탄소 점(CDs)은 활성 표면 덕분에 항균제로 널리 사용되어 왔으나, 일부 CDs는 불안정성이라는 단점을 가지고 있습니다. 따라서 항균 활성 등의 관련 응용이 장기 사용에 신뢰성을 담보하기 어려웠습니다. 본 연구에서는 수열 합성 공정을 통해 청색 형광을 나타내는 CDs를 합성한 후, 폴리에틸렌이민(PEI)을 이용해 CDs를 CDs 기반 프레임워크(CDFs)로 조립했습니다. CDFs는 형광이 소광되었으나, 주사전자현미경(SEM)과 제타 전위 분석을 통해 더 안정적인 특성을 보임이 확인되었습니다. CDs와 CDFs 모두 그람음성균인 Escherichia coli(E. coli)와 그람양성균인 Staphylococcus aureus(S. aureus)에 항균 활성을 나타냈으나, CDFs가 더 우수한 항균 성능을 보였으며, S. aureus는 최소 억제 농도(MIC) 30 μg/mL에서 완전히 억제되었습니다. 이는 CDFs가 안정성과 항균 활성을 동시에 향상시켜 실용적 응용에 더 유망함을 시사합니다.
서론
세균 감염은 인류 생명에 심각한 위협이 되고 있으며, 세균을 살균할 효과적인 약물 개발이 시급한 실정입니다[1]. 다양한 항생제가 세균 감염 치료에 사용되어 왔으나, 항생제 남용은 부작용과 내성균 출현 등의 문제를 야기합니다[2]. 항균 고분자[3], 금속 나노물질[4], 탄소 나노물질[5, 6] 등 나노물질이 기존 항생제의 대안으로 연구되어 왔으며[7], 내성과 독성 문제가 완화되고 있습니다[8]. 최근에는 초소형 크기 덕분에 생체 적합성[12], 활성[13], 순환계를 통한 용이한 제거[14, 15] 등의 장점을 가진 CDs[9, 10]와 나노클러스터(NCs)[11]가 세균 감염 퇴치에 적극 활용되고 있습니다. 특히 CDs가 기존 항감염 약물보다 우수한 자유 라디칼 소거 능력을 가짐이 보고되었습니다[16-18]. 그러나 일부 초소형 항균제는 넓은 산화 표면적 때문에 안정성이 떨어지는 문제가 있습니다[19]. 따라서 장기 사용이 가능한 더 효과적인 항균제 개발이 절실합니다.
실용적 응용을 위해 항균제는 다음 특성을 가져야 합니다: (a) 일정 기간 주변 환경에서 안정성 유지; (b) 우수한 생체 적합성과 낮은 독성; (c) 높은 항균 활성. 일반적으로 크기가 큰 나노물질이 더 안정적이지만, 활성 표면적이 상대적으로 작아 항균 활성이 약할 수 있습니다. 소형 및 대형 나노물질의 약점을 모두 고려해, 본 연구에서는 폴리에틸렌이민(PEI) 첨가만으로 소형 CDs를 대형 CDFs로 조립하는 방법을 보고합니다(그림 1). CDs는 융합되지 않고 빌딩 블록으로서 형태를 유지하므로, 전체 CDFs는 더 큰 크기를 가지면서도 CDs의 활성 특성을 잃지 않고 우수한 안정성을 나타냅니다. 또한 CDFs가 CDs보다 그람음성 E. coli와 그람양성 S. aureus 모두에 대해 향상된 항균 활성을 보임을 확인했으며, 많은 CDs가 그람양성균만 살균하는 것과 대조적으로 광범위 항균 성능을 입증했습니다[20]. 더불어 CDFs가 PC12 세포(쥐 부신 크로마핀종 유래 세포주)의 증식을 촉진해 신경 재생 응용 가능성을 시사했습니다[21]. 본 연구는 소형 CDs를 대형 CDFs로 조립함으로써 안정성 향상뿐만 아니라 항균 활성도 증대시킬 수 있음을 보여줍니다.
