M1 대식세포 유래 엑소좀의 마이크로RNA(miR)가 간세포암(HCC) 진행을 조절할 수 있다는 증거가 축적되고 있습니다. 그러나 M1 대식세포 유래 엑소좀의 miR-326이 HCC에 미치는 영향은 보고된 바 없습니다. 따라서 본 연구의 목적은 M1 대식세포 유래 엑소좀 miR-326이 HCC 세포 진행을 조절하는 기전을 탐구하는 것입니다. RT-qPCR로 HCC 세포주에서 miR-326 발현을 검출했습니다. miR-326 발현을 형질주입으로 조절하고, CD206 및 NF-κB 발현, 세포 증식, 집락 형성, 이동, 세포자멸사, 침윤에 미치는 영향을 확인했습니다. 이후 M1 대식세포로부터 엑소좀을 분리하고, RT-qPCR로 M1 대식세포 유래 엑소좀 내 miR-326 발현을 확인했습니다. 엑소좀 내 miR-326 발현을 형질주입으로 변경하고, M1 대식세포 유래 엑소좀을 HCC 세포와 공동배양하여 HCC 세포의 생물학적 진행에 미치는 영향을 파악했습니다. 마지막으로 동물 실험으로 체외 결과를 검증했습니다. miR-326은 HCC 세포에서 감소하고 M1 대식세포 유래 엑소좀에서 풍부했습니다. miR-326 상향조절은 HCC 세포 증식, 집락 형성, 이동, 침윤, CD206 및 NF-κB 발현을 억제하고 세포자멸사를 촉진했으며, 생체 내 HCC 종양 성장을 억제했습니다. 반면 miR-326 하향조절은 반대 효과를 보였습니다. M1 대식세포 유래 엑소좀은 HCC 세포 증식, 집락 형성, 이동, 침윤, CD206 및 NF-κB 발현을 억제하고 세포자멸사를 촉진했으며, miR-326 과발현은 M1 대식세포 유래 엑소좀의 HCC 세포에 대한 효과를 강화했습니다. M1 대식세포 유래 엑소좀 miR-326이 NF-κB 발현 하향조절을 통해 HCC의 증식, 이동, 침윤을 억제하고 세포자멸사를 촉진함이 밝혀졌습니다.
간세포암(HCC)은 전 세계적으로 다섯 번째로 흔한 암이자 가장 흔한 원발성 간암입니다[1]. 중국 국가 암 등록부 자료에 따르면 원발성 간암 사망률은 흔한 악성 종양 중 3위, 발생률은 4위입니다[2]. HCC 주요 위험 요인은 B형 및 C형 간염 바이러스 만성 감염, 아플라톡신 오염 식품, 비만, 흡연, 과도한 음주, 제2형 당뇨병 등입니다[3]. 경동맥 화학색전술은 중기 HCC의 확립된 치료법으로, 중기 또는 진행기 HCC 환자 대다수의 생존율을 개선합니다[4]. 현재 HCC 진단은 주로 혈청 생체표지자와 영상 기술에 의존합니다[5]. HCC 관련 5년 생존율은 약 60%에 불과하며, 최근 수년간 발생률이 매년 증가하고 있습니다[6]. 이를 고려할 때 정확한 치료 표적 연구는 HCC 치료의 최우선 과제입니다.
대식세포는 면역계의 효과 세포이자 주요 조절자로, 조직 재구성과 복구에 막대한 기능을 수행하며 생체 내 거의 모든 조직에서 조절 대사 기능을 수행합니다[7]. M1 대식세포가 종양 촉진 효과를 나타내고 HCC 세포 운동성을 증가시킨다는 보고가 있습니다[8]. 엑소좀은 직경 40~150 nm의 원반형 소포입니다[9]. Xu 등에 따르면 엑소좀 마이크로RNA(miRNA)는 표적 세포 내 유전자 발현 조절을 통해 HCC의 증식, 침습성, 전이, 약물 저항성에 관여합니다[10]. 한 연구에서 miR-326을 함유한 엑소좀이 다발성 경화증의 잠재적 임상 표적이 될 수 있음이 입증되었습니다[11]. miRNA는 특정 서열에 의해 mRNA 분해와 번역 차단을 통해 수많은 단백질 암호화 유전자 발현을 조절함으로써 종양 유전자 또는 종양 억제자로 작용할 수 있습니다[12]. 한 연구에서는 miR-326이 세포주기 진행 교란과 세포자멸사 촉진을 통해 HCC 세포 성장을 억제하고, 상피-중간엽 전이 표현형 감소를 통해 세포 침윤을 억제한다고 보고했습니다[13]. 또 다른 연구에서는 miR-326이 HCC 환자 치료의 잠재적 치료 표적이 될 수 있다고 보고했습니다[14]. 따라서 본 연구에서는 엑소좀 miR-326이 HCC 세포의 침윤과 이동을 조절하는 기전을 논의했습니다.
모든 동물 실험은 국제 위원회의 실험동물 관리 및 사용 지침을 준수했습니다. 프로토콜은 지린대학교 제3병원 기관동물관리사용위원회 승인을 받았습니다.
인간 단구성 세포주 THP-1(중국과학원 쿤밍동물연구소, 쿤밍, 중국)을 10% 열비활성화 태아소혈청(FBS) 함유 RPMI 1640 배지(깁코, CA, 미국; 써모 피셔 사이언티픽, MA, 미국)에서 배양했습니다. THP-1 세포를 150 ng/mL 포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트(PMA; P8139, 시그마-알드리치, SF, CA, 미국)와 반응시키고 RPMI 배지에서 24시간 배양하여 M0 대식세포를 얻었습니다. 라이트 염색으로 유도 전후 세포 형태를 관찰했습니다. THP-1 세포와 유도된 대식세포를 5 μL PBS에 재현탁하여 슬라이드 글라스에 떨어뜨리고, 라이트 염색액과 완충액을 1:2로 혼합하여 10분간 염색 후 흐르는 물로 세척하고 현미경으로 관찰했습니다. 또한 M0 대식세포 표지자인 CD68과 CD206을 역전사 정량 중합효소 연쇄반응(RT-qPCR)으로 측정했습니다. 다음으로 20 ng/mL 인터페론(IFN)-γ(#285-IF; R&D Systems, MN, 미국)와 10 pg/mL LPS(#8630; 시그마-알드리치)로 18시간 배양하여 M1 대식세포로 유도했습니다. M1 대식세포 표지자인 IDO1과 IL-12 p35를 RT-qPCR로 검사했습니다[15].
