인체 피부 내 은 나노입자 물리화학적 특성 평가를 위한 새로운 분석 시스템

초록

화장품에서 은 나노입자(nAg)의 안전한 사용을 보장하기 위해서는 피부 내 nAg의 물리적 특성을 밝혀야 합니다. 이 특성들은 경피 흡수 과정에서 변할 수 있기 때문입니다. 본 연구에서는 단일 입자 유도 결합 플라즈마 질량 분석법(sp-ICP-MS) 기반의 분석 시스템을 확립하여 피부 내 nAg의 물리적 특성을 결정하고자 했습니다. 먼저, 피부 시료 용해화를 위한 전처리 방법을 최적화했고, 수산화나트륨 처리로 대부분의 nAg가 입자 형태로 회수됨을 보였습니다. 표피와 진피로 피부를 분리하기 위해 여러 마이크로파 조사 조건을 선별했습니다. sp-ICP-MS 분석 결과, 200 W로 30초 조사하는 조건이 최적이었으며, 이 조건은 nAg 대다수의 물리적 특성을 변경하지 않고 피부 층을 완전히 분리했습니다. 마지막으로, 피부를 nAg 또는 Ag⁺에 노출시킨 후 쥐의 표피, 진피, 말초 혈액 내 Ag의 양과 물리적 특성을 분석하여 생체 내 적용을 평가했습니다. 후속 sp-ICP-MS 분석 결과, nAg는 이온화된 형태로 흡수되어 더 깊은 층으로 분포하는 반면, Ag⁺는 물리적 특성 변화 없이 흡수 및 분포됨을 나타냈습니다. 이 연구는 피부가 nAg에 노출된 후 반응을 포괄적으로 이해하기 위해서는 nAg뿐만 아니라 nAg에서 방출되어 피부 내로 들어간 Ag⁺의 분포와 입자 크기도 고려해야 함을 시사합니다.

서론

나노기술의 최근 기술 발전은 100 nm 미만의 입자인 엔지니어링 나노입자(ENP)의 개발을 가속화했습니다. 미세 또는 더 큰 크기의 소재에 비해 향상된 조직 침투와 표면 반응과 같은 유익한 특성 덕분에 ENP는 화장품, 식품, 의약품 등 다양한 제품에 널리 사용되고 있습니다[1,2,3]. 예를 들어, 은 나노입자(nAg)는 가장 일반적인 ENP 유형 중 하나로, 은 이온(Ag⁺)의 지속적 방출로 인한 항균 특성 때문에 화장품에 첨가됩니다[4, 5]. 그러나 nAg의 작은 입자 크기와 관련된 고유한 물리화학적 특성은 위험할 수 있습니다. 이러한 입자가 혈액-뇌 장벽과 같은 그렇지 않으면 뚫을 수 없는 장벽을 방해하고 염증을 유발할 수 있음이 알려져 있습니다[6]. 또한 일부 연구에서는 ENP가 피부 장벽을 침투할 수 있다고 보고했습니다[7,8,9]. 따라서 이러한 입자를 지속적으로 사용하기 위한 안전성을 판단하기 위해서는 피부와 같은 조직 내 이러한 입자의 역학을 조사하여 nAg를 함유한 ENP와 관련된 독성 효과를 이해하는 것이 중요합니다.

안전을 보장하기 위해서는 ENP 사용과 관련된 잠재적 위험을 이해하는 것이 필수적이며, 이는 "유해성"(잠재적 독성)과 "노출 조건"의 통합적 개념을 포함합니다. ENP의 유해성은 전 세계적으로 분석되었지만, ENP 노출 조건에 관한 연구는 소수에 불과합니다[10]. 특히 nAg와 Ag⁺가 체내에서 물리적 특성을 변경할 수 있음이 보고되었습니다. 예를 들어, nAg의 이온화는 더 작은 입자 크기의 nAg 형성과 Ag⁺ 방출을 초래합니다[11]. 반대로, 초산은을 경구 투여한 쥐의 장 상피에서 작은 입자 크기의 nAg가 검출되었습니다[12]. 또한 우리는 최근 수유 중인 쥐가 해당 nAg에 노출되었을 때, 더 작은 nAg와 Ag⁺에 비해 더 큰 nAg가 모유에서 더 쉽게 발견됨을 보고했습니다[13]. 따라서 nAg는 체내에서 물리적 특성을 변경할 수 있으며, 이는 다시 동역학 변화를 초래합니다. 따라서 위험을 이해하기 위해서는 이러한 입자의 입자 크기 등 물리적 특성을 평가하고, 체내에서 입자와 이온을 구별하는 것이 필요합니다.

