다. 이러한 결과는 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)로 확인되었습니다.

결과 및 토론

특이성 및 해리 상수(K _d ) 선택된 압타머

서로 다른 농도의 A09 및 B09 앱타머를 고정된 양의 롱갈라이트와 함께 배양했습니다. 해당 입력 앱타머 농도에 대해 450nm에서 측정된 흡광도를 나타내는 포화 곡선이 그림 4a에 나와 있습니다. K에 대해 비선형 회귀 분석을 사용했습니다. _d 가치 계산. 케이 _d A09의 값은 61.12 ± 16.36nM이고 B09는 39.81 ± 12.73nM입니다. 도 4b에서 보는 바와 같이 A09/B09와 rongalite의 결합력이 높다.

<그림>

아 K 측정 _d A09와 B09의 값. GraphPad Prism은 K에 대한 비선형 경화 피팅 분석을 수행하는 데 사용되었습니다. _d 계산. ㄴ A09/B09와 rongalite 사이의 특이적 결합 친화력

특이성 및 민감도

비오틴으로 표지된 압타머 A09(압타머 캡처)는 처음에 멤브레인에 라이닝된 스트렙타비딘에 결합되었습니다. 이 라인은 테스트 라인으로 선택되었습니다. 한편, streptavidin은 control zone에 정렬되었습니다.

그림 5a와 같이 AuNP 2차 압타머(시그널링 프로브)가 rongalite에 결합되면 테스트 영역에 늘어선 1차 앱타머는 이 화합물의 다른 부위에 결합됩니다. AuNPs에 의해 생성된 빨간색 선은 양성 분석의 경우 테스트 영역에 나타나야 합니다. 대조 실험의 경우 대조 영역의 streptavidin은 비오틴으로 변형된 나머지 AuNP 표지 B09 앱타머를 포획하여 항시 대조 신호를 제공합니다.

<그림>

특이성(a ) 및 감도(b ) 롱갈라이트에 대한 LFSA. 아 80μL의 롱갈라이트 용액(10μg/mL)을 조립된 스트립의 샘플 패드에 추가했습니다. 이 단계는 특이성 테스트를 위한 포르말린을 포함한 다른 반대 표적에 대해 반복되었습니다. 탈이온수를 대조군으로 사용하였다. ㄴ 다양한 농도(0, 0.8, 1, 5 및 10μg/mL)의 Rongalite 표준 용액을 준비했습니다. 80μL의 표준용액을 시료 패드에 피펫팅하여 테스트 라인에서 15분 이내의 붉은색 관찰을 검출한계의 기준으로 하였다.

그림 5b와 같이 1μg/mL의 낮은 농도에서도 rongalite를 육안으로 쉽게 검출할 수 있음을 알 수 있다.

이러한 식품 샘플은 본 명세서에서 개발된 LFSA를 통해 분석되었으며, 그 결과는 표 1에 나와 있습니다.

흥미롭게도 각 LFSA 후에 대조선이 유지되지 않았습니다. rongalite 또는 염 이온의 농도가 높으면 제어 영역에 희미한 신호가 발생할 수 있습니다. 따라서, 재현탁 버퍼의 구성은 스트립 테스트의 성능에 결정적인 영향을 미칩니다. 얻어진 결과에 따라 5% BSA, 5% sucrose, 1% PEG20000 및 0.05% Tween20을 포함하는 0.01M PBS 완충액(pH =7.4)을 재현탁 완충액으로 선택했습니다.

다양한 패드의 구성은 스트립 분석의 성능에 극적인 영향을 미칩니다. 다양한 대안 중에서 NC 멤브레인이 핵산의 흡착 및 혼성화에 가장 적합한 고체 지지체로 밝혀졌습니다. NC는 충분한 유속을 제공하기 때문에 측면 흐름 스트립에서 신호 패드로 널리 사용되었습니다[19]. 각각의 유속을 가진 다양한 크기 유형의 NC 멤브레인이 이러한 분석에 적합할 수 있습니다. 이 작업에서는 Jiening Biotech Company에서 구입한 세 가지 일반적으로 사용되는 NC 멤브레인(즉, pall 90, pall 170 및 Millipore 135)을 테스트했습니다. Pall 90은 여기에서 LFSA에 가장 적합한 NC 멤브레인으로 선택되었습니다.

