나노물질
산업 제조
생물학적 안전 농도에서 흑린 나노입자는 TG2를 활성화하고 ECM의 발현을 촉진하여 EMSC의 골형성 분화를 더욱 촉진했습니다. 이러한 결과로부터 흑린 나노입자가 골조직공학의 생물학적 인자로 적합하다는 결론을 내릴 수 있다. 흑린 나노입자(BP)는 엄격한 연구와 입증을 통해 우수한 생체적합성과 우수한 생분해성을 나타냅니다. 그러나 뼈 조직 공학 분야에서의 활용은 아직 초기 단계입니다. 따라서, 본 연구의 주요 목적은 시험관 내에서 외배엽 간엽줄기세포(EMSC)의 골형성 분화에 대한 BP의 영향을 조사하는 것이었다. 높은 수율의 생체 적합성 BP는 간단하고 효율적인 초음파 처리 기술로 준비되었습니다. EMSC는 성인 쥐의 비강 호흡기 점막에서 분리되었습니다. 그런 다음, 우리는 시험관 내에서 다양한 농도의 BP로 EMSC를 처리하고 EMSC의 골 형성 분화에 대한 BP의 영향을 조사했습니다. 또한, TG2(transglutaminase 2) 억제제와 western blot을 사용하여 골형성에 대한 BP의 촉진 효과의 메커니즘을 명확히 하였다. 우리의 결과는 BP가 시험관 내에서 EMSC의 골 형성 분화를 크게 향상시킬 수 있음을 나타냅니다. 그럼에도 불구하고, BP는 EMSC 증식에 영향을 미치지 않았습니다. 기계적으로, BP는 TG2 발현을 상향 조절함으로써 EMSC의 골 형성 분화를 촉진했습니다. 이러한 결과는 골조직 재생을 위한 이러한 매우 유망한 소분자의 새로운 엔지니어링 전략을 위해 화학 물질을 사용하는 이점을 강조합니다.
임상에서 골 재생이 부족하면 일반적인 골절에서도 예후가 좋지 않을 수 있어 골 재생 재료의 필요성이 시급하다[1]. 이후 자가이식, 동종이식, 인공골 지지체와 같은 많은 치료 전략이 재생 재료로 사용되었습니다. 최근 몇 년 동안 생체 재료는 뼈 재생에 기여하는 것으로 성공적으로 입증되어 다양한 생체 재료 응용 분야에서 인상적인 진보를 보여줍니다[2]. 그러나 골전도, 골유도, 골유착이 우수한 인공골 대체재의 개발이 여전히 시급한 실정이다. 생체 활성 고분자[3,4,5]와 세라믹[6]은 뼈 공학을 위한 지지체로 만들어졌으며 이온을 방출하여 골형성을 향상시키는 지지체[7]가 특히 중요합니다. 특히 표적 세포 또는 조직에 특이적으로 작용하는 무기 인산염은 광물화 관련 생물학적 과정을 연구하고 생체 영감 광물화 유도 의료 공학을 발전시키는 유망한 경로를 제공할 수 있습니다[8].
2014년에 Li와 동료들은 흑색 인(BP) 나노시트가 벌크 BP에서 박리될 수 있고 나노 전자 장치에 적용하기 위한 새로운 2차원(2D) 재료로서 BP 나노시트의 잠재력을 입증했다고 보고했습니다[9]. 층의 독특한 주름 구조, 조정 가능한 직접 밴드 갭, 높은 캐리어 이동성 및 많은 흥미로운 층 내 이방성과 같은 BP의 우수한 특성으로 인해 BP는 현재 잠재적인 생물 의학 응용 분야에 대한 조사를 받고 있습니다[10]. 이러한 장점으로 인해 지난 2년 동안 골 재생을 자극하는 BP 나노 물질 기반 지지체에 대한 연구가 활발히 진행되었습니다. 이전 연구에서는 인 기반 생체 재료가 인산염 이온의 국소 농도를 증가시켜 광물화 및 뼈 재생을 향상시킬 수 있음을 보여주었습니다[11]. BP는 뼈 재생을 촉진하는 이상적인 후보로 간주될 수 있지만 일반적으로 폴리머로 캡슐화되거나 뼈 조직 엔지니어를 위한 적용을 위해 침지를 통해 생체 재료 스캐폴드에 도입됩니다. 지금까지 BP에 의한 뼈 재생을 조절하는 분자 메커니즘은 크게 알려지지 않았으며 따라서 클리닉에서 뼈 복구를 위한 BP 기반 치료법의 추가 개발을 방해합니다.