이와 관련하여 우리는 단일 입자 유도 결합 플라즈마 질량 분석법(sp-ICP-MS)을 적용했습니다. 이 방법은 최대 1개의 입자가 체류 시간당 분석기에 도입되도록 합니다. 피크 강도 분석으로 입자 크기를 결정하고 피크 비율로 입자 농도를 구할 수 있는 효과적인 방법입니다. 피크와 배경 신호를 모두 분석하여 입자와 이온을 구별할 수 있습니다[14]. 우리는 이전에 생물 시료에서 sp-ICP-MS를 위한 전처리 방법을 최적화하여 간, 심장, 폐, 신장, 비장 등 다양한 장기 내 ENP의 물리적 특성을 반정량적으로 결정한 바 있습니다[15].

피부는 각질층(SC)을 포함한 표피와 혈관, 림프관, 신경을 포함한 진피로 구성됩니다[16]. 따라서 ENP가 각 피부 층으로 진입하면 다양한 정도의 독성을 유발할 수 있습니다. 예를 들어, 표피의 인간 피부 각질세포 내 이산화 티타늄 나노입자의 분포는 활성 산소 종 생성을 자극할 수 있습니다[17]. 또한 무모 마우스에서 60일간 이산화 티타늄 나노입자에 경피 노출되면 국소 독성으로 인한 진피 얇아짐 같은 병리적 변화뿐만 아니라, 진피 혈관을 통해 전신으로 퍼진 전신 독성으로 인한 간 액화 괴사 같은 병리적 변화도 유발되었습니다[18]. 또한 각 층에서의 생물학적 반응은 입자 크기 등 물리적 특성과 입자와 이온의 차이에 따라 달라질 수 있습니다[19]. nAg 사용의 안전성을 이해하기 위해서는 피부 노출 후 nAg의 물리적 특성과 생체 분포를 이해하는 것이 필요합니다.

이 특정 문제를 해결하기 위해서는 회수 중 손실이나 ENP 물리적 특성 변화 없이 피부를 전처리하고 층을 분리할 수 있는 접근법이 필요합니다. 그러나 피부에 대한 그러한 최적의 접근법은 아직 고안되지 않았습니다.

본 연구에서는 모델 ENP인 nAg의 물리적 특성을 피부 각 층에서 sp-ICP-MS로 반정량적으로 결정하기 위한 전처리 접근법을 최적화하고, 이후 생체 내에서의 유효성을 평가했습니다.

방법

실험용 쥐

Slc:ICR 쥐(암컷, 8주령)를 Japan SLC(시즈오카, 일본)에서 구매했습니다. 쥐는 오전 8시 점등, 오후 8시 소등의 명암 주기 조건에서 사육되었습니다. 사료와 물은 케이지 상단의 사료 펠릿과 급수 시스템 형태로 자유롭게 섭취할 수 있게 했습니다. 모든 실험 프로토콜은 일본 오사카 대학 동물 연구 위원회 승인 조건 하에서 수행되었습니다.

nAg 및 Ag⁺

직경 100 nm의 구연산 리간드 캡핑 nAg(nAg100) 현탁액을 nanoComposix(샌디에이고, CA, 미국)에서 스톡 분산액(1 mg/mL) 형태로 구매했습니다. 질산은(AgNO₃)은 Wako Pure Chemical Industries(오사카, 일본)에서 스톡 분산액(1 mg/mL) 형태로 구매했습니다. 수송 효율 계산용 표준 물질인 RM8013은 미국 국립표준기술연구소(가이더스버그, MD, 미국)에서 구매했습니다. 각 나노입자 유형은 사용 전 10분간 초음파 처리했습니다. 나노입자와 이온도 사용 전 10초간 볼텍스 처리했습니다.