롱갈라이트 검출을 위해 수많은 기술이 개발되었습니다. 그러나 주로 관련 높은 비용과 일상적인 작업자에게 번거로운 GC 및 HPLC와 같은 복잡한 프로토콜 때문에 현장 검출에 널리 적용되는 방법은 거의 없습니다. 1단계 접근 방식인 LFSA는 사용자 친화적인 형식, 저렴한 제작 비용 및 편의성으로 인해 완벽한 플랫폼이 되었습니다. 크로마토그래프 스트립보다 감도가 더 낮음에도 불구하고 LFSA는 현장 진단 테스트 분야에서 유망한 방법이 될 것입니다.

LFSA는 크로마토그래피 스트립보다 감도가 여전히 낮습니다. 또한, 압타머를 이용한 LFSA 기술은 이 분야의 최근 발전에도 불구하고 측면 유동 면역 분석법(LFIA, 항체 기반 방법)에 비해 몇 가지 고유한 장점을 보여줍니다. 항체를 사용하여 유사한 분석을 설계할 수도 있지만 앱타머 센서는 안정성과 저렴한 이점을 제공합니다. 또한, 압타머는 분자 내 및 분자 간 혼성화, 효소 복제 및 쉬운 서열 결정 특성을 갖는 핵산으로 구성되어 있기 때문에 다양한 형식 개발에 보다 유연합니다. 이러한 긍정적인 특성 덕분에 다중 분석을 위해 수많은 앱타머 센서가 개발되었습니다.

또한, LFSA는 최근 개발된 양자점[20] 및 상향 변환 형광체[21]를 비롯한 다양한 레이블을 사용할 수 있습니다. 그러나 보고된 모든 레이블 중에서 AuNP는 LFSA에 가장 널리 사용됩니다. Au 라벨의 가장 놀라운 특성은 육안으로 직접 관찰할 수 있는 NC 멤브레인을 착색하는 능력에 있습니다. 이러한 특성은 LFSA를 현재의 값비싼 실험실 방법과 차별화하여 이 기술을 편리한 분석 도구로 만듭니다.

현장 진단 테스트(POCT)는 이러한 분석 비용을 줄이기 위한 이상적인 도구로 제안되었습니다. 가장 널리 알려진 분석법인 LFSA 바이오센서 플랫폼은 현재 POCT에 사용된다[22]. LFIA 바이오센서 플랫폼은 주로 샌드위치 및 경쟁(또는 억제) 형식을 포함합니다. 일반적으로 샌드위치 형식 분석은 2개 이상의 에피토프를 갖는 표적 분자의 경우에 설계됩니다. 두 개의 서로 다른 결합 부위에서 롱갈라이트에 결합된 이중 앱타머는 샌드위치 유형 형식으로 조립된 캡처링 및 신호 전달 프로브를 포함하는 여기에서 개발되었습니다.

결론

샌드위치 형식의 쉽고 저렴한 LFSA가 rongalite의 현장 빠른 감지를 위해 성공적으로 개발되었습니다. 이 분석에는 AuNP와 결합된 두 개의 앱타머가 포함되었습니다. 일부 주요 매개변수를 최적화한 후 개발된 분석은 1μg/mL만큼 낮은 검출 한계 값으로 높은 감도를 제공했습니다. 이 기술은 rongalite로 식품 샘플의 오염을 연구하는 데 쉽게 사용할 수 있습니다. 이 분석은 신뢰할 수 있는 현장 롱갈라이트 검출 플랫폼을 제공하며 식품 안보 문제를 해결하는 데 기여할 수 있습니다.

약어

AuNP:

금 나노 입자

HPLC:

고성능 액체 크로마토그래피

LFIA:

측면 흐름 면역분석

LFSA:

측면 흐름 스트립 분석

NC 멤브레인:

니트로셀룰로오스 멤브레인

POCT:

현장 진료 테스트

SELEX:

지수 농축에 의한 리간드의 체계적인 진화

TEM:

투과전자현미경

콜로이드 고도로 도핑된 ZnO 나노결정의 광흡수에서 플라스몬 공명 가시광선에서 304 스테인리스강의 광 발생 음극 보호를 위한 Bi2Se3 감응 TiO2 나노튜브 필름