엑소좀 분리 키트(ExoEasy Maxi Kit, Qiagen, 힐덴, 독일)로 엑소좀을 추출했습니다. 대식세포 상등액을 무균 조건에서 15 mL 원심분리관에 모아 0.8-μm 필터로 여과했습니다. 각 그룹의 세포 상등액에 XBP 완충액(1:1)을 첨가하고 exoEasy 막 친화력 원심분리 컬럼으로 500g에서 원심분리했습니다. 10 mL XWP 완충액을 첨가하고 3000~5000g에서 원심분리했습니다. exoEasy 막 친화력 원심분리 컬럼을 400 μL XE 용출 완충액으로 배양하고 500g에서 원심분리했습니다. 용출 완충액을 exoEasy 막 친화력 원심분리 컬럼으로 옮기고 500g에서 원심분리했습니다. 용출 완충액을 4°C에서 24시간 보관 후 확인용으로 사용했습니다. 나머지는 -80°C에 보관했습니다.
얻은 엑소좀을 탄소 지지막 구리 망에 떨어뜨리고 2% 포스포텅스틱산을 첨가했습니다. 시료를 TEM으로 관찰하고 최적 이미지를 수집 분석했습니다.
PBS 내 불순물과 입자를 0.22-μm 마이크로포어 필터로 제거했습니다. 엑소좀 입자 밀도에 따라 여과된 PBS를 적절한 농도로 희석하여 나노사이트 NS300 나노입자 검출기(말번, 웨스트버러, MA, 미국)로 검출했습니다.
확인 후, miR-326 억제제와 miR-326 억제제 음성대조군(NC), miR-326 모방체와 miR-326 모방체 NC로 형질주입된 대식세포 유래 엑소좀을 엑소좀 분리 키트(인비트로젠)로 추출했습니다.
총 RNA를 트라이졸 시약(써모 피셔)으로 추출하고, SYBR-Green PCR 마스터 믹스(로슈)와 ABI 7500 실시간 PCR 시스템(라이프 테크놀로지스, 그랜드 아일랜드, NY, 미국)으로 실시간 PCR을 수행했습니다. 프라이머 서열은 표 1에 나타냈습니다. 정량 분석은 2^(-ΔΔCt) 법으로 수행했습니다.
세포와 엑소좀의 총 단백질을 추출했습니다. 단백질 농도는 비시니코닌산(BCA) 키트(보스터 바이오테크놀로지, 우한, 후베이, 중국)로 측정했습니다. 단백질에 시료 완충액을 첨가하고 95°C에서 끓인 후, 각 웰에 30 µg씩 로딩했습니다. 10% 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동(보스터 바이오테크놀로지)으로 단백질을 분리하고 폴리비닐리덴 플루오라이드 막으로 전이시킨 후, 5% 우혈청알부민(BSA)으로 차단했습니다. 막을 CD63(1:1000, 발달연구 하이브리도마 뱅크, 아이오와대, 에임스, IA, 미국), CD181(1:1000, R&D Systems), GAPDH(1:2000, 잭슨 면역연구소, PA, 미국) 일차항체와 과산화효소 표지 이차항체(1:500, 잭슨 면역연구소)로 반응시켰습니다. 이미지는 오디세이 이중 컬러 적외선 형광 스캐닝 이미징 시스템으로 얻었고, 밴드 회색값은 Quantity One 이미지 분석 소프트웨어로 측정했습니다.
정상 간세포주 HL-7702와 인간 HCC 세포주 BEL-7404, HepG2, SMMC-7721, QGY-7703을 선별하여 깁코 RPMI 미디어 1640에 10% FBS, 페니실린(100 U/mL), 스트렙토마이신(100 mg/mL)을 첨가해 배양했습니다. RT-qPCR로 miR-326 발현을 검출하고 적합한 세포주를 선별했습니다.
엑소좀을 250 μL 희석액 C에 재현탁하고 엑소좀 막 손상을 피하며 부드럽게 혼합했습니다. PKH67 염료(1 μL, 시그마-알드리치)를 250 μL 희석액 C에 첨가해 500 μL로 만들고 배양했습니다. 용액에 500 μL 1% BSA를 첨가하고 37°C에서 1분간 배양했습니다. 120,000g, 4°C, 2시간 원심분리로 엑소좀을 얻었습니다. PKH67 표지 엑소좀을 120,000g, 4°C, 2시간 원심분리로 얻었습니다. 엑소좀을 빛을 피해 6 mL RPMI-1640 배지에 재현탁했습니다. 표지된 엑소좀을 HCC 세포와 12시간 공동배양했습니다. 이후 배양액을 제거하고 PBS로 3회, 회당 5분간 세척하여 HCC 세포에 내부 흡수되지 않은 형광 표지 엑소좀을 완전히 제거했습니다. 4% 파라포름알데히드로 고정하고 4',6-디아미디노-2-페닐인돌로 염색했습니다. 봉입 후 레이저 공초점 현미경으로 형광 분포를 관찰했습니다.