시약

수산화나트륨(NaOH, 0.1 mol/L)은 Nacalai Tesque Company(오사카, 일본)에서, 질산(HNO₃, 70%)은 Kanto Kagaku Chemical Industries(도쿄, 일본)에서 구매했습니다. 인산 완충 식염수(PBS), pH 7을 제조했습니다.

전처리 방법 최적화

각 쥐의 표피와 진피를 분리하여 PBS(w/v 비율 1:10)와 혼합하고 균질화했습니다. 균질액에 100 ng/mL nAg100 용액을 혼합했습니다. 혼합물을 v/v 비율 1:1로 다음 시약 중 하나로 처리했습니다: 0.1 mol/L NaOH, 70% HNO₃, 또는 PBS. 시료를 37°C에서 3시간 배양한 후 sp-ICP-MS를 수행했습니다.

마이크로파 조사로 피부 층 분리

각 쥐를 이소플루란(Wako)으로 안락사시킨 후, 외과용 가위와 핀셋으로 2 cm²(2 cm × 1 cm) 등쪽 피부 시료를 절제했습니다. 절제 과정에서 조직 손상을 방지하기 위해 특별히 주의했습니다. 마이크로파 오븐(RE-SW-20-H, Sharp, 일본)을 사용하여 2450 MHz 주파수로 피부를 조사했습니다. 피부 시료를 접시에 올려 마이크로파 오븐 중앙에 두었습니다. 테스트 요구사항에 따라 피부 시료를 200, 600, 900 W에서 각각 10, 30, 60초간 조사했습니다. 조사 후 시료를 신속하게 꺼내 외과용 핀셋으로 부드럽게 긁어 표피와 진피를 빠르게 분리했습니다. 100 ng/mL nAg100 용액을 조사(200 W, 30초) 후 회수율과 nAg 평균 직경 분석에 사용했습니다.

nAg100 및 Ag⁺ 경피 투여

9주령 암컷 Slc:ICR 쥐를 체중에 따라 3마리씩 6그룹으로 나누었습니다. 쥐를 이소플루란으로 마취했습니다. 등 털을 헤어 클리퍼(Panasonic®, 오사카, 일본)와 손 면도기(Gillette®, 독일)로 밀었습니다. 다음으로 nAg100과 Ag⁺(20 μg/cm²)를 등 피부 2.25 cm²(1.5 cm × 1.5 cm) 면적에 직접 도포하고 흡수되지 않는 비닐 필름으로 단단히 덮었습니다. 같은 크기의 거즈를 비닐 필름 위에 올리고 자가 접착 탄력 붕대로 피부 주위를 감싸 덮었습니다. 5일간 덮은 채로 두었습니다.

피부 시료 및 혈액 전처리

처치 5일 후, 안와 정맥총에서 말초 혈액과 등 피부를 채취하여 분석했습니다. 외과용 가위와 핀셋으로 2.25 cm²(1.5 cm × 1.5 cm) 등 피부 시료를 절제했습니다. 절제 시 조직 손상 방지에 주의했습니다. 2 cm 크기의 접착 테이프(Scotch®, 3M) 조각을 사용하여 순차적으로 각질층(SC)을 제거한 후 표피와 진피를 분리했습니다. 테이프 조각을 등 피부 처리 부위에 눌러 10초간 일정한 압력을 가했습니다. 쥐 한 마리당 20개 테이프 조각으로 전체 SC를 제거했습니다. 다음으로 마이크로파 조사로 진피와 표피를 분리하고 PBS(w/v 비율 1:10)와 균질화했습니다. 채취한 혈액과 진피 및 표피 균질액을 v/v 비율 1:1로 0.1 mol/L NaOH로 처리하고 각각 37°C에서 3시간 배양했습니다. 배양 후 혈액, 표피, 진피 혼합물의 총 은 질량을 유도 결합 플라즈마 질량 분석법(ICP-MS)으로 분석했습니다. nAg와 Ag⁺의 정량화 및 물리적 특성 평가는 sp-ICP-MS로 수행했습니다.

