암 세포막으로 장식된 실리카 나노입자로 miR495와 독소루비신이 탑재되어 효과적인 폐암 치료를 위한 약물 내성 극복
초록
현재의 암 치료법은 일반적으로 많은 세포외 및 세포내 장벽에 굴복하고 있으며, 그 중 비표적 분포 및 다제내성(MDR)은 많은 약물 전달 시스템(DDS)의 좋지 않은 결과를 초래하는 두 가지 중요한 어려움입니다. 여기, 우리 연구에서 딜레마는 폐암의 효과적인 치료를 위해 miR495와 독소루비신(DOX)을 공동 전달하기 위해 암세포막(CCM)으로 코팅된 실리카(SLI) 나노입자를 개발함으로써 해결되었습니다(CCM/SLI/R-D). MDR 폐암 세포(A549/DOX)의 상동 CCM은 세포외 장벽을 우회하기 위해 DDS의 종양 귀소 특성을 증가시키는 것으로 가정되었습니다. 더욱이, 암세포의 MDR은 miR495를 사용하여 P-당단백질(P-gp) 발현의 하향 조절을 통해 정복되었다. miR495는 A549/DOX에서 세포내 약물 축적을 증가시키는 P-gp의 발현을 유의하게 감소시킬 수 있음이 입증되었습니다. 시험관 내 및 생체 내 결과는 CCM/SLI/R-D가 miR495 또는 DOX 단독 적용보다 우수한 A549/DOX에 대해 크게 향상된 치료 효과를 나타냄을 보여주었습니다. 폐암의 MDR 정복에 대한 CCM/SLI/R-D의 바람직한 효과는 MDR 암의 효과적인 화학요법에 대한 새로운 대안을 제공합니다.
소개
최근 연구들은 다제내성(MDR)과 화학요법 실패 사이의 양의 상관관계에 대한 축적된 증거를 제공하고 있다[1, 2]. MDR에 대해 가장 널리 알려진 메커니즘 중 하나는 ATP-결합 카세트(ABC) 수송체이며, 그 중 P-당단백질(P-gp)이 가장 많이 연구된 메커니즘입니다[1, 3]. P-gp는 세포내 화학요법제를 세포 밖으로 효과적으로 펌핑하여 세포내 약물 축적을 감소시키고 결과적으로 감소된 효능을 가져온다는 것이 밝혀졌습니다[4, 5]. P-gp의 억제는 MDR을 극복하는 데 유익한 효과를 나타냈으며, 이는 MDR을 퇴치하는 잠재적인 표적이 될 수 있습니다.
MicroRNA(miRNA)는 자연 발생 유형의 비암호화 RNA입니다. 그러나 miRNA는 세포의 형질감염과 단백질 발현 조절에 중요한 역할을 한다[6]. 그 결과 P-gp의 발현은 종양의 종류에 따라 다양한 miRNA에 의해 영향을 받는 것으로 보고되었다[7]. 이전 연구에서는 miR495가 MDR 난소암과 위암 세포 모두에서 P-gp 발현을 효과적으로 하향조절할 수 있음을 밝혔습니다[8]. 여기, 이 연구에서 miR495를 사용하여 MDR 폐암 세포에서 P-gp의 조절에 대한 역할을 추가로 조사했습니다.
생체 이용률 증가와 함께 부작용이 크게 감소하는 등 비교할 수 없는 이점으로 인해 약물 전달 시스템(DDS)은 지난 수십 년 동안 성장했으며 약물 전달, 특히 암 치료에서 자유 약물의 대안으로 인식되고 있습니다[9,10 ,11,12]. 그 결과 암 치료의 복잡한 세포외 및 세포내 장벽을 극복함과 동시에 다양한 종류의 약물 로딩에 적합한 다기능 DDS의 개발이 연구의 초점이 되고 있다[13,14,15,16]. 실리카(SLI) 나노입자는 가장 널리 채택되고 있는 후보물질 중 하나로, 준비가 쉽고, 약물 담지 능력이 높으며, 생체적합성이 좋은 장점이 있어 선호되는 나노운반체이다. 당연히 SLI는 만족스러운 효능을 달성하기 위한 나노캐리어로 많은 DDS에서 사용되었습니다[17, 18].
