종양 특이적 억제제의 전달은 암 치료의 과제입니다. 항체 변형 나노입자는 특정 종양 관련 항원을 과발현하는 종양 세포에 탑재 약물을 전달할 수 있습니다. 여기서는 간세포암에서 과발현되는 막단백질인 글리피칸-3(GPC3)에 대한 항체 hGC33으로 변형된 소라페닙 탑재 폴리에틸렌글라이콜-b-PLGA 폴리머 나노입자를 제조했습니다. hGC33 변형 NPs(hGC33-SFB-NP)가 HCC 세포 표면의 GPC3에 특이적으로 결합하여 GPC3 양성 HCC 세포를 표적화하고, Wnt 유도 신호전달을 억제하며, 사이클린 D1 발현 저하로 HCC 세포를 G0/G1기에 정지시켜 상피-중간엽 전이 억제로 HCC 세포 이동을 감쇠시킴을 확인했습니다. hGC33-SFB-NP는 GPC3 분자와 함께 Wnt 경로와 Ras/Raf/MAPK 경로를 각각 억제함으로써 HCC 세포 이동, 세포주기 진행, 증식을 억제했습니다. hGC33-SFB-NP는 생체 내 간암 성장을 억제하고 종양 보유 마우스의 생존율을 개선했습니다. hGC33이 SFB-NP의 HCC 세포 표적화를 증가시킴을 결론지었습니다. hGC33-SFB-NP는 Wnt 경로와 Ras/Raf/MAPK 경로를 차단함으로써 HCC 진행을 시너지적으로 억제합니다.
글리피칸3(GPC3)은 글리세로포스파티딜이노시톨 앵커를 통한 메커니즘으로 세포 표면에 발현되는 헤파란 황산 프로테오글리칸입니다[1]. GPC3은 발달 과정에서 다양한 조직에서 발현되지만, 대부분의 성인 조직에서는 프로모터 영역의 DNA 메틸화에 의해 발현이 적어도 부분적으로 억제됩니다[2]. 그러나 GPC3 단백질은 간세포암(HCC) 환자의 약 70%에서 과발현되며[3, 4], Wnt 리간드와의 상호작용을 통해 고전적 Wnt 신호전달을 자극합니다[5]. 이는 Wnt/프리즐드 결합을 촉진하여 HCC 성장을 증진시킵니다[6]. 고전적 Wnt 신호전달 경로 활성화는 HCC 악성 전환과 관련된 가장 빈번한 사건 중 하나입니다[7, 8]. GPC3의 Wnt 신호전달 증진 능력을 바탕으로 GPC3 과발현이 고전적 Wnt 경로 자극을 통해 HCC 성장을 촉진한다고 가설화했습니다.
GPC3의 C-말단 부분(524-563)의 에피토프를 인식하는 치료용 단일클론항체 hGC33은 생쥐에서 HepG2와 Huh-7 피하 이종이식 종양 성장을 억제합니다[9, 10]. hGC33은 상보적 결정영역 이식으로 인성화되었으며, HepG2 이종이식에 대한 항암 효과가 hGC33과 동등하고, 임상시험에 사용되었습니다[11]. 이 결과들은 hGC33이 중요한 항종양 활성을 가지며, 항-GPC3 치료가 Wnt 및/또는 다른 신호전달 경로 차단을 통해 HCC 세포 증식 및/또는 생존을 직접 억제할 것임을 시사합니다.
그러나 HCC의 복잡한 병인기전으로 인해 GPC3 단독 차단의 효능은 제한적입니다[12]. 따라서 HCC 병인기전의 상세 기전 탐구와 진단 및 예후를 위한 유망한 바이오마커 발굴이 효과적 치료 표적 제공과 환자 예후 개선에 도움이 될 수 있습니다. 항-GPC3 항체가 HCC의 화학요법제 감수성을 증가시킬 수 있다는 제안이 있습니다[13]. hGC33과 표준 화학요법제의 병용 항종양 활성이 최근 평가되었습니다[14]. 소라페닙은 RAF/MEK/ERK 매개 세포신호전달 경로 차단으로 종양 세포 증식을 직접 억제하여 종양 성장을 억제하는 새로운 경구 표적 HCC 약물입니다[15, 16]. 그러나 소라페닙의 생체 내 비표적 분포와 HCC에서 비정상적으로 활성화된 Wnt 신호는 약물 효능을 제한하고 부작용을 증가시킵니다[14,15,16]. Wnt는 프리즐드 패밀리 수용체에 결합하여 세포 증식, 세포자멸사, 세포 이동을 조절하는 세포내 신호전달을 활성화하며, HCC 등 많은 종양에서 약물 저항성을 유발합니다[17,18,19].
HepG2 이종이식 모델에서 hGC33과 소라페닙 병용이 소라페닙 단독보다 종양 성장 억제에 더 효과적입니다[15]. 약물 전달에 폴리머 나노캐리어 사용이 암 치료에서 많은 주목을 받고 있습니다. 항암제 탑재 나노캐리어는 생체 내 비특이적 분포와 비특이적 분해를 방지하고, 약물 생체이용률과 항종양 표적성을 개선하며, 약동학 및 치료 평가를 단순화합니다[15, 16]. 다양한 폴리머 기반 나노입자 중 폴리(락틱코글라이콜릭애시드)(PLGA) 기반 제제가 이상적이고 안전한 약물 전달체로 간주됩니다[17, 18]. 폴리에틸렌글라이콜-b-폴리(D,L-락타이드코글라이콜라이드)(PEG-b-PLGA)는 폴리에틸렌글라이콜과 PLGA 공중합체 기반으로, 가수분해 후 안전하고 무독성이며 미국 FDA 승인을 받았습니다[19,20,21,22]. 따라서 PEG-b-PLGA 공중합체 나노캐리어 정맥주사는 표적 전달 달성과 효능 증진을 위한 유망한 전략입니다. 또한 HCC 세포막 GPC3 분자에 대한 특이적 항체 hGC33 적용은 나노약물의 체내외 표적 전달 개선뿐만 아니라[18, 19], GPC3과 연결된 Wnt 및/또는 다른 신호전달 경로 차단, 암세포 증식 및/또는 생존 억제로 시너지적 항종양 활성 달성이 가능할 것입니다.