HepG2 세포와 SMMC-7721 세포를 12웰 플레이트에 0.5~1 × 10⁶ cells/well 밀도로 파종했습니다. 50~60% 컨플루언시에서 리포펙타민 2000(인비트로젠, 칼스배드, CA)으로 형질주입했습니다. HepG2 세포를 miR-326-모방체 그룹(miR-326 모방체 형질주입)과 NC-모방체 그룹(miR-326 모방체 NC 형질주입)으로 나누었습니다. SMMC-7721 세포를 miR-326-억제제 그룹(miR-326 억제제 형질주입)과 NC-억제제 그룹(miR-326 억제제 NC 형질주입)으로 배정했습니다. miR-326-모방체, miR-326-억제제와 각 NC를 리포펙타민 2000과 혼합해 형질주입했습니다. 아무 처리도 하지 않은 HepG2와 SMMC-7721 세포를 대조군으로 설정했습니다. miR-326-모방체, miR-326-억제제와 각 NC는 광저우 RibBio Co., Ltd.(광저우, 중국)에서 설계 및 제조했습니다(표 1).
M1 대식세포 유래 엑소좀 현탁액의 단백질 농도를 BCA 법으로 측정하고, 50 μg 단백질에 해당하는 엑소좀 현탁액 부피를 계산했습니다. HepG2와 SMMC-7721 세포를 12웰 플레이트에 1 × 10⁵ cells/mL per well로 파종했습니다. HepG2 세포를 4개 그룹으로 나누었습니다: 대조군(HepG2 세포, 엑소좀과 공동배양 안 함), 엑소좀(Exo)군(HepG2 세포, M1 대식세포 유래 엑소좀과 공동배양), Exo-miR-326-모방체군(HepG2 세포, miR-326 모방체 형질주입된 M1 대식세포 유래 엑소좀과 공동배양), Exo-NC-모방체군(HepG2 세포, miR-326 모방체 NC 형질주입된 M1 대식세포 유래 엑소좀과 공동배양). SMMC-7721 세포도 4개 그룹으로 배정했습니다: 대조군(SMMC-7721 세포, 엑소좀과 공동배양 안 함), Exo군(SMMC-7721 세포, M1 대식세포 유래 엑소좀과 공동배양), Exo-miR-326-억제제군(SMMC-7721 세포, miR-326 억제제 형질주입된 M1 대식세포 유래 엑소좀과 공동배양), Exo-NC-억제제군(SMMC-7721 세포, miR-326 억제제 NC 형질주입된 M1 대식세포 유래 엑소좀과 공동배양).
세포를 트립신으로 분리하여 96웰 플레이트에 웰당 4 × 10⁴ 세포 밀도로 파종했습니다. 12, 24, 36, 48, 60시간 배양 후 배양액을 제거했습니다. 500 μL 0.5 g/L MTT 용액으로 배양하고 200 μL 디메틸설폭사이드 용액을 첨가해 혼합 배양했습니다. 마이크로플레이트 리더로 광학밀도(OD, 490 nm) 값을 측정했습니다.
24시간 배양 후 트립신으로 분리하여 35 mm 소형 접시에 접시당 300 세포를 파종했습니다. 배양액을 3일마다 교체했습니다. 10일 배양 후 40 g/L 파라포름알데히드로 고정하고 1 g/L 크리스탈 바이올렛 용액으로 염색 후 건조했습니다. 현미경으로 집락 수(50개 이상 세포)를 계수했습니다.
세포(1 × 10⁵)를 200 μL 무혈청 배양액에 현탁했습니다. 트랜스웰 챔버(코닝 글라스 웍스, 코닝, NY, 미국) 지침에 따라 실험했습니다(침윤 실험에는 매트리겔 필요, 이동 실험에는 불필요). 하부 챔버에 RPMI 1640(10% FBS, 600 μL)을 첨가했습니다. 상하 챔버를 매트리겔로 미리 코팅된 트랜스웰 막(BD 바이오사이언스, 프랭클린 레이크스, NJ, 미국)으로 분리했습니다. 24시간 배양 후 95% 알코올로 고정했습니다. 크리스탈 바이올렛 용액으로 염색 후 현미경 5개 시야에서 세포를 관찰했습니다.
세포주기: 세포를 트립신으로 분리. 세포(1 × 10⁶)를 0.5 mL PBS에 현탁해 단일 현탁액으로 만들었습니다. 얼음 위에서 4.5 mL 미리 냉각된 70% 에탄올과 혼합하고 3000g에서 원심분리, 5 mL PBS로 세척 후 다시 3000g 원심분리. 이후 1 mL PI/트리톤 X-100 염색액(20 μg PI/0.1% 트리톤 X-100, 0.2 mg RnaseA 함유)에 현탁. 유세포분석기로 세포주기 검출.
세포자멸사: 트립신 처리된 세포(1 × 10⁶)를 1 mL PBS에 현탁해 혼합 원심분리(3000g). 배양 완충액(10 mmol/L Hepes/NaOH, pH 7.4, 140 mmol/L NaCl, 5 mmol/L CaCl₂)으로 순차 세척 후 3000g 원심분리. 다음 100 μL 표지 용액(FITC-Annexin V와 PI를 배양 완충액에 첨가해 1 μg/mL 도달)에 배양, 3000g 원심분리, 배양 완충액으로 1회 세척, 형광(SA-FLOUS) 용액과 배양. 유세포분석기로 세포자멸사 검출. 유세포분석기 파장 488 nm, FITC 형광은 515 nm 대역필터로, PI는 560 nm 이상 파장에서 검출. 결과는 컴퓨터로 자동 분석.
4~6주령 마우스 40마리(지린대학교 동물과학대학, 지린, 중국)를 무작위 8개 그룹으로 나누어 그룹당 5마리씩 배정했습니다. 마우스를 SPF 등급 동물 실험실에서 1주일 사육하며 사료, 깔개, 물병을 제때 교체했습니다. 마우스 건강 상태를 매일 관찰했습니다. 1주일 후 HCC 세포를 세포 현탁액으로 제조해 0.1 mL 세포 현탁액(1 × 10⁶)을 목과 등에 피하 주사했습니다. 3~5일 후 종양 성장을 관찰했습니다. 누드 마우스를 4일마다 체중 측정하고 종양 부피 측정. 주사 후 20일째 마우스를 안락사시켰습니다.