그러나 전임상 연구에 따르면 DDS의 표적 전달도 성공적인 암 치료에 중요합니다. 더 나은 표적화 효과를 달성하기 위해 가장 일반적으로 채택되는 접근 방식은 DDS 표면의 표적 리간드를 수정하는 것인데, 이는 암세포 표면의 해당 수용체에 결합할 수 있습니다[16, 19, 20]. 작은 분자(분자량 1000 Da 이하)에서 단클론항체(분자량 10 kDa 이상)에 이르기까지 이러한 표적 리간드는 DDS에 성공적으로 적용된 것으로 보고되었습니다[21,22,23]. 그러나 일부 리간드의 ectogenic 특성 또는 기타 이유로 인해 면역 반응 및 세포 독성과 같은 부작용이 발생했습니다. 최근 몇 년 동안 세포 원형질막은 나노 입자의 표면을 변형시킬 뿐만 아니라 생체 적합성 표적 요소 역할을 하는 또 다른 유망한 물질이 되고 있습니다. 상동 암 세포막(CCM)과 암세포 사이의 상호 작용을 기반으로 CCM은 DDS의 종양 귀소 기능을 크게 증가시키는 것으로 나타났습니다[24, 25].
폐암의 칵테일 요법(우리 연구에서 모델 암으로 선택됨)을 위한 하나의 DDS에서 miR495를 표적으로 하는 CCM 및 P-gp의 종양 귀소 특성을 결합하기 위해 양전하를 띤 아민 SLI가 먼저 제작되고 독소루비신(DOX)이 사전 로드되었습니다. ). DOX가 로드된 아민 SLI는 이후에 miR495로 로드되어 공동 전달 코어(SLI/R-D)를 형성했습니다. 마지막으로 SLI/R-D를 음전하를 띤 CCM(A549/DOX 세포에서 획득)으로 장식하여 공동 전달 및 종양 표적 DDS(CCM/SLI/R-D)를 준비했습니다. CCM은 CCM/SLI/R-D를 균질한 A549/DOX 세포로 특이적으로 안내하여 종양 표적화 효과를 강화하고 세포 내 흡수를 증가시킬 수 있을 것으로 예상되었습니다. 한편, 출시된 miR495는 A549/DOX의 MDR을 극복하고 DOX와 시너지 항암 효과를 얻을 수 있다.
자료 및 방법
자료
메틸 티아졸릴 테트라졸륨(MTT), N -(2-아미노에틸)-3-아미노프로필트리메톡시실란(AEAPS), 테트라에틸 오르토실리케이트(TEOS), 독소루비신(DOX) 및 Triton X-100은 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)에서 구입했습니다. miR495는 Cell Biolabs Inc.(San Diego, CA, USA)에서 제공했습니다. 기타 화학 물질 및 시약은 Aladdin Co., Ltd(중국 상하이) 및 분석용 순수에서 입수했습니다.
세포 배양 및 동물 모델
A549(인간 폐 암종), A549/DOX(DOX 내성 세포주) 및 NIH3T3(마우스 배아 섬유아세포) 세포주는 10%(v/v) 소태아혈청(FBS), 페니실린(100)이 보충된 DMEM에서 배양되었습니다. U/mL) 및 스트렙토마이신(100 U/mL)을 5% CO2를 포함하는 37 °C 항온 인큐베이터에서 . A549/DOX(DOX-저항성 세포주)는 보고된 바와 같이 점진적으로 증가된 DOX 농도와 함께 A549 세포를 배양함으로써 확립되었습니다[26]. 모든 세포주는 이전에 보고된 대로 표준 프로토콜에서 배양되었습니다[27]. 수컷 Balb/c 누드 마우스(~ 20 g)는 우한 대학교 모델 동물 연구소(중국 우한)에서 얻었고 표준 프로토콜에 따라 키웠습니다. A549/DOX 종양 이종이식 모델은 이전 기사를 기반으로 수립되었습니다[28]. 모든 동물 관련 실험은 순예선대학교 제3부속병원 윤리위원회의 승인을 받았습니다.
다세포 종양 회전 타원체 모델
다세포 종양 회전 타원체(MCTS)는 이전 보고서를 기반으로 확립되었습니다[29]. 간단히 말해서, 96웰 플레이트(Corning, USA)를 오토클레이브된 아가로스 용액으로 덮어 겔 패드를 생성했습니다. 그 후, 혼합된 A549/DOX 및 NIH3T3 세포(1:1)를 플레이트에 접종하고 인큐베이션하여 MCTS를 형성하였다. MCTS의 형성은 광학현미경(CX 23, Olympus, Japan)으로 관찰하였다.