본 연구에서는 hGC33 항체 변형 공중합체 PEG-b-PLGA 나노입자가 소라페닙(hGC33-SFB-NP) 전달을 체내외 HCC에 촉진하고, HCC 활성 표적화를 통해 약물 약동학을 변화시켜 HCC 치료 효율을 개선할 수 있는지 탐구했습니다. 입자 크기, 제타 전위, 입자 형태, 약물 포집 효율, 약물 탑재량, 체외 약물 방출로 표적 NP를 종합적으로 특성화했습니다. 체외 표적화 능력은 HepG2 간암 세포의 세포 섭취로 특성화했습니다. 생체 내 분포와 hGC33-SFB-NP의 HCC에 대한 시너지 치료 효과를 소라페닙, SFB-NP와 비교 평가했습니다. 결과는 hGC33-SFB-NP가 GPC3 양성 HCC를 표적화할 수 있음을 보여주었습니다. Wnt와 Ras/Raf/MAPK 신호전달 경로 억제로 세포주기 진행, 세포 증식, 종양 침윤을 억제하고 간암 진행을 시너지적으로 억제합니다.
hGC33 항체, 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드(MTT), 4',6-디아미디노-2-페닐인돌 다이하이드로클로라이드(DAPI), 5,5',6,6'-테트라클로로-1,1',3,3'-테트라에틸-벤지미다졸릴 카보시아닌 아이오다이드(JC-1), 디메틸설폭사이드(DMSO)는 시그마-알드리치(St. Louis, MO)에서 구입했습니다. 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸-카르보디이미드 하이드로클로라이드와 N-하이드록시석시나미드는 기윤바이오테크(광저우, 중국)에서 구입했습니다. 비시니코닌산(BCA) 단백질 정량 키트, 쿠마린-6, Annexin V-FITC/PI 세포자멸사 검출 키트는 베이타임 바이오테크놀로지(상하이, 중국)에서 구입했습니다. PEG-b-PLGA-말레이미드 이블록 공중합체(mal-PEG-b-PLGA; 25,000-30,000 Da, PLGA, LA:GA, w/w; PEG, 13-15%)는 폴리사이테크(웨스트 라파예트, IN, 미국)에서 구입했습니다. PI3K 항체 키트(9655#), p-Akt 항체 키트(9916#), mTOR 항체 키트(9964#), Bcl-2 패밀리 항체 키트(9942#), 세포자멸사 항체 키트(9915#), 이차 항염소 토끼/마우스 항체는 셀 시그널 테크놀로지(댄버스, MA, 미국)에서 구입했습니다. 사이클린 B1, 사이클린 의존성 키나제는 압캠 바이오테크놀로지(미국)에서 구입했습니다. 인산화 Rb, 사이클린 D1, 체크포인트 키나제 1(CHK1), P53, 인산화 유방암 감수성 유전자 1(p-BRCA1), RAD51, 사이토크롬 C, 기질 금속단백질분해효소(MMP2, MMP9) 항체는 압캠(미국)에서 구입했습니다. 기타 모든 분석급 화학물질, 시약, 용매는 표준 공급업체에서 구입해 추가 정제 없이 사용했습니다.
HCC 세포주 HepG2(미국 유형 배양 수집품(마나사스, VA, 미국) 획득)를 DMEM 배지(인비트로젠, 칼스배드, CA, 미국)에 10% FBS(하이클론, 로건, UT, 미국), 80 U/mL 페니실린, 80 μg/mL 스트렙토마이신 첨가, 5% CO₂, 37°C 가습 분위기에서 배양했습니다. BALB/C 누드 마우스, 20-22 g(5-6주령)은 난징 준커 바이오테크놀로지(중국)에서 제공받았습니다. BALB/C 누드 마우스를 SPF 실에서 사육했습니다. 모든 동물 관리와 처리는 안후이과학기술대학교 동물 관리 요건에 따라 수행했습니다. 모든 실험 프로토콜은 안후이과학기술대학교 동물실험윤리위원회 검토 승인(승인번호: 2019dw013)을 받았습니다.
NPs 제조를 위해 mal-PEG-b-PLGA와 SFB 또는 쿠마린-6을 칭량해 유기상(디클로로메탄/아세톤 3:2 v/v)에 용해했습니다. 용액을 폴리비닐알코올(PVA) 용액(5% w/v)에 지속적 볼텍싱 하에 방울방울 첨가했습니다. 혼합물을 프로브 소니케이터(출력 550 W, 8회)로 얼음 위에서 간헐적 초음파 처리해 유수 에멀전을 만들었습니다. 에멀전을 PVA(1% w/v) 용액에 자기교반 하에 첨가했습니다. SFB와 쿠마린-6 NPs를 8000 rpm, 30분 원심분리하여 수집하고 Milli-Q 물로 3회 세척했습니다.
