Pd 기능 탄소 나노복합체로 강화된 매트릭스 메탈로프로테이나제-7의 전류측정 바이오센서

결과 및 토론

펩티드 절단 바이오센서의 원리

펩타이드 절단에 기반한 바이오센서의 구성 과정은 Scheme 1에 예시되어 있다. 먼저, Au-rGO를 전기화학적 방법을 통해 유리질 탄소 전극(GCE)에 증착한 다음, Au-S 결합을 통해 펩타이드를 Au-rGO에 고정화시켰다. Pd-CNC는 촉매 인핸서로 구성되었고 글루타르알데히드는 펩타이드와 인핸서 사이의 화학적 링커로 선택되었습니다. 4-CN 및 H₂ O₂ 임피던스를 향상시키기 위해 촉매 침전 기질로 사용되었습니다. 특히, MMP-7은 펩타이드에서 알라닌(A)과 류신(L) 사이의 펩타이드 절단 효소로 선택되어[8] SWV로 측정한 전류 신호 변화가 뚜렷하지 않게 발생했습니다. GCE에 Au-rGO의 전착은 두 가지 장점이 있습니다. (1) Au-rGO는 감지 인터페이스의 전도성을 효과적으로 향상시킬 수 있습니다. (2) 부위가 펩타이드를 고정할 수 있도록 합니다. Pd-CNC의 높은 임피던스 및 촉매 성능을 이용하여 Pd-CNC를 특정 펩티드(NH2-KKKRPLALWRSCCC-SH) 절단으로 대체하여 ΔI를 증폭했습니다. 이 현상은 Pd-CNC의 열악한 전기 전도도와 H₂로 4-CN의 산화로 인해 발생하는 침전의 높은 임피던스에 기여합니다. O₂ Pd-CNC에 의해 촉진됩니다.

MMP-7의 전류 측정 분석을 위한 임피던스 인핸서로서의 Pd 기능화된 탄소 나노구의 개략도

GCE에 대한 촉매 침전 반응은 펩타이드/Au-rGO/GCE 표면에서 Pd-CNC를 배양하여 주사 전자 현미경(SEM)으로 추가 특성화되었습니다(그림 1a). Pd-CNC는 침전 반응 후 불용성 층으로 코팅되어 변형된 전극 위에 불용성 열전도 층이 형성되었음을 나타냅니다(그림 1b). 따라서 MMP-7의 초고감도 검출을 위한 바이오센서는 펩티드 절단 및 촉매 침전 모두에 의해 끌어당기는 감도 증폭으로부터 성공적으로 확립되었습니다.

Pd-CNC/펩티드/Au-rGO/GCE의 SEM 이미지(a ) 촉매 침전 반응 처리(b )

Pd-CNC의 특성

일반적인 열수 방법으로 균일한 Pd-CNC를 성공적으로 제조했습니다. 탄소 나노구, Pd-탄소 나노구 및 Pd-CNC의 형태는 투과 전자 현미경(TEM) 및 에너지 분산 X선 분광법(EDS)으로 특성화되었습니다. 마이크로파 반응(그림 2b) 후에 Pd 나노입자가 탄소 나노구체에 형성되고 분포되어 직경이 150nm인 Pd-탄소 나노구체의 성공적인 제조를 보여줍니다(그림 2a). Pd-CNC의 형태는 그림 2c에 나와 있습니다. EDS 결과는 탄소 나노 입자, Pd-탄소 나노구 및 Pd-CNC의 화학 조성을 확인하여 탄소 나노 입자에 C와 O가 포함되어 있음을 보여줍니다(그림 2d). Pd 나노 입자의 기능화 후, Pd는 Pd-탄소 나노구의 스펙트럼에도 존재했으며(그림 2e), Pd-CNC의 스펙트럼에서 발견되는 S와 N은 Pd-탄소 나노구를 차단하는 데 사용된 BSA에서 유래했습니다( 그림 2f). 이러한 결과는 Pd-CNC 촉매 증강제의 성공적인 합성을 직관적으로 보여줍니다. Pd-탄소 나노구(그림 3a)의 HR-TEM 이미지는 기능화된 Pd 나노입자(그림 3b)가 관찰 가능한 (1,1,1) 격자 평면(그림 3b)을 갖는 면심 입방체(FCC) 상임을 보여줍니다. 3c). 해당 FFT(고속 푸리에 변환) 이미지(그림 3d)도 Pd 나노입자의 FCC 결정질 특성을 뒷받침합니다.