L-시스테인 1.0 g을 탈염수 10.0 mL에 녹여 잘 섞은 후, 1.0 M NaOH로 pH 9.0으로 조절했습니다. 용액을 수열 반응기에 넣고 160°C에서 24시간 가열했습니다. 실온으로 식힌 후, 투석 백(MW 7000 cut off)을 사용해 하루 동안 투석하여 CDs를 얻었습니다. CDFs 제조를 위해 CDs 1 mL에 1% PEI 40 μL를 첨가하고 1시간 방치한 후, CDs와 동일한 방법으로 투석 정제했습니다. HR-TEM 분석을 위해 시료를 농축해 실리카겔 컬럼에 올리고 메탄올과 디클로로메탄으로 용출해 추가 정제했습니다.
독성 평가
PC12 세포를 96웰 플레이트에 12시간 배양한 후, 다양한 농도의 CDs와 CDFs로 처리했습니다. CCK-8 분석법으로 생존 세포 수를 측정했습니다. MTT(5 mg/mL, PBS) 1/10 배양액 부피를 첨가 후 배양하고, 상등액 제거 후 DMSO 200 μL를 넣어 10분간 진탕해 결정을 녹였습니다. 490 nm에서 흡광도를 측정했습니다(Microreader, Varioskan LUX). 모든 흡광도 측정에 블랭크 대조군을 포함했습니다.
항균 실험
E. coli와 S. aureus를 37°C, 250 rpm 진탕 조건에서 CDs와 CDFs 존재 유무 하에 배양했습니다. 라이소지니 브로스(LB) 배지에서 세균 증식을 600 nm(OD600)에서 측정했습니다. LB 배지를 블랭크 대조군으로 사용했습니다. OD600은 세포 밀도를 나타내며, 상대 세포 생존율은 CDs 또는 CDFs 존재 하 배양군과 무처리 대조군의 OD600 비교로 계산했습니다. 생존/사멸 세균은 FDA/PI 염색법으로 평가했습니다[22].
활성산소종(ROS) 검출
세균 세포를 CDs와 CDFs로 12시간 처리 전후로 세포 내 ROS 생성을 2′,7′-디클로로플루오레신 디아세테이트(DCFH-DA) 프로브로 측정했습니다. 여기 파장 488 nm, 방출 파장 525 nm에서 형광을 검출했습니다.
결과 및 고찰
물질 특성 분석
크기 분석
그림 2는 공기 중 수 시간 노출 후 CDFs 분말의 SEM 이미지입니다(저배율 Fig. 2a0, 고배율 Fig. 2b0). CDFs는 잘 분산되어 평균 크기 약 25 nm를 보였습니다. TEM과 AFM 연구(추가 파일 1: Figure S1)상 CDs는 단분산된 작은 크기를 가져야 하나, 공기 중 노출 시 SEM 관측에서 응집 현상이 나타났습니다(추가 파일 1: Figure S2). 반면 CDFs는 주변 환경 노출에도 형태를 유지했습니다. 이는 CDFs가 실용 응용에 더 적합함을 의미합니다. TEM(Fig. 2b1)상 CDFs는 작은 CDs가 빌딩 블록으로 조립된 구조를 보였습니다. HR-TEM(Fig. 2b2) 분석 결과 빌딩 블록의 격자 무늬는 0.21 nm 간격으로, 흑연의 (100) 면과 일치해 전형적인 CDs의 특성을 유지함을 확인했습니다[23-25]. 따라서 조립된 CDFs는 CDs의 특성을 잃지 않으면서 전체 큰 프레임워크와 내부 소형 빌딩 블록의 장점을 결합할 수 있습니다.
CDFs의 저배율(a0) 및 고배율(b0) SEM; CDFs의 TEM(b1) 및 HR-TEM(b2)
제타 전위
제타 전위 분석으로 CDs와 CDFs의 분산계 내 정전기적 반발력을 측정했습니다(Fig. 3). 주변 환경 노출된 CDs의 제타 전위 피크가 뚜렷하지 않고, 큰 편차를 가진 다중 피크가 나타났습니다(Table 1). 이는 CDs가 매우 불안정하고 재현성이 낮음을 시사합니다. 반면 CDFs의 제타 전위 피크는 상대적으로 안정적인 범위에 집중되었으며, 3회 측정 시 편차가 훨씬 작아 CDFs가 더 안정적이고 분산계의 순도가 높음을 보여줍니다.