CCM/SLI/R-D 준비
아민 SLI의 제조는 이전 보고서[30]에 기초한 유중수 마이크로에멀젼에서 수행되었습니다. 간단히 말해서, DOX가 포함된 유중수 마이크로에멀젼은 실온에서 제조되었습니다. 이후 AEAPS, TEOS 및 NH4 OH를 연속적으로 첨가하여 반응을 촉발시켰다. 24시간 동안 반응시킨 후, 과량의 에탄올을 사용하여 DOX가 로딩된 아민 SLI를 침전시키고 원심분리(3000rpm, 10분)를 사용하여 수집했습니다.
miR495를 HEPES 완충액에 용해시키고 소용돌이와 함께 다양한 중량/중량(w/w) 비율로 DOX-로딩된 아민 SLI의 수용액에 적가하여 SLI/R-D 이원 착물을 얻었다[31].
A549/DOX 세포에서 CCM의 분리는 이전 보고서를 기반으로 수행되었습니다[32]. 요약하면, A549/DOX 세포를 수집하고 원심분리를 사용하여 농축했습니다. 그 후, 세포를 추출 완충액에 분산시키고 추가로 원심분리(10,000g , 10 min), 두 번째 초원심분리(100,000g , 60 min) 최종적으로 CCM을 얻습니다. 모든 절차는 4 °C에서 수행되었습니다. BCA 키트(Beyotime, Shanghai, China)를 사용하여 CCM의 단백질 농도를 정량화했습니다.
SLI/R-D에 CCM을 코팅하는 것은 miR495 결합과 유사한 프로토콜을 사용했습니다. 요약하면, 서로 다른 부피의 CCM 용액을 소용돌이 하에 SLI/R-D(1 mg/mL)에 첨가했습니다. 마지막으로, 혼합물을 프로브형 초음파 처리(100 W, 5 분)로 처리한 다음 원심분리(10,000g , 10 분) CCM/SLI/R-D를 구합니다.
특성화
CCM/SLI/R-D의 크기 분포 및 제타 전위는 Zetasizer(ZS90, Malvern, UK)로 평가되었습니다. 또한 투과전자현미경(TEM, JEM1230, JEOL, Japan)을 적용하여 나노운반체의 형태를 관찰하였다.
miR495에 대한 SLI의 결합 능력은 대조군으로 노출된 miR495를 사용하여 겔 지연 분석에 의해 연구되었습니다. 다양한 w/w 비율(0.2–25, SLI 대 miR495)로 제형화된 SLI/RD를 Goldview(Solarbio Science &Technology Co., Ltd., Beijing)를 포함하는 2% 아가로스 겔에 로딩하고 0.5X Tris-Borate에서 전기영동했습니다. -EDTA 버퍼(90 V, 60 분). miR495의 시각화는 Gel-Pro 분석기(Genegenius, Syngene, UK)를 사용하여 수행되었습니다.
용해 완충액(Beyotime, Shanghai)을 사용하여 CCM의 총 단백질을 정확히 측정한 후 BCA 키트를 사용하여 농도 정량화를 수행했습니다. 그런 다음, 샘플을 폴리(비닐리덴 플루오라이드)(PVDF) 멤브레인으로 옮겼습니다. 마지막으로, 멤브레인은 해당하는 첫 번째 항체(Abcam, USA)와 두 번째 항체(Abcam, USA)로 염색되었습니다. 농도계(E-Gel Imager, Thermo-Fisher, USA)를 시각화에 사용했습니다.
CCM/SLI/R-D의 약물 로딩 함량(DLC)은 48시간 동안 메탄올에서 준비된 나노운반체를 발생시켜 측정했습니다. 샘플을 원심분리(10,000 rpm, 30 min)하고 상층액을 수집하여 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의한 DOX 측정을 수행했습니다[33]. miR495 로딩은 260 nm에서 UV 흡광도에 의해 결정되었습니다(UV5Nano, METTLER TOLEDO, Switzerland).
PBS 및 마우스 혈장에서 CCM/SLI/R-D의 입자 크기 변화는 48 h 내의 각 시점에서 기록되었습니다. CCM/SLI/R-D에서 DOX의 방출 프로필은 이전 보고서에 따라 조사되었습니다[34].
세포내 형질감염
A549/DOX 세포를 6웰 플레이트에 24시간 동안 시딩한 다음 CCM/SLI/miR495(miR495 농도, 1-25ng/mL)로 48시간 동안 배양했습니다. 그 후, 세포를 분리하고 수확하여 P-gp 발현의 웨스턴 블롯 분석을 실시했습니다.