은 총 질량 측정

혈액, SC, 표피, 진피 시료의 총 은 농도를 측정하기 위해 Agilent 7700x ICP-MS 시스템(Agilent Technologies, 산타클라라, CA, 미국)을 사용했습니다. 분석 조건은 다음과 같습니다: RF 파워 1550 W; 캐리어 가스 1.05 L/min Ar; 체류 시간 100 ms. MS 모드에서 3회 반복 측정했습니다. Rh을 Ag의 내부 표준으로 사용했습니다. ICP-MS 분석 대상 원소는 ¹⁰³Rh와 ¹⁰⁷Ag입니다. Ag와 Rh 표준 용액은 Wako에서 구매했습니다.

sp-ICP-MS 분석 및 계산

sp-ICP-MS 분석에는 Agilent 7700x ICP-MS(Agilent Technologies)를 사용했습니다. 분석 조건: RF 파워 1550 W; 캐리어 가스 1.05 L/min Ar; 체류 시간 10 ms; 분석 시간 30 s. 단일 입자 계산 도구인 RIKILT(Wageningen Food Safety Research, 바헤닝겐 대학, 네덜란드)를 사용하여 입자 크기를 계산했습니다[20].

통계 분석

모든 통계 분석은 GraphPad Prism 소프트웨어 버전 5.0(Macintosh용, GraphPad Software, 라호야, CA, 미국)을 사용하여 수행했습니다. 통계적 유의성은 P < 0.05로 설정했습니다.

결과 및 논의

각 피부 층 내 nAg의 양과 물리적 특성 결정을 위한 방법 구축 전략

각 피부 층 내 nAg의 양과 물리적 특성을 결정하기 위해서는 피부 시료를 완전히 용해시키고 sp-ICP-MS 분석에 적합한 시료를 제조해야 합니다. 또한 회수 중 손실이나 nAg 물리적 특성 변화 없이 표피와 진피를 분리하는 것이 필수적입니다. 왜냐하면 비경피 흡수된 nAg가 테이프 스트리핑으로 SC 제거 시 제거될 수 있기 때문입니다[21].

피부 시료 용해화와 관련하여, 우리는 이전에 NaOH 전처리가 간, 심장, 폐, 신장, 비장 등 동물 조직에서 nAg의 정량화 및 물리적 특성 분석에 최적의 기술임을 보고한 바 있습니다[16]. 따라서 본 연구의 피부 시료에 NaOH 전처리를 적용했습니다.

수열 처리는 콜라겐 섬유 연화와 효소 소화 촉진으로 표피-진피 접합부(EDJ)에서 분리를 촉진하여 피부를 표피와 진피 층으로 분리하는 데 널리 사용됩니다[22]. 이러한 처리가 피부 층을 효율적으로 분리하지만, 수용액에서 nAg가 이온화되어 물리적 특성이 변할 수 있습니다. 짧은 펄스 마이크로파 조사가 열 발생으로 EDJ를 파괴하여 피부를 표피와 진피 층으로 분리할 수 있음이 보고되었습니다[23, 24]. 따라서 용액 배양 없이 짧은 시간 마이크로파 조사를 적용했습니다.

종합적으로, 우리는 nAg의 각 피부 층 내 회수율과 물리적 특성 변화를 분석하여 검증한 전략(그림 1 참조)을 제안했습니다.