중간엽줄기세포(Mesenchymal Stem Cell, MSC)는 자가 재생 및 다계통 분화 능력을 가진 다능성 기질 세포이다[12]. 골절 후 MSC는 생체 내 뼈 복구 과정에서 중요한 역할을 합니다[13,14,15]. 골수 줄기 세포(BMSC)와 골 형성 분화의 가능성은 수년에 걸쳐 열렬히 연구되었습니다. 그러나 BMSC의 수확 과정은 감염 위험과 함께 제공자에게 고통스러울 수 있습니다. 배아 발달 중 두개골 신경 능선에서 유래하는 외배엽 중간엽 줄기 세포(EMSC)는 성인의 비강 호흡 점막에서 쉽게 수확할 수 있습니다. 게다가, EMSC는 우리의 이전 연구[16, 17]에서 철저하게 특성화된 다방향 분화 잠재력을 가진 자가 재생 가능합니다. 우리는 EMSC가 지방세포, 신경세포, 연골세포 및 골세포를 포함한 여러 세포 계통으로 분화할 수 있음을 입증했습니다[18, 19]. 이러한 특별한 특성은 EMSC를 BP를 포함한 화학적 신호에 의해 EMSC의 골 형성 분화를 조절하는 잠재적인 분자 메커니즘을 탐구하기 위한 유망한 도구로 만듭니다. 그러나 골형성 분화는 다양한 세포의 증식과 분화, 세포외 기질(ECM)의 합성 및 광물화의 긴밀한 조정을 포함하는 복잡한 과정입니다[20]. 이전 연구에서는 트랜스글루타미나제 2(TG2)가 조골세포 증식, 분화, 세포외 기질 생산 및 광물화에 영향을 주어 조골세포 골형성을 자극할 수 있다고 보고했습니다[21,22,23].
위에 인용된 보고서는 BP가 EMSC에 대한 우수한 골형성 분화 유도제가 될 수 있는 생물의학 응용에 대한 엄청난 잠재력을 가지고 있음을 나타냅니다. 지금까지 혈압이 EMSC 분화에 미치는 영향에 대한 연구는 보고되지 않았다. 현재 연구의 주요 목적은 EMSC 관련 체외 골 분화 및 증식에 대한 BP의 영향을 조사하는 것이 었습니다. 그 조사 후, EMSC 증식 및 골 형성 분화에 대한 BP의 잠재적인 분자 메커니즘도 주의 깊게 조사되었습니다. 전반적으로, 우리의 데이터는 BP가 조직 공학 스캐폴드에 잠재적으로 유용한 화학 물질이 될 수 있음을 보여줍니다.
벌크 BP는 Nanjing XFNANO Materials Tech Co., Ltd.에서 구입했습니다. 디메틸 설폭사이드(DMSO), 수산화나트륨(NaOH) 및 N -메틸-2피롤리돈(NMP)은 Aladdin Industrial Co., Ltd.에서 제공했습니다. 인산염 완충 식염수(PBS)는 Beijing Solarbio Science &Technology Co., Ltd.에서 얻었습니다. Dulbecco의 변형된 Eagle 배지/영양 혼합물 F12(DMEM/F12; Hyclone, GE Healthcare Life Sciences), 스트렙토마이신, 페니실린, 소태아혈청(FBS)은 BI Science and Technology Co., Ltd.에서 구입했습니다.