약물의 세포내 농도는 이전 보고서에 따라 결정되었다[23]. 간단히 말해서, 다른 시간 간격 동안 CCM/SLI/miR495로 처리한 후, A549/DOX 세포를 DOX와 함께 인큐베이션했습니다. 정해진 시간 간격(4, 8 h)마다 세포를 떼어내어 5 mL의 DOX 추출 용액(에탄올 0.6 M HCl, 1:1, v/v)에 분산시킨 후 ice bath에서 400 W의 초음파 처리 40번 동안. 혼합물을 4 °C에서 24시간 동안 방치하고 12,000 rpm(4 °C)에서 10분 동안 원심분리했습니다. 상층액을 수집하고 위에서 설명한 대로 DOX 함량을 측정했습니다.
세포 생존력
약물이 없는 나노운반체(10–200 μg/mL) 및 CCM/SLI/RD(DOX 농도, 2-50 μM, miR495 농도, 10–250 nM, DOX와 miR495 간의 몰비는 다음과 같이 고정됨)의 세포독성 효과 200) 48시간 동안 A549/DOX 세포에서 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드(MTT) 분석에 의해 결정되었습니다. 세포 사멸 관련 단백질의 수준 변화도 웨스턴 블롯 분석을 사용하여 결정되었습니다.
직경이 300–400 μm인 MCTS를 37 °C에서 5 일 동안 다른 제형(DOX 농도, 25 μM)을 포함하는 배지와 함께 배양했습니다. 광학현미경을 사용하여 MCTS의 직경 변화를 기록했습니다.
CCM/SLI/R-D의 시험관 내 및 생체 내 타겟팅
FAM으로 표지된 siRNA를 채택하여 DDS를 구성했습니다. A549/DOX 세포를 6웰 플레이트에 24시간 동안 접종했습니다. 그런 다음, 세포를 과량의 CCM과 함께 2시간 동안 인큐베이션하고, SLC/siRNA 및 CCM/SLC/siRNA를 첨가하였다. 설정된 시간 간격으로 세포를 수집하고 정량을 위해 유세포 분석기(FCM, FC500MCL, Beckman Coulter)로 측정했습니다.
miR495로 표지된 Cy5를 채택하여 DDS를 구성했습니다. A549/DOX 종양이 있는 마우스는 i.v. SLI/miR495 및 CCM/SLI/miR495를 주입하고 실시간 이미징 시스템(ZEWTON 7.0, Vilber, France)을 사용하여 미리 정해진 시간 간격으로 miR495의 분포를 모니터링했습니다. 12시간 동안 투여한 후 희생된 마우스에서 종양과 주요 장기를 얻었고 분석 분석을 위해 동일한 시스템을 사용하여 영상화했습니다.
체내 항암 분석
CCM/SLI/R-D의 생체내 항암 분석은 A549/DOX 종양 보유 마우스를 사용하여 평가되었습니다. 구체적으로, 마우스를 무작위로 5개 그룹으로 나누었습니다(n =6):(1) 식염수(대조군), (2) 유리 DOX, (3) CCM/SLI/DOX, (4) CCM/SLI/miR495 및 (5) CCM/SLI/R-D. 그 후, 마우스에게 5 mg/kg DOX 및 0.25 mg/kg miR495의 제형을 14 일 이내에 7회 종양 내 투여하였다. 각 그룹의 마우스의 종양 부피와 체중은 2 일마다 측정되었습니다.
결과 및 토론
CCM/SLI/R-D 준비
하나의 DDS에서 우수한 약물 로딩 용량과 생체 적합성을 달성하기 위해 유중수 마이크로에멀젼에서 TEOS 및 AEAPS의 동시 가수분해가 SLI 제조에 사용되었습니다. DOX는 제작 중에 SLI의 매트릭스에 미리 포착되었습니다. 도 1a에 도시된 바와 같이, 동적 광산란(DLS) 결과는 DOX가 로딩된 아민 SLI가 ~ 100 nm의 직경을 갖는다는 것을 보여주었다. TEM 이미지는 나노입자가 DLS에서 얻은 결과와 일치하는 좁은 분포를 가진 구형 모양임을 추가로 보여주었습니다.