탄소 나노구의 TEM 현미경 사진(a ), Pd-탄소 나노구(b ) 및 Pd-CNC(c ) 탄소 나노구의 EDS(d ), Pd-탄소 나노구(e ) 및 Pd-CNC(f )

Pd-탄소 나노구의 HR-TEM 이미지(a ), Pd 나노입자 확대 이미지(b, c ) 및 Pd 나노입자의 FFT 이미지(d )

바이오센서 구축 절차의 특성화

바이오 센서의 구성 절차는 SWV 측정(그림 4a)과 전기화학적 임피던스 분광법(EIS)(그림 4b)으로 모니터링되었습니다. 베어 GCE(커브 베어 GCE)의 전류 신호와 비교하여 Au-rGO의 전착 후 전위 범위의 피크 전류가 약 420μA(커브 Au-rGO/GCE)로 증가했으며, 이는 우수한 전도도에 기인할 수 있습니다. 오-rGO. 그런 다음, 신호 전류 피크는 전극(곡선 펩타이드)에 펩타이드를 고정화한 후 감소하고 펩타이드와 인핸서(곡선 Pd-CNC)의 높은 임피던스로 인해 펩타이드와 Pd-CNC 사이의 연결 후에 더 감소했습니다. MMP-7과 함께 인큐베이션한 후 피크 전류가 증가했으며(곡선 MMP-7 절단), 이는 MMP-7에 의한 펩티드의 특정 절단 및 전극 표면에서 인핸서의 부분적 제거로 인해 발생할 수 있습니다. 동일한 조건에서 현재 변화(ΔI₁ ) 곡선 "Pd-CNCs"와 "MMP-7 절단" 사이는 48.7μA로 계산되었습니다. 그런 다음 4-CN의 촉매 침전 반응 후 피크 전류가 감소하여 전류 피크가 136.1μA(곡선 MMP-7 절단 침전)로 나타났습니다. 대조적으로, MMP-7이 없는 바이오센서는 촉매 침전 반응 후에 블랭크 신호로 언급된 더 낮은 전류 피크(54.9μA, 곡선 침전)를 유도했습니다. 상황에서 ΔI₂ 곡선 "강수"와 곡선 "MMP-7 절단 강수" 사이의 현재 신호 차이였으며, 48.7에서 81.2μA로 증가했습니다. EIS는 또한 바이오센서의 제조를 모니터링하는 데 사용되었습니다. 전자 전달 저항은 Nyquist 플롯의 반원 직경에 해당합니다(그림 4b). 비교를 위해 펩타이드/Au-rGO/GCE(곡선 펩타이드)의 플롯은 Au-rGO/GCE(곡선 Au-rGO/GCE) 및 베어 GCE(곡선 베어)보다 더 큰 반원을 표시하므로 저항이 더 큽니다. GC) 가장 작은 원이 있는 펩타이드는 GCE에서 성공적으로 수정되었음을 나타냅니다. 글루타르알데히드(곡선 Pd-CNC)를 통해 펩타이드가 인핸서와 연결되면 내성이 증가했습니다. MMP-7과 함께 인큐베이션한 후 반원의 직경이 약간 감소했으며(곡선 MMP-7 절단), 이는 MMP-7이 펩티드를 특이적으로 절단했기 때문일 수 있습니다. 대조적으로, 바이오센서를 4-CN 및 H₂ 용액에 담그면 저항이 크게 증가했습니다. O₂ (곡선 강수량)_. 펩타이드 절단과 촉매 침전 반응을 모두 거치면서 저항은 분명히 감소했습니다(곡선 MMP-7 절단 침전).

SWV(a ) 및 EIS(b ) 5mM [Fe(CN)₆에서 전극 수정 과정의 반응 ] ^3−/4- 인산염 완충(0.1 M, pH =7.4)

탐지 조건 최적화

바이오센서의 검출 성능에 중요한 요소인 펩타이드의 양과 배양 시간을 더욱 최적화하였다. 펩타이드 농도가 20~40μM로 증가하고 50~80μM 사이에서 일정하게 유지되면 전류 신호가 그에 따라 감소하는 것으로 나타났습니다(그림 5a). 비특이적 흡착을 피하기 위해 후속 측정을 위해 50μM을 선택한 다음 50μM 펩타이드의 배양 시간을 최적화했습니다(그림 5b). SWV 전류는 20분에서 40분으로 점진적으로 감소한 다음 40분 후에 일정하게 유지되었습니다. 따라서 40분을 펩타이드의 인큐베이션 시간으로 선택했습니다. 절단 반응 시간도 바이오센서의 분석 성능에 중요한 요소입니다(그림 5c). 절단 시간이 30분에서 50분 사이일 때 바이오센서의 신호가 증가하고 50분 후에도 일정하게 유지되어 펩타이드가 완전히 절단되었음을 시사합니다. 따라서 다음 실험의 분열 시간으로 50분을 선택했습니다. 바이오센서의 민감도에도 영향을 미치는 침전 반응(Fig. 5d)은 50분 이내에 증가하는 것으로 나타났고, 전기화학적 신호는 지속적으로 감소하는 것으로 나타났다. 전류 신호는 반응 시간이 추가로 증가해도 일정하게 유지되므로 다음 분석의 침전 반응 시간으로 50분을 선택했습니다.