항체 hGC33의 자유 설프하이드릴 기와 말레이미드 기 반응으로 형성된 티오에테르 결합으로 hGC33-NP를 생성하기 위해, hGC33 항체를 몰비 5:1(hGC33:mal-PEG-b-PLGA)로 말레이미드 기능화 NPs와 혼합하고 4°C에서 16시간 지속 교반하며 배양했습니다. hGC33은 항체 hGC33의 설프하이드릴 기와 PEG 사슬의 말레이미드 기 반응으로 NPs에 결합되었습니다. 비결합 항체는 Sepharose CL-4B 컬럼 통과로 제거했습니다. 효율적 단백질 결합은 BCA 키트(써모 피셔 사이언티픽, 월섬, MA, 미국)로 확인했습니다.
NPs 형태는 투과전자현미경(TEM, H-600; 히타치, 도쿄, 일본)으로 평가했습니다. 약물 무함유 hGC33-NPs와 약물 무함유 NPs를 브로마이드 칼륨 사용 푸리에 변환 적외선 분광광도계(써모 니콜렛, 매디슨, WI, 미국)로 기록했습니다. NPs 평균 입자 크기와 제타 전위는 말번 제타사이저 ZEN3600 Nano ZS(말번 인스트루먼츠, 말번, 영국)로 20°C에서 특성화했습니다. 약물 포집 효율(EE)과 약물 탑재량(LC) 효율은 초여과법으로 평가했습니다. 시료를 초여과 장치(100 kMWCO; 사토리우스, 괴팅엔, 독일)에 로딩하고 8000 rpm, 25분, 4°C에서 원심분리해 유리 약물을 제거했습니다. 각 시료 동일 부피를 아세토니트릴에 용해해 총 약물량을 확인했습니다. 농도는 고성능 액체 크로마토그래피로 측정했습니다. 흡수 파장은 266 nm였습니다. NPs 약물 EE(%) 계산식: (포집된 약물 중량/총 약물 중량) × 100%. LC(%) = (포집된 약물 중량/NPs 중량) × 100%. 실온에서 NPs 안정성 이해를 위해 0.5, 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20, 24시간 시점에서 동적 빛산란(DLS)으로 NP 크기 변화를 평가했습니다.
NPs 약물 방출은 분자량 절단 10 kDa 투석백으로 조사했습니다. 간단히 1 mL NPs를 투석백(MWCO 8,000-10,000 Da; 스펙트럼 랩스, CA, 미국)에 로딩했습니다. 투석백을 PBS에 담그고 자기교반기로 25°C에서 교반했습니다. NPs 약물 방출 프로파일을 100 mL 0.2 M 인산완충염수(PBS; pH 7.4)에서 7일간 측정했습니다. 시료 약물 농도는 고성능 액체 크로마토그래피로 측정했습니다. 후속 연구에서 hGC33-SFB-NP와 같은 입자 크기를 가진 hGC33-쿠마린 6-NP를 사용해 hGC33-SFB-NP 표적화 평가했습니다. HepG2(GPC3 양성), Li-7(GPC3 음성) 세포를 hGC33-쿠마린 6-NP와 37°C, 5% CO₂에서 0.5, 2, 4시간 배양했습니다. 공동배양 세포를 세척하고 4% 포름알데히드로 10분 고정; 세포핵을 5 μg/mL Hoechst 33,342로 15분 염색해 세포내 NPs 위치 확인. 공초점 현미경(올림푸스 FV1000; 올림푸스, 도쿄, 일본)으로 세포내 나노입자 이미지 분석했습니다.
자유 hGC33(Ab), 자유 SFB, hGC33-null-NP, hGC33-SFB-NP의 세포독성을 MTT 분석으로 측정했습니다. 대수기 HepG2(GPC3 양성), Li-7(GPC3 음성) 세포를 96웰 플레이트에 웰당 4000 세포 밀도로 파종하고 37°C, 5% CO₂에서 48시간 배양했습니다. 세포를 hGC33, 자유 SFB, hGC33-null-NP, hGC33-SFB-NP로 37°C, 5% CO₂에서 48시간 처리했습니다. 일정 시간 공동배양 후 MTT 분석으로 항세포 증식 활성 측정[20]. 각 웰 흡광도 490 nm에서 측정하고 SPSS 17.0으로 반수 억제 농도(IC50) 계산했습니다.
대수증식기 세포를 6웰 플레이트에 웰당 5 × 10⁴ cells/well 밀도로 파종하고 흡입 헤드로 스크래치한 후 무혈청 배양액으로 교체했습니다. 대조군과 실험군에서 0h, 24h, 48h 창상 치유 기록. 동시에 동일 세포 수를 트랜스웰 챔버에 접종하고 자유 hGC33, 자유 SFB, hGC33-null-NP, hGC33-SFB-NP로 처리했습니다. 하부 챔버에 10% FBS 배지 500 μL 첨가. 24시간 배양 후 트랜스웰 챔버를 꺼내 4% 파라포름알데히드로 고정하고 0.1% 크리스탈 바이올렛으로 염색. 창상 치유 크기와 이동 세포 수 계산으로 이동 능력 평가.
6웰 플레이트에서 하룻밤 배양 후 세포를 자유 hGC33(Ab), 자유 SFB, hGC33-null-NP, hGC33-SFB-NP로 24시간 처리했습니다. 이후 세포 수집, 에탄올 고정, 요오드화프로피듐 염색 후 유세포분석 수행, modifit 3.0(Verity Software House, Topsham, ME)으로 세포주기 분석.