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아 다른 w/w 비율에서 SLI/R-D의 크기 및 제타 전위 변화. ㄴ 다양한 w/w 비율에서 SLI/R-D 이원 복합체의 miRNA 결합 분석. 데이터는 평균 ± SD(n =3)
DOX가 로드된 아민 SLI는 26.83 mV의 표면 전위를 가졌으며 이는 miR495 운반체 역할을 하는 데 유용했습니다. 이전 보고서[31]에 따르면, 이진 복합체를 형성하기 위한 miR495와 SLI의 조립은 정전기 상호작용에 의해 구동되었습니다. 이진 복합체의 miR495에 대한 w/w SLI는 최종 형질감염 효율에 상당한 영향을 미칩니다. 그림 1a에서 볼 수 있듯이 miR495는 음전하를 띤 거대분자이기 때문에 miR495에 대한 SLI의 낮은 w/w 비율에서 이원 착물은 입자 크기가 크게 증가한 음의 표면 전하를 나타냅니다. 인접한 나노 입자의 접착. 그러나 w/w 비율이 증가함에 따라 이원 착체의 표면 전하는 점차적으로 양의 값이 되었고 약 100 nm에서 안정된 입자 크기가 관찰되었습니다. w/w 비율이 20에 도달했을 때 이원 착체의 입자 크기와 표면 전위 모두 w/w 비율의 증가에 따른 큰 변화 없이 안정적으로 유지되는 것으로 나타났습니다.
miR495에 대한 나노운반체의 결합 및 보호 능력은 유전자 전달에 필수적입니다. SLI의 miR495 결합 능력은 겔 지연 분석에 의해 평가되었습니다. 도 1b에 도시된 바와 같이, 네이키드 miR495는 지연을 나타내지 않은 반면, SLI의 추가는 miR495의 거동을 유의하게 변화시켰다. SLI는 w/w 비율이 증가함에 따라 miR495 결합 능력이 증가하는 것으로 관찰되었으며, 이는 w/w 비율 5에서 miR495의 완전한 지연을 달성했습니다.
요약하자면, 적절한 입자 크기와 바람직한 표면 전하, 효과적인 miR495 결합 및 보호 특성을 갖는 w/w 비율 20의 이원 착물이 최적의 제형으로 추론하여 수행할 모델로 선택했습니다. 다음 실험.
그런 다음, 서로 다른 질량 비율(SLI 대 CCM 단백질, w/w)에서 CCM과 이원 복합체를 혼합하여 이원 복합체에 대한 최적의 CCM 단백질 비율을 탐색했습니다. 최적의 비율은 다른 조건에서 생성된 입자 크기와 표면 전하에 의해 결정되었습니다. 그림 2a에서 보는 바와 같이 CCM(음전하)을 첨가하면 제품의 크기에 상당한 변동이 발생하지만 표면전하는 지속적으로 감소한다. 결과는 CCM이 이진 복합체의 표면에 성공적으로 고정되었음을 나타냅니다. 가장 중요한 것은 CCM/SLI/R-D의 입자 크기와 표면 전하가 모두 7.5의 질량비에서 안정기에 도달했으며 추가 CCM이 표면 전하에 미미한 영향을 미치고 크기가 약간만 증가하는 것으로 관찰되었다는 것입니다. 구체적으로 말하면, 나노입자의 직경은 121.28 ± 3.36 nm에 달했고 제타 전위는 - 28.04 ± 2.64 mV로 변하여 자유 CCM(- 27.95 .0± 3의 데코레이팅 CM의 표면 전하와 유사함) 이 조건에서 포화 상태에 도달했습니다. 그 결과 질량비 7.5의 CCM/SLI/R-D를 모델 공식으로 선정하여 다음 실험을 수행하였다.
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아 다른 w/w 비율에서 CCM SLC/R-D의 크기 및 제타 전위 변화. 삽입된 이미지는 CCM 및 CCM/SLI/R-D의 3가지 대표적인 단백질에 대한 웨스턴 볼트 분석입니다. ㄴ CCM/SLI/R-D의 크기 분포 및 TEM. 데이터는 평균 ± SD(n =3). 스케일 바 100 nm
CCM/SLI/R-D의 특성
이전 보고서에 따르면 CCM의 단백질은 나노입자를 변형하기 위해 채택될 때 상동 종양 세포를 유도할 수 있습니다[35, 36]. 따라서, 3개의 막 단백질(Na-K ATPase, AT1R 및 CXCR4)을 선택하고 CCM에서 이들의 발현 수준을 CCM/SLI/R-D와 비교하였다. 그림 2a의 삽입된 이미지에서 볼 수 있듯이 CCM에 포함된 3가지 단백질의 양은 모두 CCM/SLI/RD와 유사한 강도를 보였으며, 이는 CCM에 통합된 단백질이 코팅 후 CCM/SLI/RD로 유전됨을 보여주고, 이 과정에서 손실되거나 성능 저하가 무시할 수 있습니다. 이 결과는 또한 CCM/SLI/R-D의 증가된 종양 귀환에 유익한 CCM/SLI/R-D의 성공적인 구성을 확인하는 확실한 증거를 제공했습니다.