CDs(a)와 CDFs(b)의 제타 전위
형광 특성
PEI 적정에 따른 CDs의 형광 방출 스펙트럼으로 조립 과정을 모니터링했습니다(Fig. 4). PEI 적정에 따라 350 nm에서 형광 방출이 점차 소광되었으나(Fig. 4a), 유의미한 스펙트럼 이동은 없어 응집은 일어나지 않았음을 보여줍니다. CDFs의 조립 구조는 전체 크기를 변화시켜 형광에 영향을 주며, 인접한 CDs가 서로의 형광을 소광시킵니다. 또한 표면 화학이 형광 특성에 중요한 역할을 합니다. CDs 표면의 질소와 황 원자가 에너지 트랩을 형성하며, 카르보닐기와 아미노기가 많은 결함 표면에서 밝은 형광이 나타납니다. PEI 작용기화 후 CDFs 표면은 아미노기가 우세해지며, 크기 증가와 함께 형광이 소광됩니다. TCSPC로 CDs와 CDFs의 형광 거동을 비교해 광생성 전하 재결합 경로를 이해했습니다(Fig. 4b). 430 nm에서 방출을 모니터링했으며, 이중 지수 함수로 피팅했습니다(Table S1). CDs의 주요 성분 수명은 2.45 ns, 다른 성분은 7.47 ns였습니다. CDFs는 주요 성분 1.98 ns, 다른 성분 7.30 ns로 유의미한 수명 변화는 없었으며, 이는 조립 과정에서 CDs의 특성이 실질적으로 변하지 않음을 의미합니다[26].
PEI 적정에 따른 CDs의 형광 방출 스펙트럼(a) 및 CDs와 CDFs의 수명(b)
독성
물질의 안전성 평가를 위해 PC12 세포에 대한 CDs와 CDFs의 독성을 조사했습니다. MTT 분석으로 세포 생존율에 미치는 영향을 확인했습니다(Fig. 5). 24시간 배양 후 CDs와 CDFs 처리군에서 세포 생존율은 대조군과 큰 차이가 없었습니다. 흥미롭게도 두 탄소 물질 모두 PC12 세포 증식을 촉진했으며, 이는 신경 손상 치료에 중요한 역할을 합니다. 이 결과는 물질의 낮은 독성과 PC12 세포를 이용한 신경 보호 응용 가능성을 시사합니다[27].
CDs(a)와 CDFs(b) 존재 하 PC12 세포 생존율. 세포 생존율(%) = (실험군 흡광도 - 블랭크군 흡광도) / (대조군 흡광도 - 블랭크군 흡광도) × 100%
항균 특성 조사
CDs와 CDFs의 항균 활성을 600 nm에서 세균 밀도 측정으로 초기 평가했습니다[28]. Fig. 6은 두 물질 모두 S. aureus와 E. coli에 상당한 항균 효과가 있음을 보여줍니다. 특히 CDFs 30 µg/mL 이상에서 S. aureus 생존율이 거의 0에 가까웠습니다. E. coli도 두 물질로 살균되었습니다. CDs는 다중 전하를 띠는 반면(Fig. 3a), CDFs는 미미한 전하를 가져(Fig. 3b) 약한 반발력으로 세균 부착을 억제하고 세균 표면과 더 쉽게 상호작용할 수 있습니다. 비교 결과, 6 µg/mL 이상에서 CDFs가 더 높은 비율의 세균을 사멸시켜 향상된 항균 활성을 보였습니다. CDFs의 항균 활성 증가는 CDs 빌딩 블록의 시너지 효과와 더 안정적인 표면 전하에 기인할 수 있습니다. 항균 메커니즘을 심층 이해하기 위해 비형광 DCFH를 형광 DCF로 산화시키는 ROS를 측정했습니다(Fig. 6c). 두 탄소 물질 모두 E. coli 처리 후 ROS 생성을 유의미하게 유도하지 않았으나, CDFs는 S. aureus와 상호작용 시 세포 내 ROS를 현저히 증가시켰습니다. ROS는 세균 DNA, RNA, 단백질을 손상시켜 살균을 촉진합니다. 또한 H₂O₂로 ROS 생성을 자극한 결과, 두 탄소 물질 모두 H₂O₂ 단독 처리 대비 ROS 생성이 크게 촉진되었으며, CDFs가 가장 높은 증가를 보였습니다. 이는 H₂O₂와 탄소 물질 병용 시 항균 활성이 더 향상될 수 있음을 시사하며, 특히 CDFs에서 두드러집니다.