BP 합성은 약간의 수정을 가한 이전 보고서의 합성과 유사했습니다[24]. 먼저 20mg의 벌크 BP를 포화 NaOH/NMP 용액에 담그고 그라인딩 기계적 방법으로 정제했습니다. 그런 다음 혼합물을 1500rpm에서 10분 동안 원심분리한 후 침전물을 버렸다. 그 후, 혼합물을 얼음/수조에서 6시간 동안 초음파 처리한 다음, 혼합물을 100μm BD 팔콘 필터(Becton Dickinson, Sunnyvale, CA)를 통해 여과했습니다. 마지막으로 현탁액을 추가로 원심분리(13,000rpm, 4°C에서 10분)하고 침전물을 수집했습니다.
생체 내 EMSC를 표시하기 위해 비강 중격의 호흡기 점막을 절개한 다음 면역형광 염색을 위해 4% PFA에서 밤새 고정했습니다. 조직을 PBS로 세척한 다음 구배 자당 용액으로 탈수하였다. 조직을 냉동절편을 위해 OCT(Sakura Finetek, Japan)에 포매하고 Leica cryo-microtome을 사용하여 25mm 두께로 관상 연속 절편으로 절단했습니다. 이 섹션을 PBS에서 10분 동안 세척하고 PBS 중 1% 소 혈청 알부민 및 0.1% Triton-X 100으로 투과화했습니다. 비점막의 EMSC는 항-네스틴의 1차 항체와 Cy3-결합된 2차 항체로 면역형광 염색되었다. 평행 음성 대조군은 1차 항체 없이 동일한 절차를 거쳤습니다. 염색된 조직을 면역형광현미경(AxioObserver, ZEISS, Germany)으로 관찰했습니다.
모든 동물 절차는 Jiangnan University Animal Care and Ethics Committee의 승인을 받았으며 본 연구에서는 동물 연구에 대한 국제 지침을 엄격히 준수했습니다. 우리의 이전 연구[17, 25]에 따라 랫트 호흡기 점막에서 1차 외-중간엽 줄기 세포를 분리했습니다. 간단히 말해서, 100g의 성체 Sprague Dawley(SD) 쥐를 펜토바르비탈 나트륨(0.05g/kg)의 복강내 주사로 마취했습니다. 비중격의 중간 1/3을 다진 다음 0.25% 트립신 용액(Hyclone; GE Healthcare Life Sciences)에서 37°C에서 25분 동안 배양한 후 비중격 점막을 조심스럽게 벗겨냈습니다. 마지막으로 비중격 점막 조직을 조각조각 잘라냈다. 생성된 조직 현탁액을 100um 나일론 메쉬 체에 통과시키고 1000g에서 5분 동안 원심분리한 다음 인산완충식염수(PBS)로 2회 세척했습니다. 조직 현탁액을 성장 배지(DMEM/12는 10% FBS, 100U/ml 페니실린 및 100μg/ml 스트렙토마이신 함유)의 세포 배양 플라스크에 넣고 37°C, 5% CO2에서 배양했습니다. /서브> 포화 습도의 95% 공기. 배지는 3일마다 교체하고 세포는 매주 계대배양하였다. 세 번째 계대의 세포를 모든 특성화 연구에 사용했습니다. 비멘틴(vimentin) 및 네스틴(nestin)을 포함한 줄기세포 마커에 대한 항체로 배양된 세포를 특성화하기 위해 면역형광법을 수행했습니다[26].
EMSC를 6웰 플레이트에 접종하고 DEME/F12 배지로 24시간에서 70% 합류까지 배양했습니다. 그런 다음 배지를 골형성 분화 배지(10% FBS, 0.1mM dexamethasone, 10mM β-glycerophosphate disodium 및 0.2mM l-ascorbic acid가 보충된 DMEM)로 교체하여 골형성을 유도했습니다. 배지를 7일마다 교체하고 28일째에 0.5% Alizarin Red S(Sigma-Aldrich)로 Alizarin Red S 염색을 수행하였다. 90% confluence로 성장한 EMSC를 지방 분화 배지에서 배양하여 21일 동안 지방 생성을 유도하였다. Oil red 염색은 제조사의 지시에 따라 Oil red 염색 키트(Solarbio)를 이용하여 진행하였습니다.