CCM/SLI/R-D의 크기 분포와 형태도 DLS와 TEM을 사용하여 연구했습니다. 도 2b에 나타난 바와 같이, DLS는 CCM/SLI/RD가 약 120 nm에서 좁게 분포된 것을 나타내었고, TEM은 CCM/SLI/RD가 구형 코어 쉘 구조를 특징으로 하고 표면에 지질 이중층이 명확하게 관찰될 수 있음을 보여주었다. 레이어.
CM/SLI/R-D에서 DOX의 DLC(HPLC로 측정)는 최대 17.96%, miR495 로딩(UV 분광광도계로 측정)은 최대 1.64%입니다.
이전 연구에서는 약물 분자의 안전한 전달을 위한 몇 가지 예비 요구 사항을 결론지었습니다. 우선 채택된 DDS는 입자 크기가 시스템의 생체 내 운명에 중요한 영향을 미치기 때문에 생리학적 환경에서 극적인 크기 변화 없이 안정적으로 유지되어야 합니다[10, 37]. 그 결과 CCM/SLI/R-D의 시간 의존적 안정성을 조사하였다. 생리적 환경에서 CCM/SLI/R-D의 콜로이드 안정성을 결정하기 위해 PBS(pH 7.4)와 마우스 혈장에서 DDS의 크기 변화를 최대 48시간까지 기록했습니다. 그림 3a에서 볼 수 있듯이 CM/SLN/Ce6은 큰 변화 없이 전체 테스트 범위에서 크기를 효과적으로 유지할 수 있었습니다. 따라서 CCM/SLI/R-D는 생리학적 조건에서 안정적으로 유지될 수 있다고 결론지었다. 그림 3b에서 볼 수 있듯이 CCM/SLI/RD는 세포 외 조건에서 안정성을 유지할 수 있었으며(120시간 배양 후 약물의 32.76%가 방출됨), 전달 과정에서 CCM/SLI/RD가 안전하게 캡슐화할 수 있음을 나타냅니다. 잠재적인 부작용을 유발하지 않고 로드된 약물 분자. 가장 중요한 것은 세포에 들어가 암세포의 산성 환경에 노출되면 약물이 쉽게 방출(75.93%)되는데, 이는 약물과 운반체의 결합을 약화시키는 높은 수소 농도 때문일 수 있습니다[6, 38].
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아 PBS(pH 7.4) 및 마우스 혈장(37 °C에서 최대 48 시간 동안)에서 LCC/R-A의 콜로이드 안정성. ㄴ pH(7.4 및 5.5)의 세포외 및 세포내 조건에서 방출 배지에서 LCC/R-A로부터 DOX의 약물 방출 프로필. 데이터는 평균 ± SD(n =3)
세포내 형질감염
miR495의 형질감염과 P-gp의 발현 사이의 관계를 밝히기 위해 A549/DOX 세포를 다양한 농도의 miR495로 형질감염시켰다. 그 후, 이들 세포에서 P-gp 발현 수준을 웨스턴 블롯 분석을 사용하여 결정하였다. 그림 4a에서 볼 수 있듯이 P-gp의 발현은 miR495 농도와 음의 관계를 보여 CCM/SLI가 miR495 전달에 유용한 도구로 적용될 수 있음을 시사하며, 이는 CCM/SLI/RD가 miR495를 역전시키는 데 도움이 됩니다. A549/DOX 세포에서 MDR. 개념 증명으로 miR495 형질감염이 세포 내 DOX 축적의 변화에 미치는 영향을 더 연구했습니다. 48시간 또는 72시간 동안 CCM/SLC/siRNA로 처리한 후(그림 4b), A549/DOX 세포를 다양한 시간 간격 동안 DOX로 처리했습니다. 도 5d에 나타난 바와 같이, 48시간 동안 CCM/SLC/siRNA 전처리로 A549/DOX 세포에서 DOX의 세포 형광은 1.49배(배양 후 4시간) 및 1.47배(배양 후 8시간) 증가했습니다. , 각각. 72시간 동안 CCM/SLC/siRNA 전처리로 A549/DOX 세포의 세포내 DOX 형광이 1.63배(배양 후 4시간) 및 1.85배(배양 후 8시간) 증가했습니다. 그 결과, CCM/SLC/siRNA는 처리되지 않은 세포에 비해 세포내 DOX 축적을 증가시켜 A549/DOX의 MDR을 극복할 수 있다는 결론을 내렸습니다.