모든 데이터는 SPSS 17.0 소프트웨어(SPSS Statistics, 시카고, IL, 미국)로 분석했습니다. 측정 데이터는 평균 ± 표준편차로 표시. 두 그룹 간 비교는 t-검정, 다중 그룹 간 비교는 일원분산분석(ANOVA)으로 수행. P값 < 0.05를 통계적으로 유의한 차이로 판단했습니다.
라이트 염색으로 PMA 유도 THP-1 세포 형태를 관찰했습니다. 유도 전 THP-1 세포는 크기가 작고 핵질 비율이 높았으며, 유도 후 세포 형태가 불규칙해지고 크기가 커지며 핵질 비율이 감소했습니다. 세포질이 풍부해지고 연한 파란색을 띠며 풍부한 입자와 소수의 소포가 관찰되었고, 핵은 자홍색을 띠며 종종 한쪽으로 치우쳐 있어 대식세포의 전형적 형태적 특징을 보였습니다(그림 1a).
M1 대식세포 및 엑소좀 확인. a PMA 처리 전후 THP-1 세포 형태 관찰을 위한 라이트 염색. b RT-qPCR로 검출한 THP-1 세포와 PMA 처리 THP-1 세포의 CD68, CD206 발현. c 대식세포와 M1 대식세포 형태. d RT-qPCR로 검출한 M0 대식세포와 LPS 및 IFN-γ 처리 M0 대식세포의 IDO1, IL-12 p35 발현. e 엑소좀 관찰용 TEM. f NTA로 검출한 엑소좀 입자 크기 분포. g CD63, CD181 단백질 밴드. 패널 b에서 *P < 0.05 vs THP-1 세포; 패널 d에서 *P < 0.05 vs M0 대식세포. 측정 데이터는 평균 ± 표준편차(N = 3)로 표시, 두 그룹 간 비교는 t-검정 수행.
대식세포 유도 성공을 추가 검증하기 위해 유도 전후 CD68, CD206 발현을 RT-qPCR로 검사했습니다. PMA 유도 후 CD68, CD206 발현이 상승하여 PMA가 THP-1 세포를 M0 대식세포로 성공적으로 유도했음을 나타냅니다(그림 1b). 이후 LPS와 IFN-γ로 M0 대식세포를 M1 대식세포로 분화 유도했습니다. 대식세포 형태와 M1형 대식세포 표면 표지자 IDO1, IL-12 p35 발현을 관찰 및 검사했습니다. M0 대식세포는 다양한 불규칙 부착 형태(원형, 타원형, 방추형)를 보였습니다. IFN-γ 자극 대식세포는 더 많은 가성족과 돌기, 방추형 형태를 보였습니다(그림 1c). RT-qPCR 결과(그림 1d) LPS와 IFN-γ 처리 후 M1 대식세포 표지자(IDO1, IL-12p35)가 증가했습니다.
이후 대식세포 유래 엑소좀을 TEM으로 관찰했습니다. 대식세포 유래 엑소좀이 풍부하고 원형 또는 타원형, 막 구조, 균일한 크기, 적은 오염물질을 보였습니다(그림 1e). NTA에서 MODE 곡선의 집중된 피크와 매끄러운 선형으로 더 집중된 직경과 적은 불순물을 보였습니다(그림 1f). 웨스턴 블롯 분석에서 대식세포 대비 엑소좀에서 특이 표지자 단백질 CD63, CD181 발현이 증가했습니다(그림 1g). 이 결과들은 단구가 대식세포로 분화되고 M1 대식세포로 분극화되었음을 입증합니다.
M1 대식세포 유래 엑소좀이 miR-326을 HCC 세포로 수송하는지 검증하기 위해 HepG2, SMMC-7721 세포를 엑소좀과 공동배양했습니다. 형광현미경에서 4시간 형질주입 후 다량의 엑소좀이 HepG2, SMMC-7721 세포에 동화됨을 확인했습니다(그림 2a, b).
M1 대식세포 유래 엑소좀이 miR-326을 HCC 세포로 전달하여 HCC 세포 내 miR-326 발현에 영향. a HepG2 세포에 의한 M1 대식세포 유래 엑소좀 섭취. b SMMC-7721 세포에 의한 M1 대식세포 유래 엑소좀 섭취. c IFN-γ 및 LPS 유도 전후 각 그룹 대식세포 엑소좀 miR-326 발현 비교. d RT-qPCR로 검출한 HCC 세포주(BEL-7404, HepG2, SMMC-7721, QGY-7703)와 정상 간세포주 HL-7702의 miR-326 발현. e RT-qPCR로 검출한 miR-326 모방체가 HepG2 세포 miR-326 발현에 미치는 영향. f RT-qPCR로 검출한 miR-326 억제제가 SMMC-7721 세포 miR-326 발현에 미치는 영향. g RT-qPCR로 검출한 miR-326 모방체 형질주입 M1 대식세포 유래 엑소좀이 HepG2 세포 miR-326 발현에 미치는 영향. h RT-qPCR로 검출한 miR-326 억제제 형질주입 M1 대식세포 유래 엑소좀이 SMMC-7721 세포 miR-326 발현에 미치는 영향. 패널 c에서 *P < 0.05 vs M0 대식세포; 패널 d에서 *P < 0.05 vs HL-7702 세포; 패널 e에서 *P < 0.05 vs NC-모방체 그룹; 패널 f에서 *P < 0.05 vs NC-억제제 그룹; 패널 g에서 *P < 0.05 vs 대조군, #P < 0.05 vs Exo-NC-모방체 그룹; 패널 h에서 *P < 0.05 vs 대조군, #P < 0.05 vs Exo-NC-억제제 그룹. 측정 데이터는 평균 ± 표준편차(N = 3)로 표시, 다중 그룹 비교는 일원분산분석 수행.