신호전달 경로 활성화 상태와 표적 분자 발현 평가를 위해 6웰 플레이트에서 하룻밤 배양한 세포를 자유 hGC33, 자유 SFB, hGC33-null-NP, hGC33-SFB-NP로 24시간 처리했습니다. 각 처리 그룹 세포 수집, 단백질 추출 및 측정. BCA 단백질 키트(바이오샵, 허페이, 중국)로 단백질 농도 측정 및 보정. 시료 단백질을 12% 알킬황산 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동으로 분리, PVDF 막 전이, 무지방 우유로 차단. 일차항체(1:1000 희석) 4°C 하룻밤 배양, 이차항체(1:2000) 실온 1시간 배양. 밴드 ECL 기질(써모 피셔 사이언티픽, 월섬, MA, 미국)로 가시화, 겔 이미지 분석 시스템으로 이미지 표시, β-actin을 대조로 사용.
자유 hGC33, 자유 SFB, hGC33-null-NP, SFB-NP, hGC33-SFB-NP의 생체 내 HCC 성장 억제 효과 측정. 안후이공과대학교 윤리위원회 동물 건강 규정과 지침에 따라 모든 실험을 온도 조절실(23 ± 2°C), 12h/12h 명암 주기 케이지 내 BALB/c 마우스에서 수행했습니다. 5 × 10⁶ 살아있는 HepG2 세포 함유 50-μl 현탁액을 5주령 암컷 BALB/c 마우스(20-22 g) 우측 복부에 피하 주사했습니다. 종양 부피 약 50 mm³ 도달 시 마우스를 무작위 6그룹(그룹당 10마리)으로 나누었습니다. 생리식염수 대조군 NS(200 μL PBS 내 200 mg/kg null NP), hGC33-null-NP(200 μL PBS 내 hGC33-null-NP, hgc33 = 100 μg/kg/회 상당), 자유 hGC33(200 μL PBS 내 hGC33, 100 μg/kg/회), 자유 SFB(SFB 용량: 8 mg/kg/회), SFB-NP(SFB 용량: 8 mg/kg/회), hGC33-SFB-NP(SFB = 8 mg/kg/회 상당, hGC33 = 100 μg/kg/회 상당)를 꼬리정맥으로 2일마다 10회 주사했습니다. 마우스 체중과 종양 크기 4일마다 측정. 종양 부피 계산식: 부피 = 0.5 × L × W², L과 W는 종양 길이와 너비. 투약 4주 후 디에틸에테르 마취, 종양 크기 및 무게 측정. 또한 종양, 심장, 간, 신장, 폐, 비장 적출, 4% 파라포름알데히드 고정, 파라핀 포매, 절편 제작, 헤마톡실린-에오신 염색, 디지털 현미경으로 조직학적 변화 평가.
데이터는 평균 ± 표준편차(SD)로 제시, SPSS 18.0 분산분석으로 평가. 쌍별 통계 비교는 양측 Student's t-검정 수행. P < 0.05를 통계적 유의성 기준으로 판단.
NP 직경과 표면 특성이 세포 섭취, 약물 방출, 생체 내 NP 분포에 영향을 주므로 준비된 NP를 해당 파라미터로 특성화했습니다. SFB-NP, hGC33-null-NP, hGC33-SFB-NP 폴리머의 형태, 입자 크기, 입자 크기 분포를 그림 1에 요약했습니다. 투과전자현미경으로 관찰한 hGC33-SFB-NP 형태(그림 1a)는 흐릿한 가장자리를 가진 단단한 핵을 보여 hGC33이 NPs 표면에 존재함을 나타냅니다. SFB NP, hGC33-null-NP, hGC33-SFB-NP 입자 크기는 100-150 nm 범위이며 전형적인 단봉 분포를 가집니다. hGC33-SFB-NP 평균 직경(120.2 ± 10.2 nm)은 hGC33-null-NP, SFB-NP, null NP보다 약간 큽니다(그림 1a, 표 1). hGC33-SFB-NP와 hGC33-null-NP 표면에 단일 표면을 가진 얇은 구형 불명확 막이 존재해 항체 hGC33이 NPs 표면에 존재함을 나타냅니다. hGC33-SFB-NP와 hGC33-null-NP 크기 증가는 hGC33 막 존재를 확인합니다. NP 제조 전 ¹H-NMR(그림 1b)로 hGC33-SFB-NP 합성 확인. 5.2 ppm, 1.58 ppm 피크는 젖산 -CH₃ 프로톤, 4.8 ppm 피크는 글리콜산 -OCH₂-, 3.6-3.8 ppm 피크는 PEG 반복 단위 -CH₂CH₂O- 프로톤에 할당. PEG-b-PLGA와 Ab-PEG-b-PLGA NPs 표면 화학도 FTIR 분광법으로 연구(그림 2c). PEG-b-PLGA 폴리머 스펙트럼에서 ~1750 cm⁻¹ 강한 밴드는 PLGA 사슬 카르보닐기(C=O) 신축, 2880 cm⁻¹ 밴드는 PEG 사슬 -CH 기 신축. 동시에 2520 cm⁻¹ 피크가 나타나 hGC33 항체 -SH 신축 피크로 귀속. ¹H NMR과 FTIR 결과가 항체가 PEG-b-PLGA 폴리머 백본에 접합됨을 나타냄.