펩타이드 농도의 효과(a ), 50μM 펩타이드의 배양 시간(b ), 펩티드 절단 시간(c ) 및 침전 반응 시간(d ) 바이오센서의 현재 반응

제안된 바이오센서의 성능

최적의 조건에서 다양한 농도의 MMP-7과 함께 배양한 후 제안된 바이오센서의 성능이 결정되었습니다. 도 6에 나타난 바와 같이 MMP-7의 농도가 감소함에 따라 SWV 신호가 감소하였다. 교정 플롯은 0.1pg mL ⁻¹ 범위에서 현재 피크와 분석 물질 농도의 로그 사이에 좋은 선형 관계를 보여줍니다. ~ 100ng mL ⁻¹ . 선형 방정식은 (I =− 16.53lgCMMP-7-137.26) 상관 계수 0.9967. 바이오센서의 검출 한계는 17.38fg mL ⁻¹ 였습니다. 신호 대 잡음비가 3인 MMP-7의 경우(S/N =3; 빈 솔루션에서 신호의 표준 편차입니다. MMP-7의 펩타이드 절단 검출에 대한 최근 보고와 비교하여 바이오센서는 더 나은 분석 성능을 보였다(표 1).

아 5mM에서 MMP-7에 대한 전기화학적 검출의 SWV 반응 [Fe(CN)₆ ] ^3−/4− 100 fg mL ⁻¹ 농도에서 인산염 완충(0.1 M, pH =4) ~ 100ng mL ⁻¹ . ㄴ 전류의 선형 교정 곡선과 MMP-7 농도의 로그. 오차 막대는 n에 대한 표준 편차입니다. =3

면역 센서의 성능 평가

바이오센서의 재현성을 평가하기 위해 3개의 수정된 전극을 0.01, 0.1, 1, 10 및 100ng mL ⁻¹ 로 배양했습니다. MMP-7. 해당 표준편차는 각각 1.3%, 1.4%, 4.0%, 1.0%, 3.0%로 계산되어 바이오센서의 재현성이 양호함을 나타낸다. MMP-2, NSE, PSA, TBS 및 BSA는 이 바이오센서의 특이성을 분석하기 위한 주의산만으로 사용되었습니다. 바이오센서를 1ng mL ⁻¹ 의 개별 혼합물과 함께 배양했을 때 명백한 반응이 관찰되지 않았습니다. (100ng mL ⁻¹ 포함) MMP-7 각각) MMP-2, NSE, PSA, TBS 및 BSA. 1ngmL ⁻¹ 만으로 배양된 바이오센서와 비교 MMP-7, 각 혼합물의 전류 신호는 거의 동일했으며(그림 7a), 이는 바이오센서가 MMP-7에 대해 우수한 특이성을 나타냄을 보여줍니다. 안정성을 조사하기 위해 구축된 바이오센서를 4°C에서 28일 동안 보관하고 7일마다 MMP-7 검출 성능을 평가했다(그림 7b). 병렬 실험 간의 상대 표준 편차(RSD)는 모두 10% 미만으로 바이오 센서의 놀라운 안정성을 의미합니다.

SWV 현재 응답(a ) 바이오센서의 간섭 방지 능력에 대한 정보(오차 막대는 n에 대한 표준 편차입니다. =3). 산만함의 농도:MMP-2(100ng mL ⁻¹ ), NSE(100ng mL ⁻¹ ) ), PSA(100ng mL ⁻¹ ) ), THR(100ng mL ⁻¹ ) ) 및 BSA(100ng mL ⁻¹ ) ), 각각. 혼합물에는 주의를 산만하게 하는 모든 요소가 포함됩니다(100ng mL ⁻¹ ) 및 MMP-7(1ng mL ⁻¹ ). SWV 응답(b ) 1ng mL ⁻¹ 검출을 위해 서로 다른 시간 동안 4°C에 보관된 제안된 바이오센서 MMP-7

제안된 방법의 실용성을 알아보기 위해 회수 실험을 수행하였다. 회수율은 86.3%에서 117.2% 사이였으며(표 2), 임상 분석에서 바이오센서의 유망한 실행 가능성을 추가로 나타냅니다.