이후 miR-326 모방체/억제제를 대식세포에 형질주입하고 형질주입 전후 엑소좀 내 miR-326 발현을 확인했습니다. M0 대식세포 유래 엑소좀 대비 M1 대식세포 유래 엑소좀에서 miR-326 발현이 증가했습니다. miR-326 모방체 처리 M1 대식세포 유래 엑소좀에서 miR-326 발현이 더 증가했고, miR-326 억제제 처리 시 감소했습니다(그림 2c).
HCC 세포주 내 miR-326 발현을 검사했습니다. BEL-7404, HepG2, SMMC-7721, QGY-7703 세포에서 HL-7702 세포 대비 miR-326 발현이 감소했으며, 그중 HepG2 세포에서 가장 낮고 SMMC-7721 세포에서 가장 높았습니다(그림 2d).
이후 miR-326 모방체와 억제제를 각각 HepG2, SMMC-7721 세포에 형질주입하고 miR-326 발현에 미치는 영향을 검사했습니다. miR-326 모방체는 HepG2 세포에서 miR-326 발현을 증가시켰고, miR-326 억제제는 SMMC-7721 세포에서 감소시켰습니다(그림 2e, f).
다음으로 miR-326 모방체와 억제제로 형질주입된 M1 대식세포 유래 엑소좀을 각각 HepG2, SMMC-7721 세포와 공동배양했습니다. 엑소좀 공동배양으로 HCC 세포 내 miR-326 발현이 증가했고, miR-326 모방체 형질주입 M1 대식세포 유래 엑소좀은 HepG2 세포에서 miR-326 발현을 더 증가시켰으며, miR-326 억제제 형질주입 M1 대식세포 유래 엑소좀은 SMMC-7721 세포에서 miR-326 발현을 감소시켰습니다(그림 2g, h). M1 대식세포 유래 엑소좀이 miR-326을 HCC 세포로 전달하여 HCC 세포 내 miR-326 발현에 영향을 미침이 시사됩니다.
엑소좀 miR-326이 HCC 세포 증식에 미치는 영향을 탐구하기 위해 MTT와 집락 형성 분석으로 HCC 세포 증식을 검사했습니다. HepG2 세포에서 miR-326 복원이 세포 증식과 집락 형성 능력을 손상시켰습니다(그림 3a, e, f). M1 대식세포 유래 엑소좀은 HepG2 세포 증식과 집락 형성을 방해했습니다. miR-326 모방체 형질주입 M1 대식세포 유래 엑소좀은 세포 증식과 집락 형성 능력을 더 손상시켰습니다(그림 3c, i, j).
M1 대식세포 엑소좀 miR-326이 HCC 세포 증식과 집락 형성을 억제. a MTT 분석으로 miR-326 모방체 형질주입이 HepG2 세포 증식에 미치는 영향 검출. b MTT 분석으로 miR-326 억제제 형질주입이 SMMC-7721 세포 증식에 미치는 영향 검출. c MTT 분석으로 miR-326 모방체 형질주입 M1 대식세포 유래 엑소좀 공동배양이 HepG2 세포 증식에 미치는 영향 검출. d MTT 분석으로 miR-326 억제제 형질주입 M1 대식세포 유래 엑소좀 공동배양이 SMMC-7721 세포 증식에 미치는 영향 검출. e 집락 형성 분석으로 miR-326 모방체 형질주입이 HepG2 세포 집락 형성 능력에 미치는 영향 검출. f HepG2 세포 집락 수. g 집락 형성 분석으로 miR-326 억제제 형질주입이 SMMC-7721 세포 집락 형성 능력에 미치는 영향 검출. h SMMC-7721 세포 집락 수. i 집락 형성 분석으로 miR-326 모방체 형질주입 M1 대식세포 유래 엑소좀 공동배양이 HepG2 세포 집락 형성 능력에 미치는 영향 검출. j 엑소좀 처리 HepG2 세포 집락 수. k 집락 형성 분석으로 miR-326 억제제 형질주입 M1 대식세포 유래 엑소좀 공동배양이 SMMC-7721 세포 집락 형성 능력에 미치는 영향 검출. l 엑소좀 처리 SMMC-7721 세포 집락 수. 패널 a, f에서 *P < 0.05 vs NC-모방체 그룹; 패널 b, h에서 *P < 0.05 vs NC-억제제 그룹; 패널 c, j에서 *P < 0.05 vs 대조군, #P < 0.05 vs Exo-NC-모방체 그룹; 패널 d, l에서 *P < 0.05 vs 대조군, #P < 0.05 vs Exo-NC-억제제 그룹. 측정 데이터는 평균 ± 표준편차(N = 3)로 표시, 다중 그룹 비교는 일원분산분석 수행.
SMMC-7721 세포에서 miR-326 녹다운은 세포 증식과 집락 형성 능력을 증가시켰습니다(그림 3b, g, h). M1 대식세포 유래 엑소좀 처리 SMMC-7721 세포에서 세포 증식과 집락 형성 능력이 감소했습니다. miR-326 억제제 형질주입 M1 대식세포 유래 엑소좀은 세포 증식과 집락 형성 능력을 더 증가시켰습니다(그림 3d, k, l). M1 대식세포 유래 엑소좀 miR-326이 HCC 세포 증식을 저해함이 시사됩니다.
엑소좀 miR-326이 HCC 세포 침윤과 이동에 미치는 영향을 검사했습니다. HepG2 세포에서 miR-326 복원이 침윤과 이동을 제한했습니다(그림 4a-c). M1 대식세포 유래 엑소좀은 HepG2 세포 침윤과 이동을 방해했습니다. miR-326 모방체 형질주입 M1 대식세포 유래 엑소좀과 공동배양 시 침윤과 이동이 더 감소했습니다(그림 4g-i).