NPs 특성 분석. a NPs TEM 특성 분석, 눈금 막대 100 nM; b CDCl₃ 내 합성 hGC33-PLGA-b-PEG ¹H NMR 스펙트럼; c hGC33-PEG-b-PLGA와 PEG-b-PLGA FTIR 스펙트럼; d PBS(pH 7.4) 37°C에서 SFB-NP, hGC33-SFB-NP 누적 방출 프로파일; e 10% FBS 함유 DMEM 배지에서 14일간 NPs 크기 변화; f PBS에서 14일간 NPs 크기 변화. SFB, 소라페닙; TEM, 투과전자현미경; NPs, 나노입자; ¹H NMR, ¹H-핵자기공명 분광법; FTIR, 푸리에 변환 적외선 분광법
Li-7, HepG2 세포에서 GPC3 발현 및 hGC33-쿠마린6-NP 섭취. 세포를 배양판에 접종, PBS 세척 후 DMEM 내 100 μg/ml hGC33-쿠마린6-NP로 2, 4, 8시간 배양. DAPI로 핵 염색, 세포 고정, 공초점 레이저 주사 현미경 검출. 면역세포화학으로 GPC3 미검출 Li-7 세포, HepG2 세포에서 고발현 확인. 눈금 막대 50 μM
흥미롭게도 10% FBS 함유 DMEM 배지(pH 7.4)에서 hGC33-SFB-NP와 SFB-NP 나노입자는 약 4일까지 빠른 약물 방출 후 상대적으로 느리고 안정적 방출; hGC33-SFB-NP와 SFB-NP 20일 누적 SFB 방출률 약 77%, 65%(그림 1d). 차이는 PEG-b-PLGA 매트릭스 표면 친수성 분자가 수화 증가로 나노입자 분해 촉진, 가수분해 촉진 때문일 수 있음. 준비 NPs 안정성 확인 위해 hGC33-SFB-NP, hGC33-null NP, null-NP, SFB-NP를 10% FBS 함유 DMEM(pH 7.4)과 PBS(pH 7.4)에 배치. 다양한 NPs 크기 2주 이상 안정 유지. SFB가 hGC33-SFB-NP에서 14일간 지속적 안정적 방출, 10% FBS 대비 DMEM 배지에서 입자 크기 미미한 변화(그림 1e, f). hGC33-SFB-NP 안정성은 지속적 생물학적 역할 가진 SFB에 적절.
큰 제타 전위는 NP 간 강한 정전기적 반발 상호작용 유발, NP 분산계 안정성 유지[23, 24]. 표 1에서 hGC33-SFB-NP, hGC33-null-NP, SFB-NP 제타 전위 각각 -18.2 ± 2.2 mV, -18.5 ± 1.8 mV, -15.9 ± 2.1 mV로 항체 hGC33 당단백질 알데하이드기, 카르복실기, 인산기 음전하 기인 가능. 음전하 NPs는 NP 현탁액 높은 안정성 유도. 또한 정상 생리 환경에서 세포 표면 음전하이므로 준비 NPs 저전하 세포 반발, 세포 조직 독성 낮음. 또한 null-NP, SFB-NP 크기 분포(PDI 0.18, 0.19)가 hGC33-null-NP(PDI 0.21), hGC33-SFB-NP(PDI 0.23)보다 약간 작으나 유의하지 않음. NPs 크기 균일성 양호. SFB 포집 효율과 탑재량 결과에 따라 NPs 입자 크기, 크기 분포, 제타 전위 표 1에 나타냄. 비결합 GPC3 항체 hGC33 초원심분리 제거, hGC33 항체 NPs 결합 효율 평가. BCA 단백질 분석으로 hGC33 항체 NPs 결합 효율 79.5% ± 2.9%.
NPs hGC33 항체가 여전히 GPC3 특이적 표적화 능력 있는지 확인 위해 GPC3 양성 HepG2, GPC3 음성 Li-7 세포를 표적 세포로, hGC33-쿠마린 6-NP를 추적 나노입자로 사용, 2h, 4h, 8h 배양. 세포 PBS 3회 세척, DAPI 핵 염색, 세포 고정, 라이카 형광현미경(DMi8, 독일) 촬영. 동일 배양 시간에서 HepG2 세포 녹색 형광 강도가 Li-7 세포보다 유의하게 높음(그림 2). HepG2 세포 진입 hGC33-쿠마린 6-NP 양이 Li-7 세포보다 유의하게 많음 의미. hGC33-쿠마린6-NP 표면 hGC33 항체가 여전히 GPC3 표적화 능력 보유, 나노입자 내부화 매개함 문서화. HepG2, Li-7 세포 GPC3 발현 간접 형광, 세포화학 염색 검사. HepG2 세포 GPC3 과발현, Li-7 세포 GPC3 미발현(그림 2).
hGC33 변형 NP(hGC33-null-NP) HCC 성장 억제 여부 확인 위해 GPC3 양성 HCC 세포주 HepG2, GPC3 음성 세포주 Li-7 세포 성장 억제 측정. hGC33-null-NP와 hGC33 모두 24시간 처리 후 GPC3 양성 HCC 세포주 HepG2 성장 억제, hGC33이 hGC33-null-NP보다 HepG2 세포 억제 효과 더 유의함(그림 3a); 반면 hGC33-null-NP, hGC33 모두 GPC3 음성 Li-7 세포주 성장 영향 없음(그림 3b). hGC33-null-NP(0.1 μM hgc33 상당), hGC33(0.1 μM) HepG2 세포 증식 대표 시간 경과 그림 3c. hGC33이 GPC3 인식 C-말단 펩타이드이므로 hGC33-null-NP보다 HepG2 억제 우수. 결과는 hGC33-null-NP 내 hGC33 분자 공간 입체 장애 효과 가능성, hGC33 에피토프 결합 능력 영향 가능성 시사.