주사 전자 현미경(SEM)은 BP 형태와 크기를 특성화하는 데 사용되었습니다. 샘플은 탈이온수 중 1mg/ml 농도의 BP 용액 한 방울을 formvar 코팅 구리 그리드에 놓고 공기 건조하여 준비했습니다. 시료는 주사전자현미경(H-7500; Hitachi, Tokyo, Japan)으로 촬영하였다. BP의 평균 크기는 Image Pro Plus 소프트웨어(Media Cybernetics Inc., MD, USA)를 사용하여 분석되었습니다. 제타 전위 평가는 Malvern 제타 사이저(ZEN3600)로 확인하였다. X선 회절(XRD)은 Bragg-Brentano 파라-초점 기하학 및 Cu Kα 방사선에서 Bruker D8 Discover 회절계로 수행되었습니다. 회절 패턴은 2θ의 10°와 80° 사이에서 수집되었습니다. 0.01° 2θ 간격으로 단계당 0.2초의 획득 시간 결과 데이터는 HighScore Plus 3.0e 소프트웨어를 사용하여 평가되었습니다. 514nm 레이저 여기 기능이 있는 라만 분광계(LabRam HR800)를 사용하여 샘플의 라만 스펙트럼을 측정했습니다. 시료의 표면 조성은 X선 광전자 분광기([XPS] Omicron NanoTechnology GmbH, Germany)를 통해 측정하였다.
세포 증식에 대한 BP의 효과는 세포 계수 키트(CCK-8) 분석을 사용하여 평가되었습니다. 간단히 말해서, EMSC(3000개 세포/웰)를 96웰 플레이트에 플레이팅하고 37에서 24시간 동안 BP(0, 1, 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128 및 512μg/ml)로 처리했습니다. °C CCK8 검출을 위해 분석 4시간 전에 10μl CCK8 시약을 배양 배지에 첨가했습니다. 제조업체의 지침에 따라 마이크로플레이트 판독기(Thermo Fisher Scientific, Madrid, Spain)를 사용하여 450nm에서 광학 밀도(OD)를 측정했습니다. 추가 조사에 사용된 BP의 농도는 CCK-8 분석 결과를 기반으로 선택되었습니다. Ki-67 염색의 경우 EMSC(1 × 10 4 )를 24웰 플레이트에서 배양하고 Ki-67(토끼 다클론성; 카탈로그 번호 ab15580; abcam; 1:300)에 대한 면역형광으로 염색했습니다. DAPI는 핵을 염색하는 데 사용되었습니다. 이미지는 형광 현미경(배율, 200배, eclipse Ti, nikon Corporation)으로 캡처하고 Image Pro Plus 소프트웨어로 분석했습니다.
골형성 분화를 위해 EMSC를 3,000 cells/cm 2 밀도로 시딩했습니다. 70% 합류까지 성장 배지에서 배양하였다. 그런 다음 세포를 2주 동안 골형성 분화 배지로 유도하였다. 특히, β-Sodium glycerophosphate의 영향을 피하기 위해 골형성 분화 배지에 10% FBS, 0.1mM dexamethasone, 0.2mM l-ascorbic acid(Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)를 첨가했지만 β-Sodium glycerophosphate가 아닌 β-Sodium glycerophosphate. 분화를 유도한 후, ALP(alkaline phosphatase) 및 Alizarin red 염색 및 RT-qPCR을 사용하여 EMSC의 골형성 분화에 대한 BP의 영향을 평가했습니다. EMSC를 2 × 10<의 밀도로 파종했습니다. 섭>5 세포/웰을 6웰 플레이트에 넣고 골형성 배지와 함께 배양합니다. 제조업체의 지침에 따라 14일째에 ALP 염색 키트(Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute)를 사용하여 ALP 염색을 평가했습니다. Alizarin red S 염색을 적용하여 인산칼슘 침착을 시각화했습니다. 간단히 말해서, 고정된 세포를 탈이온수로 다시 세척하고 PBS 중 1ml/웰의 Alizarin red 염색 용액(0.5%(w/v) Alizarin Red S(Sigma-Aldrich))과 함께 37°C에서 10분 동안 인큐베이션했습니다. 용액을 제거하고 샘플을 탈이온수로 다시 세척했습니다. 필드당 석회화된 결절을 나타내는 양성 염색 영역을 Image-Pro plus 소프트웨어로 계산하고 각 대조군으로 정규화했습니다.