M1 대식세포 엑소좀 miR-326이 HCC 세포 이동과 침윤을 억제. a 트랜스웰 분석으로 miR-326 모방체 형질주입이 HepG2 세포 침윤에 미치는 영향 검출. b 트랜스웰 분석으로 miR-326 모방체 형질주입이 HepG2 세포 이동에 미치는 영향 검출. c HepG2 세포 침윤 및 이동 세포 수. d 트랜스웰 분석으로 miR-326 억제제 형질주입이 SMMC-7721 세포 침윤에 미치는 영향 검출. e 트랜스웰 분석으로 miR-326 억제제 형질주입이 SMMC-7721 세포 이동에 미치는 영향 검출. f SMMC-7721 세포 침윤 및 이동 세포 수. g 트랜스웰 분석으로 miR-326 모방체 형질주입 M1 대식세포 유래 엑소좀 공동배양이 HepG2 세포 침윤에 미치는 영향 검출. h 트랜스웰 분석으로 miR-326 모방체 형질주입 M1 대식세포 유래 엑소좀 공동배양이 HepG2 세포 이동에 미치는 영향 검출. i M1 대식세포 유래 엑소좀 공동배양 HepG2 세포 침윤 및 이동 세포 수. j 트랜스웰 분석으로 miR-326 억제제 형질주입 M1 대식세포 유래 엑소좀 공동배양이 SMMC-7721 세포 침윤에 미치는 영향 검출. k 트랜스웰 분석으로 miR-326 억제제 형질주입 M1 대식세포 유래 엑소좀 공동배양이 SMMC-7721 세포 이동에 미치는 영향 검출. l M1 대식세포 유래 엑소좀 공동배양 SMMC-7721 세포 침윤 및 이동 세포 수. 패널 c에서 *P < 0.05 vs NC-모방체 그룹; 패널 f에서 *P < 0.05 vs NC-억제제 그룹; 패널 i에서 *P < 0.05 vs 대조군, #P < 0.05 vs Exo-NC-모방체 그룹; 패널 l에서 *P < 0.05 vs 대조군, #P < 0.05 vs Exo-NC-억제제 그룹. 측정 데이터는 평균 ± 표준편차(N = 3)로 표시, 다중 그룹 비교는 일원분산분석 수행.
miR-326 녹다운은 SMMC-7721 세포 침윤과 이동을 증가시켰습니다(그림 4d-f). M1 대식세포 유래 엑소좀 처리 시 SMMC-7721 세포 침윤과 이동이 감소했습니다. 그러나 miR-326 억제제 형질주입 M1 대식세포 유래 엑소좀 공동배양 시 SMMC-7721 세포 침윤과 이동이 증가했습니다(그림 4j-l). M1 대식세포 엑소좀 miR-326이 HCC 세포 침윤과 이동을 저해함이 시사됩니다.
엑소좀 miR-326이 HCC 세포 세포주기와 세포자멸사에 미치는 영향을 검사하기 위해 PI 단일 염색과 Annexin V-FITC/PI 이중 염색을 적용했습니다. miR-326 과발현은 HepG2 세포에서 G0/G1기 정지 세포 증가, S기 및 G2/M기 정지 세포 감소, 세포자멸사 증가를 유도했습니다(그림 5a-d). M1 대식세포 유래 엑소좀 공동배양 시 HepG2 세포에서 G0/G1기 정지 세포 증가, S기 및 G2/M기 정지 세포 감소, 세포자멸사 증가가 나타났습니다. miR-326 모방체 형질주입 M1 대식세포 유래 엑소좀 공동배양 시 이 효과가 더 강화되었습니다(그림 5i-l).
M1 대식세포 엑소좀 miR-326이 HCC 세포 세포자멸사 촉진. a, b 유세포분석으로 miR-326 모방체 형질주입이 HepG2 세포주기에 미치는 영향 검출; c, d 유세포분석으로 miR-326 모방체 형질주입이 HepG2 세포자멸사에 미치는 영향 검출; e, f 유세포분석으로 miR-326 억제제 형질주입이 SMMC-7721 세포주기에 미치는 영향 검출; g, h 유세포분석으로 miR-326 억제제 형질주입이 SMMC-7721 세포자멸사에 미치는 영향 검출; i, j 유세포분석으로 miR-326 모방체 형질주입 M1 대식세포 유래 엑소좀 공동배양이 HepG2 세포주기에 미치는 영향 검출; k, l 유세포분석으로 miR-326 모방체 형질주입 M1 대식세포 유래 엑소좀 공동배양이 HepG2 세포자멸사에 미치는 영향 검출; m, n 유세포분석으로 miR-326 억제제 형질주입 M1 대식세포 유래 엑소좀 공동배양이 SMMC-7721 세포주기에 미치는 영향 검출; o, p 유세포분석으로 miR-326 억제제 형질주입 M1 대식세포 유래 엑소좀 공동배양이 SMMC-7721 세포자멸사에 미치는 영향 검출. 패널 b, d에서 *P < 0.05 vs NC-모방체 그룹; 패널 f, h에서 *P < 0.05 vs NC-억제제 그룹; 패널 j, l에서 *P < 0.05 vs 대조군, #P < 0.05 vs Exo-NC-모방체 그룹; 패널 n, p에서 *P < 0.05 vs 대조군, #P < 0.05 vs Exo-NC-억제제 그룹. 측정 데이터는 평균 ± 표준편차(N = 3)로 표시, 다중 그룹 비교는 일원분산분석 수행.
SMMC-7721 세포에서 miR-326 저하조절은 G0/G1기 정지 세포 감소, S기 및 G2/M기 정지 세포 증가, 세포자멸사 감소를 유도했습니다(그림 5e-h). 미형질주입 M1 대식세포 유래 엑소좀은 G0/G1기 정지 세포 증가, S기 및 G2/M기 정지 세포 감소, 세포자멸사 증가를 유도했습니다. miR-326 억제제 형질주입 M1 대식세포 유래 엑소좀은 G0/G1기 정지 세포 감소, S기 및 G2/M기 정지 세포 증가, 세포자멸사 감소를 유도했습니다(그림 5m-p). 요약하면 M1 대식세포 엑소좀 miR-326이 HCC 세포주기를 G0/G1기에 정지시키고 세포자멸사를 유도함이 확인되었습니다.