HepG2, Li-7 세포 증식이 hGC33, null-NP, hGC33-null-NP로 억제. a GPC3 양성 HepG2 세포 hGC33, null-NP, hGC33-null-NP 처리 세포 증식 검사; b GPC3 음성 Li-7 세포 hGC33, null-NP, hGC33-null-NP 처리 세포 증식 검사. 세포 0-2.5 μM hGC33, null-NP, hGC33-null-NP 1일 배양. MTT 법으로 세포 증식 측정, 무처리 세포 기준 표준화. 모든 값 평균 ± SD. 대조군(0 μM) 항체 무처리 대비 *P < 0.01; c HepG2가 hGC33, null-NP, hGC33-null-NP에 반응 대표 결과(hGC33 처리 1.0 μM)
hGC33-null-NP NPs 표면 변형 hGC33 항체 분자 활성 기전 이해 위해 hGC33-null-NP 처리 HepG2 세포주기 진행 연구. HepG2 세포주에서 hGC33-null-NP, hGC33 모두 G1기 세포 비율 유의 증가(그림 4a, b). hGC33-null-NP, hGC33 모두 세포주기 G1기 정지 유도. 또한 hGC33-null-NP, hGC33 모두 HepG2 세포 사이클린 D1 발현 유의 저하(그림 4c, d).
hGC33-null-NP, hGC33 유도 G1기 세포주기 정지, HepG2 세포 사이클린 D1 발현 억제. a hGC33-null-NP, hGC33 처리 다양한 그룹 대표 세포주기 다이어그램. b hGC33-null-NP, hGC33 처리 다양한 그룹 세포주기 분석. HCC 세포 0.5 μM hGC33 또는 hGC33-null-NP(hGC33 몰농도 기준) 배양. *P < 0.05, hGC33-null-NP 또는 hGC33 세포 G1기 0h 세포 대비 비교. c, d hGC33-null-NP 또는 hGC33 처리 후 사이클린 D1 대조군 대비 HepG2 세포서 유의 저하
HCC 세포 고전적 Wnt/β-카테닌 신호 활성화 이해 위해 다양한 HCC 세포주: HepG2(GPC3⁺⁺), Huh-7(GPC3⁺), Li-7(GPC3⁻) Wnt 리간드, 수용체 주름 단백질(프리즐드, FZD/Frz) 발현 검출. Wnt3a, β-카테닌 경로 전달 FZD 수용체 모든 세포주 발현, 특히 HepG2, Huh-7 세포 높음(그림 5).
HCC 세포주 Wnt3a, FZD1, FZD3 발현
일부 연구에서 GPC3 세포외 부분이 Wnt 공동수용체 역할, Wnt/β-카테닌 신호 활성화 및 전달 촉진 제시. 따라서 HepG2(GPC3⁺), Huh-7(GPC3⁺), Li-7(GPC3⁻) 세포를 hGC33, hGC33-null-NP와 공동배양 시 hGC33, hGC33-null-NP가 Wnt/β-카테닌 신호 활성화 차단, Wnt3a 조성 배지에서 HepG2, Huh-7 증식 억제, Li-7 미억제. Li-7 세포 증식은 표면 GPC3 부재 때문 가능성(그림 6). hGC33, hGC33-null-NP NPs가 세포막 GPC3 분자 특이적 결합. hGC33, hGC33-null-NP가 Wnt3a 유사분열 활성 부분 중화, Wnt/β-카테닌 신호전달 경로 억제. 그러나 hGC33-null-NP NPs 증식 억제 효과 hGC33보다 낮음. NPs 공간구조가 hGC33-null-NP 간섭, NPs 표면 hGC33 분자 기능 제한, GPC3-Wnt3a 상호작용 완전 차단 못함 가능성.
HCC GPC3 활성화 Wnt 신호전달. 50% Wnt3a DMEM 배지 항-Wnt3a 항체, hGC33, hGC33-null-NP 첨가. HepG2(GPC3⁺⁺), Huh-7(GPC3⁺), Li-7(GPC3⁻) 세포 48시간 공동배양, MTT 분석 세포 증식 측정. 데이터 평균 ± SD(*P < 0.01)
hGC33-null-NP HCC 세포 Wnt/β-카테닌 신호전달 영향 이해 위해 hGC33, hGC33-null-NP 처리 HepG2, Huh-7 세포 단백질 추출. 웨스턴 블롯 결과 hGC33-null-NP 처리 후 pYAP, pβ-카테닌 수준 증가, YAP, β-카테닌 수준 감소. 또한 hGC33-null-NP 그룹 사이클린 D1, CD44, VEGF, c-MYC 수준 대조군보다 낮음, hGC33 처리보다 낮음. HepG2, Huh-7 세포 유사 효과(그림 7).