표피와 진피에서 nAg100 검출을 위한 전처리 방법 최적화

피부 시료 용해화를 위한 전처리 방법 최적화를 위해 이전 연구를 참조했습니다. Ishizaka 등[15]은 NaOH와 HNO₃ 등 다양한 용해 시약 중 NaOH 전처리가 최적임을 보고했습니다. 따라서 산성 및 알칼리성 용해 시약으로 각각 HNO₃와 NaOH를 테스트했습니다. 쥐 피부 시료에서 분리된 표피와 진피 균질액을 nAg100과 혼합하여 최종 Ag 농도 100 ng/mL가 되게 한 후 각 용해 시약으로 37°C에서 처리했습니다. 먼저 이 시약들로 처리 후 Ag 회수율을 평가했습니다. ICP-MS 분석 결과, NaOH와 HNO₃ 처리만으로 거의 100% 회수율을 달성했습니다(그림 2a). 다음으로 각 처리에 의한 물리적 특성 변화를 평가하기 위해 각 입자와 이온의 회수 농도를 분석했습니다. sp-ICP-MS 분석 결과, HNO₃ 처리로 nAg100이 거의 완전히 이온화됨을 보였습니다. 이는 산성 시약인 HNO₃이 입자를 용해시켜 이온으로 전환시킴을 시사하며, 이전 연구에서도 보고된 바 있습니다[15]. 반면 NaOH 처리된 nAg100 대다수는 이온이 아닌 입자 형태로 남았습니다(그림 2b). 따라서 NaOH는 nAg100 대다수를 입자 형태로 유지시켰습니다. 마지막으로 입자 직경 분포를 평가하여 물리적 특성을 자세히 분석했습니다. HNO₃ 처리는 평균 입자 직경을 100 nm에서 40 nm로 변경시켰으며, 이는 nAg100의 이온화에 해당합니다. 반대로 NaOH 처리 후 평균 입자 직경은 약 100 nm로 초기 입자 크기에 해당했습니다(그림 2c). 이는 NaOH 전처리가 쥐 피부에서 nAg100 검출에 최적임을 시사합니다.

마이크로파 조사를 통한 피부 시료의 표피와 진피 분리 및 nAg 회수율과 물리적 특성 변화 평가

피부 시료를 표피와 진피 층으로 분리하기 위해, 우리 연구와 관련되고 이전에 성공적이라고 보고된[24] 다양한 마이크로파 조사 조건을 적용하고, 피부 분리 가능성과 물리적 특성 변화 측면에서 성능을 비교했습니다. 200 W 10초, 600 W 30초, 600 W 60초, 950 W 30초, 950 W 60초 조건에서는 피부가 표피와 진피 층으로 분리되지 않았습니다(그림 3a). 또한 200 W 60초, 600 W 10초, 950 W 10초 조건에서는 피부가 부분적으로만 분리되었습니다. 반면 200 W 30초 조사 후에만 피부가 표피와 진피 층으로 완전히 분리되었습니다. 이 결과들은 200 W 30초 조사가 피부 층 분리에 최적임을 나타냅니다.

200 W 30초 마이크로파 조사가 nAg100의 물리적 특성에 영향을 미치는지 검증하기 위해, 표피와 진피 층에서 Ag의 물리적 특성을 결정했습니다. 각각 100 ng/mL nAg100과 혼합된 표피와 진피 균질액을 NaOH로 용해시키고 200 W 30초 조사했습니다. Sp-ICP-MS 분석 결과, 마이크로파 조사 처리된 nAg100 대다수가 입자 형태로 남았으며, 비처리 그룹도 마찬가지였습니다(그림 3b). 물리적 특성을 자세히 분석하기 위해 입자 직경 분포도 평가했습니다. 평균 입자 크기는 거의 100 nm 직경으로 초기 입자 크기에 해당했습니다(그림 3c). 이 결과들은 200 W 30초 마이크로파 조사가 nAg100의 물리적 특성을 변경하지 않고 피부를 표피와 진피 층로 효율적으로 분리하는 유망한 접근법임을 시사합니다.

종합적으로, 우리는 sp-ICP-MS로 각 피부 층 내 nAg100의 물리적 특성을 반정량적으로 결정하는 시스템을 성공적으로 개발했습니다. 구체적으로 이 방법은 다음과 같습니다: (i) 테이프 스트리핑 법[21]으로 SC를 제거하여 비경피 흡수된 nAg100 제거; (ii) 마이크로파 조사로 피부를 표피와 진피 층로 분리; (iii) NaOH 처리로 표피와 진피 용해; (iv) sp-ICP-MS로 각 피부 층 내 Ag의 물리적 특성 반정량적 결정.