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아 CCM/SLI/miR495를 48시간 동안 처리한 후 A549/DOX 세포에서 miR495 농도와 P-gp 단백질 발현 사이의 관계. ㄴ 다른 시간 간격 동안 LCC/miR495로 처리한 후 A549/DOX 세포에서 세포 내 DOX 축적. 데이터는 평균 ± SD(n =3)
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무약물 운반체(a)로 처리된 A549/DOX 세포의 생존력 ) 또는 (b를 포함하는 약물 ) 48시간 동안 상이한 나노입자/약물 농도에서 상이한 제형. ㄷ 다른 처리 후 caspase-3, cytochrome C 및 bcl-2 단백질의 발현에 대한 Western blot assays. 데이터는 평균 ± SD(n =3).
**피 <0.01
체외 항암 분석
DDS의 생체적합성을 추가로 밝히기 위해 무약물 운반체(CCM/SLI)의 세포독성을 연구했습니다. 그림 5a에서 볼 수 있듯이 최고 농도 200μg/mL에서 48시간 동안 CCM/SLI와 함께 배양한 후에도 A549/DOX는 여전히 90% 이상의 생존율을 보여 CCM/SLI가 미미한 독성 물질과 생체 적합성을 나타냅니다. 세포에.
그 후, 시험관내 항암 분석을 평가하였다. 도 5b에 나타난 바와 같이, 모든 제제의 항암 효과는 약물 농도와 양의 상관관계가 있었다. 구체적으로, A549/DOX 세포의 생존율은 가장 높은 DOX 농도(50 μM)에서 여전히 72.6%였다. 동일한 조건에서 CCM/SLI/DOX와 CCM/SLI/miR495는 유사한 세포 생존율을 각각 59.4%와 63.3%로 DOX보다 높았다. 그러나 CCM/SLI/R-D 처리에 대한 세포 생존율은 38.5%로 유의하게 감소한 것으로 나타났다. 또한, CCM/SLI/R-D의 CI 지수는 0.84로 결정되었으며, 이는 A549/DOX 세포의 사멸에 대한 miR495와 DOX의 강력한 시너지 효과를 시사합니다.
결론을 다시 확인하기 위해 일반적으로 채택된 세포자멸사 조절 단백질(caspase-3, bcl-2 및 cytochrome-3)을 다른 제형으로 평가했습니다. 도 5c에 나타난 바와 같이 CCM/SLI/RD 처리한 세포에서 caspase-3의 절단량이 가장 높았고, bcl-2(apoptosis suppressor) 수치가 모든 시험군 중 가장 낮아 바람직한 항암제임을 더욱 확인시켜 주었다. CCM/SLI/RD의 효능. 또한, CCM/SLI/R-D는 사이토크롬-3의 발현이 훨씬 증가하여 이 그룹의 세포 사멸이 미토콘드리아 손상과 관련이 있음을 시사했습니다.
MCTS는 고형 종양을 모방하고 다양한 제형의 항암 효과를 평가하기 위해 채택되었습니다. 그림 6a에서 볼 수 있듯이 자유 DOX 그룹의 MCTS 부피는 전체 실험 기간 동안 지속적으로 증가하여 A549/DOX의 MDR이 DOX의 세포 독성을 유의하게 감소시킬 수 있음을 시사합니다. 단일 전달 시스템(SLI/DOX 및 SLI/miR495)은 약간의 성장 감소와 함께 특정 억제 효과를 보여주었습니다. 가장 중요하게는, CCM/SLI/R-D에서 miR495와 DOX의 조합은 테스트가 끝날 때 관찰된 음성 부피 성장과 함께 크게 향상된 효능을 보여주었습니다. 그림 6b의 광학 이미지도 유사한 결론에 도달했습니다.
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볼륨 변경(a ) 및 해당 광학 이미지(b ) 다른 치료 후 MCTS. 데이터는 평균 ± SD(n =3).