hGC33-null-NP 또는 hGC33에 의한 Wnt3a 유도 β-카테닌 신호전달 억제. a 대조군 대비 hGC33-null-NP 또는 hGC33 처리 HepG2, Huh-7 세포 Wnt/β-카테닌 신호전달 경로 억제, β-카테닌, YAP 수준 감소, 인산화 β-카테닌, 인산화 YAP 분자 불안정, 세포질 분해. 감소된 β-카테닌 핵 유지 어려워 사이클린 D1, CD44, VEGF, c-MYC 발현 구동 감소, 사이클린 D1, CD44, VEGF, c-myc 단백질 수준 감소. b hGC33-null-NP 또는 hGC33에 의한 Wnt/β-카테닌 신호전달 경로 억제 기전 패턴
HCC 세계 치명적 암 중 하나, 발생률 지속 증가. 소라페닙 진행성 HCC 환자 유일한 승인 표준 치료, 생존율 개선 입증. 그러나 임상, 전임상 관찰에서 소라페닙 치료 효능 제한적, 약물 저항성 급속 발달. 소라페닙 저항성 회피 기전 규명이 HCC 연구 주요 강조점. 최근 상피-중간엽 전이(EMT) HCC 진행 및 약물 저항성 발달 역할 주목 증가. EMT는 상피세포 중간엽세포 전환, 세포 전이 침윤 능력 부여: 줄기세포 특성 획득, 세포자멸사 노화 감소, 면역억제 촉진, 암 발생 발달 참여. E-카데린 발현 상실 암 발생 EMT 핵심 단계. EMT 발달 다단계 분자 세포 재프로그래밍 과정, 암세포 공격성 달성 위해 사용. 주로 E-카데린, 케라틴, 뮤신, ZO-1(밀착접합 단백질) 하향조절; 비멘틴, α-평활근 액틴(α-SMA), FN 피브로넥틴, MMPs(기질 분해), N-카데린, 스네일, 슬러그, 트위스트, Rho, TGF-β, FGF, I형 콜라겐, II형 콜라겐 상향조절로 EMT 특징 종양 침윤, 전이, 항세포자멸사 달성. 이들 단백질 발현 변화 주로 Wnt/β-카테닌, Ras/Raf/MAPK 신호전달 경로 활성화 관여.
우리 실험에서 NP 벡터 표면 hGC33 항체 Wnt3a 유도 β-카테닌 신호전달 억제, β-카테닌, CD44, 혈관내피세포성장인자(VEGF), 사이클린 D1, c-MYC 발현 하향조절. 또한 hGC33-SFB-NP Ras/Raf/MAPK 신호전달 경로 활성화 억제, HCC 세포 증식, 세포자멸사 억제. hGC33, SFB 시너지 효과, EMT 억제, HCC 세포 이동 감소(그림 8).
hGC33-SFB-NP EMT 억제 효과. a 대조군 대비 hGC33-SFB-NP 처리군 세포 이동 적음. 광학현미경 촬영(배율 ×200). 오차값 3회 독립실험 표준편차. *대조군 대비 p < 0.01. b 대조군 대비 hGC33-SFB-NP 처리 HCCs EMT 관련 단백질 스네일, 비멘틴, MMP-2 감소, E-카데린 증가. c EMT 분자 기전. EMT, 상피-중간엽 전이; MMP-2, 기질 금속단백질분해효소-2; SFB, 소라페닙; NP, 나노입자
hGC33-SFB-NP 생체 내 항종양 활성 평가 위해 HepG2, Huh-7 세포 각각 암컷 BALB/c 누드 마우스 우측 복부, 등쪽 피하 접종. 종양 이종이식 성장 약 30 mm³ 도달 시 마우스 무작위 그룹 나누어 각 그룹(hGC33-SFB-NP, hGC33-null-NP, SFB-NP, 자유 hGC33, 자유 SFB, 대조군) HCC 억제 효과 추가 평가(n=5/그룹). 그림 9a, b에서 hGC33-SFB-NP PBS 대조군 및 타 치료 대비 마우스 종양 성장 유의하게 지연. PBS 대조군 대비 hGC33-null-NP, SFB-NP, 자유 hGC33, 자유 SFB도 HCC 일정 억제, 자유 hGC33, 자유 SFB 각각 Wnt 신호, Ras/Raf/MAPK 직접 억제 때문. NP 변형 hGC33(hGC33-null-NP) 화학결합 나노표면 연결이나 GPC3 분자 표적화, Wnt 활성 억제 영향 없음. NP 탑재 SFB(SFB-NP) 세포 내포 후 공중합체 분해로 SFB 방출, HCC 성장 억제. 전체적으로 hGC33-SFB-NP HepG2 세포 이식편 억제 효과 Huh-7 세포 이식편보다 강함, HepG2 GPC3 분자 발현 때문 가능성.
누드 마우스 HCC 이종이식 hGC33-SFB-NP 효과, 마우스 체중 변화. 간암 세포 각 누드 마우스 등 피하 접종(n=10). 10일 후 종양 보유 마우스 PBS(대조), 자유 hGC33, 자유 SFB, hGC33-null-NP, SFB-NP, hGC33-SFB-NP 처리. 종양 크기(a, b), 마우스 체중(c, d) 지정 시점 모니터링
각 치료군 누드 마우스 체중 측정(그림 9c, d). 대조군 마우스 체중 점진적 감소. 자유 hGC33, 자유 SFB, SFB-NP, hGC33-null-NP 치료군 마우스 체중도 점진적 감소, 대조군 대비 유의하게 적지 않음. 그러나 hGC33-SFB-NP 처리 HepG2, Huh-7 보유 누드 마우스 체중만 약간 감소, 치료 주기 동안 상대적 안정 유지. 이 결과들 새로운 hGC33-SFB-NP 나노약물 누드 마우스 유의한 독성 없음, 나노캐리어 탑재 SFB, 표면 변형 hGC33 부가적 또는 시너지적 항종양 효과 생성 지지.
hGC33-SFB-NP 표적 HCC 치료 적합성 검토 위해 모델 접합체 체외 인간 GPC3 HCC 세포 결합 능력; GPC3 양성 HCC 세포 증식, 이동, Wnt/β-카테닌 신호전달 억제; GPC3 과발현 HCC 체내 억제 능력 테스트.
GPC3 특이적 항체 hGC33을 mal-PEG-b-PLGA NPs와 공유결합 위해 hGC33 Fc 세그먼트 자유 설프하이드릴 기를 말레이미드 기능화 PEG-b-PLGA(mal-PEG-b-PLGA)와 안정적 티오에테르 결합 형성으로 가교결합. 접합은 GPC3 양성 HCC 표적화 전제조건. NP 직경, 제타 전위 변화(렌즈 검출), hGC33-SFB-NP 세포내 섭취 등 일련 실험으로 HepG2(GPC3⁺) 세포 hGC33-SFB-NP 표적화 검증. 결과 항체 hGC33 결합 활성 접합으로 변함없음 나타냄.