쥐 피부 층 내 nAg100 및 Ag⁺의 양과 물리적 특성 생체 내 결정으로 실용적 평가

이 접근법의 실용적 적용을 평가하기 위해, 쥐 피부를 nAg100과 Ag⁺에 생체 내 노출시킨 후 표피, 진피, 말초 혈액 내 Ag의 양과 물리적 특성을 분석했습니다. 노출 5일 후, 이전 섹션에서 설명한 대로 마이크로파 조사 최적 조건으로 피부를 표피와 진피로 분리하고 NaOH로 용해시켰습니다. ICP-MS 분석 결과, 모든 그룹의 모든 조직(표피, 진피, 혈액 등)에서 Ag가 검출되었습니다. 진피와 혈액에서 Ag⁺ 노출 그룹의 Ag가 nAg100 노출 그룹보다 증가하는 경향을 보였습니다(그림 4a). 이 데이터는 이온과 입자 형태 모두 경피 흡수되어 분포되지만[8, 9], 이온 형태가 입자 형태보다 깊은 조직 층으로 더 쉽게 침투함을 시사합니다.

다음으로 각 시료에서 nAg와 Ag⁺의 비율을 평가했습니다. Ag⁺ 노출 그룹에서는 표피, 진피, 혈액에서 거의 모든 Ag가 이온 형태로 검출되어, Ag⁺가 물리적 특성 변화 없이 경피 흡수되어 분포됨을 나타냈습니다. 반면 nAg100 노출 그룹에서는 표피와 진피의 Ag 약 70%가 입자 형태로 존재했으며, 나머지 Ag는 이온화되었습니다. 또한 말초 혈액에서 검출된 Ag는 거의 완전히 이온화되었으며 입자 형태는 거의 검출되지 않았습니다(그림 4b). 마지막으로 주로 입자 형태가 검출된 표피와 진피 층에서 입자 크기를 평가했습니다. sp-ICP-MS 분석 결과, 두 층에서 검출된 입자 크기는 약 70-80 nm로, nAg100 이온화율에 해당했습니다(그림 4c). 이 데이터는 피부가 nAg100에 노출되면 이온화되면서 흡수되어 분포될 수 있음을 시사합니다.

이전에 보고된 바와 같이, 나노입자의 표면 리간드는 피부 흡수에 영향을 미칩니다[25, 26]. 예를 들어, 아미노기로 변형된 금 나노입자가 카복실기로 변형된 금 나노입자보다 쥐와 인간 피부에 더 많이 흡수됨이 체외 실험에서 밝혀졌습니다[25]. 또한 분자 동역학 분석에 따르면 피부 침투 능력은 중성 소수성, 양이온, 음이온 금 나노입자 순으로 감소했습니다[26]. 이와 관련하여 본 연구에서 nAg100이 구연산으로 변형되어 음전하를 띠기 때문에 표피의 초기 피부 장벽인 SC를 침투하기 어려웠을 것으로 추론됩니다. 따라서 입자가 진피와 혈액에서 관찰된 이유는 모공과 표피를 통해 침투했기 때문일 수 있습니다.

또한 세포 침투 펩타이드(Tat, R7 등)로 변형하여 금 나노입자의 침투성이 향상됨이 보고되었습니다[25]. 따라서 향후 nAg에 유사한 변형을 고려하여 피부 깊은 곳까지 전달할 수 있을 것입니다. 또한 nAg 크기를 줄이는 것이 필요할 수 있습니다. 표면 변형의 효과가 더 큰 비표면적을 가질 때 더 크기 때문입니다.

결론

본 연구에서는 sp-ICP-MS로 각 피부 층 내 nAg100의 물리적 특성을 반정량적으로 결정하기 위한 전처리 접근법을 개발했습니다. 이 접근법을 사용하여 피부 nAg100 노출이 nAg100의 이온화, 흡수, 더 깊은 층으로의 분포를 초래할 수 있음을 보였습니다. 따라서 피부 nAg100 노출과 관련된 생물학적 반응이나 독성을 이해하기 위해서는 nAg100의 분포와 입자 크기뿐만 아니라, nAg100에서 유래하여 피부 조직에 녹아든 Ag⁺의 분포도 고려해야 할 수 있습니다. 따라서 이 접근법은 위험 분석에 사용될 수 있는 기초 기술로서 유망합니다.