M1 대식세포 엑소좀 miR-326이 HCC 세포 생물학적 진행에 미치는 잠재적 기전을 탐구했습니다. NF-κB는 염증과 암의 핵심 연결고리입니다. 많은 조절 단백질과 miRNA가 과활성화된 NF-κB 신호전달을 억제해 암을 억제할 수 있습니다[16]. 이러한 유익한 효과에는 M2 대식세포의 M1 대식세포로의 분극화도 포함될 수 있습니다. HepG2, SMMC-7721 세포의 CD206, NF-κB 발현을 RT-qPCR로 검사했습니다. miR-326 복원은 HepG2 세포에서 CD206, NF-κB 발현을 감소시켰고, miR-326 녹다운은 SMMC-7721 세포에서 CD206, NF-κB 발현을 증가시켰습니다(그림 6a, b). 또한 M1 대식세포 엑소좀 공동배양 시 HepG2 세포에서 CD206, NF-κB 발현이 유의하게 감소했으며, miR-326 과발현 M1 대식세포 엑소좀 공동배양 시 더 감소했습니다. 미형질주입 M1 대식세포 유래 엑소좀 처리 시 SMMC-7721 세포에서 CD206, NF-κB 발현이 감소했습니다. miR-326 억제제 형질주입 M1 대식세포 유래 엑소좀 공동배양 시 SMMC-7721 세포에서 CD206, NF-κB 발현이 증가했습니다(그림 6c, d). M1 대식세포 엑소좀 miR-326이 HCC 세포에서 NF-κB를 억제함으로써 종양 억제 역할을 함이 결론지어졌습니다.
M1 대식세포 엑소좀 miR-326이 HCC 세포 CD206, NF-κB 발현 감소. a RT-qPCR로 miR-326 모방체 형질주입이 HepG2 세포 CD206, NF-κB 발현에 미치는 영향 검출; b RT-qPCR로 miR-326 억제제 형질주입이 SMMC-7721 세포 CD206, NF-κB 발현에 미치는 영향 검출. c RT-qPCR로 miR-326 모방체 형질주입 M1 대식세포 유래 엑소좀 공동배양이 HepG2 세포 CD206, NF-κB 발현에 미치는 영향 검출; d RT-qPCR로 miR-326 억제제 형질주입 M1 대식세포 유래 엑소좀 공동배양이 SMMC-7721 세포 CD206, NF-κB 발현에 미치는 영향 검출. 패널 a에서 *P < 0.05 vs NC-모방체 그룹; 패널 b에서 *P < 0.05 vs NC-억제제 그룹; 패널 c에서 *P < 0.05 vs 대조군, #P < 0.05 vs Exo-NC-모방체 그룹; 패널 d에서 *P < 0.05 vs 대조군, #P < 0.05 vs Exo-NC-억제제 그룹. 측정 데이터는 평균 ± 표준편차(N = 3)로 표시, 다중 그룹 비교는 일원분산분석 수행.
종양 이종이식으로 체내 결과를 검증했습니다. miR-326 과발현은 HepG2 세포에서 종양 부피와 무게를 감소시켰습니다(그림 7a-c). HepG2 세포를 엑소좀과 공동배양 이식한 마우스에서 M1 대식세포 엑소좀 처리가 HepG2 세포 종양 부피와 무게를 유의하게 감소시켰으며, miR-326 과발현 M1 대식세포 엑소좀 처리가 더 감소시켰습니다(그림 7g-i).
M1 대식세포 엑소좀 miR-326이 생체 내 HCC 종양 부피와 무게 감소. a-c miR-326 모방체 형질주입이 HepG2 세포 이종이식 누드 마우스 종양 부피와 종양에 미치는 영향. d-f miR-326 억제제 형질주입이 SMMC-7721 세포 이종이식 누드 마우스 종양 부피와 종양에 미치는 영향. g-i miR-326 모방체 형질주입 M1 대식세포 유래 엑소좀 공동배양이 HepG2 세포 이종이식 누드 마우스 종양 부피와 종양에 미치는 영향. j-l miR-326 억제제 형질주입 M1 대식세포 유래 엑소좀 공동배양이 SMMC-7721 세포 이종이식 누드 마우스 종양 부피와 종양에 미치는 영향. 패널 b, c에서 *P < 0.05 vs NC-모방체 그룹; 패널 e, f에서 *P < 0.05 vs NC-억제제 그룹; 패널 h, i에서 *P < 0.05 vs 대조군, #P < 0.05 vs Exo-NC-모방체 그룹; 패널 k, l에서 *P < 0.05 vs 대조군, #P < 0.05 vs Exo-NC-억제제 그룹. 측정 데이터는 평균 ± 표준편차(n = 5)로 표시, 다중 그룹 비교는 일원분산분석 수행.
SMMC-7721 세포에서 miR-326 억제는 종양 부피와 무게를 증가시켰습니다(그림 7d-f). 미형질주입 M1 대식세포 유래 엑소좀은 SMMC-7721 세포 종양 성장을 부피와 무게 측면에서 억제했습니다. miR-326 억제제 형질주입 M1 대식세포 유래 엑소좀 공동배양 SMMC-7721 세포를 마우스에 주입 시 종양 부피와 무게가 증가했습니다(그림 7j-l). 요약하면 M1 대식세포 엑소좀 miR-326이 생체 내 HCC 종양 성장을 억제함이 확인되었습니다.