RT-qPCR은 이전에 설명한 대로 수행되었습니다. 간단히 말해서, 전체 RNA는 단일 배양에서 분리되거나 제조업체의 지침에 따라 RNA 정제 키트(TaKaRa, 일본)를 사용하여 분류되었습니다. 2 마이크로그램의 mRNA는 cDNA 합성 키트(Fermentas)를 사용하여 cDNA로 역전사되었습니다. RT-PCR에 사용된 프라이머는 표 1에 표시된 Nanjing GenScript Bioengineering Technology and Services Co., Ltd(Nanjing, China)에서 설계 및 제작했습니다. RT-PCR은 SYBR Green/Fluorescein qPCR Master Mix 키트(Fermentas)를 사용하여 조작되었습니다. ABI Prism 7500 시스템. 데이터는 상대 발현 수준을 나타내기 위해 글리세르알데하이드 3-인산 탈수소효소(GAPDH)로 정규화되었습니다. 모든 측정은 3회 수행되었습니다.
배양된 세포를 PBS로 2회 세척한 다음 포스파타제 및 프로테아제 억제제 칵테일을 함유하는 RIPA 용해 완충액으로 30분 동안 얼음 위에서 용해시켰다. 총 TG2를 수집하기 위해 6-웰 플레이트의 세포 용해물 및 ECM을 세포 스크레이퍼로 수집했습니다. 플레이트를 PBS로 세척하고 세포 세척액도 수집했습니다. 12,000 × g에서 원심분리하여 상층액으로부터 용해물을 수확했습니다. 5분 동안 동일한 부피의 SDS 로딩 버퍼와 혼합한 다음 5분 동안 끓입니다. BCA 단백질 분석 키트(Beyotime, Shanghai, China, P0012)를 사용하여 단백질 농도를 결정했습니다. 단백질을 RIPA 용해 완충액에서 추출하고, 나트륨 도데실 설페이트(SDS) 폴리아크릴아미드 겔에서 분리하고, 전기영동으로 니트로셀룰로오스 막(Millipore, LA, USA)으로 옮겼습니다. 멤브레인은 0.5% Tween 20(Suolaibao, Beijing, China)을 포함하는 0.01M Tris-완충 식염수(TBS)에서 1% 소 혈청 알부민(BSA)으로 차단되었고 항-TG2(1:200; sc-48387, Santa Cruz Biotechnology, Inc.), 항-FN(1:500; cat. no. BA1772; Wuhan Boster Biological Technology, Ltd.) 및 항-LN(1:500; 카탈로그 번호 BM4921; 무한 Boster Biological Technology, Ltd.), 항-OCN(1:200; sc-390877, Santa Cruz Biotechnology, Inc.), 항-OPN(1:200; sc-73631, Santa Cruz Biotechnology, Inc.), 항- COL I(1:500, 카탈로그 번호 BA0325, 무한 보스터 생물 기술, 유한 회사), 4°C에서 12시간 그런 다음 막을 실온에서 2시간 동안 양고추냉이 퍼옥시다제-접합 염소 항토끼-IgG(1:5000; Boster, 무한, 중국)와 반응시켰다. 단백질 밴드는 Pierce ECL Plus 기질(Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 시각화한 다음 Chemiluminescence Imaging System(Clinx Science Instruments, Shanghai, China)으로 스캔했습니다.