공초점 현미경으로 PEG-b-PLGA NP 표면 변형 hGC33 GPC3 양성 HepG2, GPC3 음성 Li-7 세포 식균 효과 직접 검출. HepG2, Li-7 세포 hGC33-쿠마린 6-NP 공동배양 후 HepG2 세포 녹색 신호 강도 Li-7 세포 대비 유의하게 높음, HepG2 세포 내 나노입자 더 많음 의미. 이 발견 hGC33 항체 PEG-b-PLGA NP 표면 변형 HCC 세포 표면 글리피칸-3 특이적 결합, 내부화 일치. hGC33 변형 NP 내부화 효율 세포 표면 GPC3 항원 발현 수준 의존.
표준 MTT 분석으로 간암 세포 증식 억제 효율 측정. hGC33-null-NP, hGC33 모두 GPC3 양성 HCC 세포주 HepG2 성장 억제, hGC33-null-NP, hGC33 GPC3 음성 Li-7 세포 증식 영향 없음(그림 3b). 동물 수준에서 hGC33-null-NP 또는 hGC33 단독 Huh-7, HepG2 이종이식 일정 정도 성장 억제, hGC33-SFB-NP 생쥐 Huh-7, HepG2 간암 이종이식 성장 정지 유도. hGC33-null-NP GPC3 양성 간암 세포 유의 억제 발견, PEG-b-PLGA NP 표면 변형 hGC33 HCC 세포 증식 억제 효과 세포 표면 GPC3 항원 발현 의존함 보여줌.
GPC3 HCC 병인기전 다수 경로 조절, Wnt, YAP 신호전달 포함[25,26,27]. GPC3 Wnt 리간드 상호작용, Wnt 공동수용체 역할, Wnt/프리즐드 결합 촉진 HCC 성장[28, 29]. 나노약물 표면 변형 hGC33 Wnt 신호전달 경로 간암 세포 영향 추가 검토. 자유 hGC33처럼 나노약물 표면 변형 hGC33 GPC3 발현 HepG2, Huh-7 세포 Wnt 유도 신호전달 차단뿐만 아니라 Wnt3a 유도 β-카테닌, YAP 신호전달 억제로 간암 세포 증식 억제. 이전 연구 β-카테닌 HCC 전사 수준 YAP 발현 조절[30, 31]. 본 연구 자유 hGC33, 나노약물 표면 변형 hGC33 Wnt3a 유도 YAP 활성 억제, β-카테닌 복합체서 방출된 Yap/TAZ도 고전적 Wnt 신호전달 개시 가능[32, 2]. 전형적 Wnt, YAP 다양한 기전 크로스토크 나타냄. hGC33-null-NP, hGC33 대비 hGC33-SFB-NP 체외 체내 더 강한 항증식, 항이동 능력. hGC33 HCC 세포 특이성 결정뿐만 아니라 Wnt/β-카테닌, Wnt/YAP 신호전달 등 종양 성장 관련 핵심 신호 차단으로 SFB HCC 세포 증식, 이동 억제 효과 증진.
간세포암 세포 과발현 막단백질 글리피칸-3 항체 hGC33이 소라페닙 탑재 폴리에틸렌글라이콜-b-PLGA 폴리머 나노입자(hGC33-SFB-NP) 암세포 글리피칸-3 결합 증가. 항체 변형 나노입자 투여 시 Wnt 유도 신호전달, Ras/Raf/MAPK 신호전달 경로 시너지적 억제; 사이클린 D1 발현 저하로 간세포암 세포 G0/G1기 정지, 상피-중간엽 전이 억제로 암세포 이동 감쇠. hGC33-SFB-NP 생체 내 간암 성장 억제, 종양 보유 마우스 생존율 개선.
예, 모든 데이터 원고에 제시됨.
나노물질
초록 산화아연 나노입자(ZnO NP)는 산업, 상업 제품, 의료 분야 등 광범위한 응용에 사용된다. 수많은 메커니즘 연구가 프리스틴(신선한) NP의 독성에 대해 수행되었으나, 변형된(노화된) ZnO NP에 의한 세포독성과 기저 메커니즘은 불분명하다. 여기서 우리는 ZnO NP의 물리화학적 변환을 시간에 따라 관찰한 후 신선한 NP와 노화된 NP의 세포독성을 평가했다. 신선한 ZnO NP가 노화된 것보다 더 높은 아폽토시스 수준을 유도함을 발견했다. 이에 따라 노화된 ZnO NP 처리된 인간-햄스터 하이브리드(AL) 세포의 RNA 시
초록 전통적인 암 치료제는 다양한 부작용과 표적 종양에 대한 불충분한 손상으로 비판받아 왔습니다. 나노입자의 돌파구는 전통적 치료와 진단을 업그레이드하는 새로운 접근법을 제공합니다. 실제로 나노입자는 전통적 암 진단과 치료의 단점을 해결할 뿐만 아니라 종양 진단과 치료를 위한 완전히 새로운 관점과 최첨단 장치를 창출합니다. 그러나 대부분의 나노입자 연구는 생체 내외 실험 단계에 머물러 있으며, 나노입자에 대한 임상 연구는 극소수만 보고되었습니다. 본 리뷰에서는 먼저 나노입자의 암 진단 및 치료 분야 현재 응용을 요약합니다. 이후 나