**피 <0.01
체외 및 생체 내 타겟팅
다양한 제형의 차별적인 항종양 효과에 대한 가능한 이유를 밝히기 위해 많은 연구에서 CCM의 표면 변형이 종양을 향상시킬 수 있음이 입증되었기 때문에 CCM 변형이 A549/DOX 세포에서 나노입자의 내재화 능력을 긍정적으로 증가시킬 수 있는지 여부를 조사하기 위해 세포 흡수를 평가했습니다. -나노운반체의 표적화 능력[39, 40]. 도 7a에 나타낸 바와 같이, 세포내 형광 강도는 시간의 함수로서 CCM/SLI/miR49 및 SLI/miR495 그룹에서 증가하였고, 이는 두 나노입자 모두에서 시간과 세포 흡수 사이의 양의 관계를 시사한다. 또한, 6 h 시점에서 CCM/SLI/miR495 그룹에서 보다 높은 형광 신호가 관찰되었으며, 이는 SLI/miR495 그룹에 비해 1.58배 높았다. CCM/SLI/miR495의 흡수가 CCM 매개 엔도사이토시스를 통한 것인지 확인하기 위해 나노캐리어를 추가하기 전에 세포를 과량의 CCM과 함께 인큐베이션했습니다. CCM/SLI/miR495 그룹의 형광 강도는 계속 감소한 반면, SLI/miR495 그룹의 형광 강도는 거의 동일한 수준을 유지하는 것으로 관찰되었습니다. 이러한 결과는 CCM/SLI/miR495가 CCM 관련 endocytosis를 통해 세포에 의해 흡수되었음을 입증했습니다.
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아 A549/DOX 세포(CCM이 있거나 없는 전처리)에서 다양한 제형의 세포내 시간 의존적 흡수의 정량적 분석. ㄴ 주사 후 48시간에서 SLI/R-A 및 CCM/SLI/R-A로 처리된 마우스의 해부된 종양 및 주요 기관의 평균 형광 강도. 데이터는 평균 ± SD(n =3).
**피 <0.01
A549/DOX의 CCM은 동종 A549/DOX 세포에 대한 CCM/SLI/R-D의 종양 표적화 능력을 향상시켜 종양에서 나노운반체의 축적을 증가시킬 것으로 예상되었습니다. 우리의 개념을 검증하기 위해 SLI/R-D 및 CCM/SLI/R-D의 분포를 실시간 이미징 시스템으로 모니터링했습니다. 도 7b에 나타난 바와 같이, 예상한 바와 같이 CCM/SLI/R-D는 SLI/R-D에 비해 종양 내에서 더 많은 축적을 보였다. 또한, SLI/R-D는 간과 비장에 초점을 두어 거의 모든 장기(심장 제외)에 분포하는 것으로 결론지었는데, 이는 종양 유도 능력이 낮기 때문일 수 있습니다. 반대로, CCM 수정은 종양 조직에 적재된 화물의 향상된 귀환을 돕기 위해 간 포획을 상당히 완화할 수 있습니다.
체내 항종양 효능
CCM/SLI/R-D의 생체내 항종양 효능을 수행했습니다. DOX 또는 SLI/DOX로 처리한 후 마우스의 종양 성장이 느려졌습니다. 그러나 CCM/SLI/R-D는 최고의 항종양 효능을 보였고 303 ± 25 mm
3
의 종양 부피를 분명히 감소시켰습니다. . 또한, 다른 그룹의 마우스의 체중 변화 결과도 흥미로운 결과를 보여주었습니다(그림 8). 이는 CCM/SLI/R-D로 처리된 마우스에서 체중의 명백한 감소가 없음을 보여주었으며, 이는 CCM/SLI/R-D의 종양 표적화 능력이 부작용 감소와 함께 항종양 효능을 향상시킬 수 있음을 시사합니다. 대조적으로, 유리 DOX의 표적화되지 않은 분포는 마우스에 전신 독성을 일으켰으며, 이는 시간의 함수로 체중이 점차적으로 감소하는 것으로 반영되었습니다. 요약하면, CCM/SLI/R-D는 폐 종양 치료를 위한 우수한 종양 귀소 DDS였습니다.
The tumor volume (a ) and body weight (b ) of tumor tissue analysis of A549/DOX tumor-bearing Balb/c nude mice after intratumoral administration of different formulations. Data were expressed as mean ± SD (n =6).
**피 < 0.01
Conclusion
In summary, we successfully constructed a CCM-coated SLI nanoparticle as a DDS to co-delivery miR495 and DOX (CCM/SLI/R-D). The characterization demonstrated that CCM/SLI/R-D showed well distribution with a diameter of 120 nm, which showed high stability as well as pH-responsive drug release. Cellular experiments revealed that CCM/SLI/R-D could realize preferable miR495 delivery which achieved the significant downregulation of P-gp, which finally overcome the MDR in A549/DOX by increasing the intracellular DOX accumulation compared to untreated cells. The CCM/SLI/R-D showed promising tumor-homing capability. Most importantly, the synergetic effect of miR495 and DOX achieved much more potent anticancer effect to mono-delivery DDS or free DOX both in vitro and in vivo.
Availability of Data and Materials
The data and the analysis in the current work are available from the corresponding authors on reasonable request.