CDs와 CDFs의 S. aureus(a) 및 E. coli(b) 항균 활성, (c) 525 nm에서 DCF 형광 강도(ROS 레벨과 선형 관계)로 CDs와 CDFs 처리 시 및 H₂O₂(100 μM) 병용 시 ROS 레벨
이전 연구에서 S. aureus 살균에 사용된 일부 CDs를 Table 2에 비교했습니다. 본 연구의 CDFs는 경쟁력 있는 MIC를 보였습니다. 또한 단순히 조사 세포 생존율을 낮추는 데 그치지 않고 PC12 세포 증식을 촉진해 세균 감염 치료 시 다기능성을 입증했습니다.
FDA/PI 생존/사멸 염색 실험으로 CDs와 CDFs 처리 후 세균 막 무결성을 조사했습니다(Fig. 7). 녹색 FDA 염색은 생존 세포만, 적색 PI 염색은 막이 손상된 사멸 세균만 염색하며, 막이 온전한 생존 세균은 염색되지 않습니다[30, 31]. 형광 이미지에서 CDs 처리군에서 뚜렷한 적색 형광이, CDFs 처리군에서 훨씬 높은 밀도의 사멸 세포가 관찰되었습니다.
30 µg/mL CDs와 CDFs 존재/부재 하 S. aureus와 E. coli의 FDA/PI 염색. 척도 막대, 200 µm
위 비교 결과, CDFs가 그람양성 및 그람음성 세균 모두 살균에 유망함을 결론지었습니다. 따라서 30 µg/mL CDFs 처리 전후 E. coli와 S. aureus를 SEM으로 관찰했습니다(Fig. 8). Fig. 8a, c에서 처리 전 세균은 규칙적 표면을 보였으나, CDFs 배양 후 S. aureus(Fig. 8b)와 E. coli(Fig. 8d) 형태가 급격히 변하고 많은 세균 막이 파열되었습니다. 세균 표면에서 소량 물질이 관찰되어 부착된 CDFs에서 유래함을 알 수 있습니다. 이는 CDFs가 세균 막 손상을 통해 살균함을 나타냅니다[32].
S. aureus(a, b) 및 E. coli의 30 µg/mL CDFs 처리 전(a, c) 및 후(b, d) SEM. 척도 막대: 2 µm
CDs와 CDFs 모두 형광성을 띠므로, 6 µg/mL 농도에서 살균 과정 중 세균 이미징을 조사했습니다. S. aureus 이미징 결과를 Fig. 9에 나타냈습니다. 흥미롭게도 CDs와 CDFs 모두 S. aureus 이미징에 사용 가능했으나, CDFs가 더 높은 섭취 효율을 보였습니다(명시야와 암시야 이미지가 거의 중첩). 반면 CDs는 S. aureus 일부만 염색했습니다. 또한 CDFs 처리군에서 세균 밀도가 더 낮아 동일 용량에서 CDFs가 CDs보다 S. aureus를 더 효율적으로 살균함을 보여줍니다. 이 결과는 CDFs가 다양한 세균 세포 이미징용 대체 염료로 활용 가능함도 시사합니다.
12시간 후 CDs와 CDFs 섭취에 의한 S. aureus 이미징
결론
CDs를 CDFs로 조립함으로써 더 강력한 항균 활성이 나타납니다. 조립 구조가 더 안정적인 특성을 부여하면서도 CDs의 항균 활성을 증대시킴을 확인했습니다. 본 연구는 소형 나노물질을 프레임워크로 조립해 실용적 응용 가능성을 높이는 새로운 접근법을 제시합니다.