HCC는 높은 이환율과 사망률, 어려운 조기 진단과 치료, 나쁜 예후와 5년 생존율을 특징으로 하는 흔한 암입니다[17]. 최근 연구에서 낮게 발현되는 lncRNA cox-2가 M1 대식세포의 HCC 세포 성장, 침습성, 혈관신생, 이동 억제 및 세포자멸사 촉진 능력을 감소시킴이 강조되었습니다[18]. Hu 등은 miR-326이 HCC 조직과 세포주에서 명백히 감소하며, 저하된 miR-326이 HCC 환자의 TNM 병기, 림프절 전이, 분화와 연관됨을 논의했습니다[14]. HCC 세포 유래 엑소좀이 HCC 세포 성장, 침습성, 전이 및 약물 저항성 발달을 촉진하는 유리한 환경을 형성한다는 것이 통상적으로 고려됩니다[19]. 본 연구는 엑소좀 miR-326이 HCC 세포 침윤과 이동을 조절하는 기전을 탐구하기 위해 설계되었습니다.
우리 결과는 miR-326 발현이 HCC 세포에서 감소하지만 엑소좀에서는 증가함을 나타냈습니다. 최근 연구에서 miR-326 발현이 HCC 조직에서 감소함이 지적되었습니다[20]. 또 다른 연구에서 miR-326 발현이 HCC 세포주와 조직에서 현저히 감소하며, 그 저하가 HCC에서 나쁜 예후를 예측함이 제시되었습니다[13]. miR-326이 종양 억제 역할을 하며 HCC 세포에서 크게 억제된다는 보고가 있습니다[21]. 앞서 언급한 모든 증거가 우리 발견과 일치합니다. 한 연구에서 대조군 대비 재발-완화 다발성 경화증 환자에서 Tconv 유래 엑소좀 내 miR-326 발현이 증가함이 주장되었습니다[11].
우리 데이터에서 높은 발현의 엑소좀 miR-326이 체외에서 HCC 세포 증식, 집락 형성, 이동, 침윤을 감소시키고 세포자멸사를 촉진했으며, 체내에서 HCC 종양 부피와 무게를 감소시킴이 나타났습니다. 이전 연구에서 miR-326 과발현으로 HCC 세포 성장이 억제될 수 있고, miR-326 상승으로 HCC 세포 이동과 침윤 능력이 현저히 감쇠됨이 제안되었습니다[21]. miR-326 과발현이 체외에서 HCC 세포 성장과 침습성을 억제하고 세포자멸사를 자극함이 보고되었습니다[14]. 또한 이전 연구에서 miR-326 과발현이 체내 종양 성장을 감소시킴이 검증되었습니다[13]. 한 연구에서 이소성 발현 miR-326이 비소세포폐암 세포주에서 세포 성장을 현저히 감쇠시키고 세포 이동과 침습성을 억제함이 밝혀졌습니다[22]. 또한 miR-326이 MMP-9 같은 섬유화 촉진 유전자를 감소시켜 암세포 증식에서 억제적 기능이 있음을 시사합니다[23]. 또한 miR-326이 Bcl-2 단백질 발현을 억제하고 Bax 발현을 증가시켜 세포자멸사에 영향을 미침이 제시되었습니다[24]. 우리 발견과 유사하게 일부 miRNA가 엑소좀과 상호작용해 HCC 발달에 역할을 합니다. 높은 발현 엑소좀 miR-638이 발암과정의 잠재적 영향을 포함해 HCC 세포 증식을 억제함이 나타났습니다[25]. 또 다른 연구에서 HCC 세포 유래 엑소좀 miR-451a가 내피세포 기능(세포자멸사, 관 형성, 이동, 투과성)을 교란시켜 종양 혈관신생을 억제함이 입증되었습니다[26]. 이전 연구에서 일반적으로 miR-744 엑소좀 과발현 처리 시 HCC 세포 증식이 현저히 억제됨이 확인되었습니다[27].
요약하자면, 본 연구는 M1 대식세포 유래 엑소좀 miR-326이 HCC 세포 증식, 이동, 침윤을 억제하고 세포자멸사를 촉진함을 입증하며, HCC에 대한 새로운 표적 치료 표적에 대한 새로운 통찰을 제공합니다. 제한된 샘플 크기와 제한된 기존 연구로 인해 miR-326의 정확한 기전은 완전히 규명되지 않았으므로, 기저 기전을 규명하기 위한 추가적인 대규모 연구가 필요합니다.
나노물질
초록 마찰전기 효과 기반 에너지 하베스팅 소자는 다른 나노발전기에 비해 높은 출력 성능으로 큰 주목을 받아 웨어러블 응용에 다양하게 활용되어 왔습니다. 작동 메커니즘에 기반해 마찰전기 성능은 주로 마찰전기 소재 표면 전하 밀도에 비례합니다. 표면 작용기 변형과 마찰전기 소재 유전체 조성 변형 등 다양한 접근법으로 표면 전하 밀도를 높여 마찰전기 성능을 개선해 왔습니다. 특히 마찰전기 소재 유전적 특성 조절은 표면 전하가 마찰전기 소재 유전율에 비례하므로 표면 전하 밀도를 크게 증가시킬 수 있습니다. 상대 유전율은 전자, 진동(원자)
요약 비소세포폐암(NSCLC)은 전 세계에서 두 번째로 많이 진단되는 악성 종양입니다. 암 치료 전략 개발을 위한 나노물질 연구의 일환으로, 본 연구에서는 우수한 시너지 광열/광역학 특성을 가진 새로운 CoFe₂O₄ 양자점(QDs)을 구축했습니다. 이 나노물질은 명백한 독성 없이 NSCLC를 효율적으로 억제했습니다. CoFe₂O₄-QDs와 근적외선(NIR) 조사 병용이 NSCLC 세포의 세포사멸을 유도함을 보였습니다. 또한 이 병용 치료가 PI3K/AKT 경로 조절을 통해 활성산소종(ROS) 생성을 촉진해 세포사를 유발함을 확인했습