TG2의 관련성을 확인하기 위해 EMSC에서 TG2 억제 실험을 수행했습니다. 중화 실험은 항-TG2 중화 항체(BD Biosciences, San Diego, CA)로 수행되었습니다. 세포를 24시간 동안 정상 배양 배지와 함께 6웰 플레이트에 시딩하고 항-TG2 항체(10μg/ml)로 처리했습니다. 동시에 통제 그룹이 설정되었습니다. 6-well plate에 24시간 동안 파종한 후, BP가 포함된 골형성 배지(2μg/ml)를 사용하여 EMSC 골형성을 14일 동안 유도하고, 억제제가 포함된 배양 배지를 7일마다 새로운 골형성 배지로 교체했습니다. Alizarin red S 염색을 적용하여 인산칼슘의 침착을 시각화했습니다. 웨스턴 블로팅은 오스테오칼신, 오스테오폰틴 및 콜라겐 유형 1(각각 OCN, OPN 및 COL I 발현)의 수준을 평가하는 데 사용되었습니다.
배양된 세포를 4°C에서 8시간 동안 4% 파라포름알데히드로 고정했습니다. 고정된 세포를 PBS로 3회 세척하고 0.2% Triton X-100 및 1% BSA(Suolaibao, Beijing, China)를 포함하는 PBS에서 30분 동안 투과화했습니다. 투과화 후, 이러한 고정된 세포를 PBS로 세척한 다음 4°C에서 8시간 동안 1차 항체와 함께 배양한 다음 모든 1차 항체를 제거했습니다. 그런 다음 세포를 PBS로 3회 세척하고 이차 항체 Alexa Fluor-594(1:800, Life Technologies Molecular Probes, Carlsbad, CA, USA)와 함께 실온에서 2시간 동안 37°C에서 2시간 동안 인큐베이션했습니다. 핵은 4'6-디아미디노-2-페닐인돌([DAPI]; Sigma-Aldrich)로 대조염색되었습니다. 테스트한 모든 그룹은 면역형광 현미경으로 관찰되었습니다.
데이터는 위에서 설명한 세 가지 개별 실험에서 얻었고 평균 ± 표준 편차(SD)로 표시되었습니다. 데이터 분포 분석은 학생의 t - 처리군과 대조군 간의 차이의 유의성을 분석하기 위한 테스트. 일원 분산 분석(ANOVA)에 이어 Tukey 사후 테스트를 수행하여 그룹 간의 유의한 차이를 평가했습니다. 피 <0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다.
<섹션 데이터-제목="결과">동적 광산란(DLS)으로 측정한 BP 크기 분포는 100~200nm 범위에서 상대적으로 좁았으며 피크 값은 132nm였습니다. 결과는 그림 1A에 나와 있습니다. BP의 제타 전위는 − 23.7 ± 0.65mV로 결정되어(그림 1B), BP의 안정성을 확인했습니다. 입자의 크기는 주사전자현미경(SEM)에 의해 추가로 조사되었습니다(그림 1C). 결과는 DLS에 의한 입자 크기 분포 측정과 잘 일치합니다.
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BP의 특성화. A 흑린 나노입자(BP)의 크기 분포; 나 − 23.7 ± 0.65mV의 제타 전위를 갖는 BP의 제타 전위 보고; ㄷ BP 나노시트(BPN)의 주사 전자 현미경(SEM) 이미지. 디 BP의 라만 스펙트럼; 이 X선 회절도 및 F BP의 P 2p 고해상도 X선 광전자 분광법(XPS) 스펙트럼; 지 BP의 XPS 스펙트럼
라만 산란(그림 1D)은 362.3, 438.5 및 466.9cm −1 에서 세 개의 두드러진 피크를 나타냅니다. 평면 외 포논 모드(A 1 g ) 및 두 가지 인플레인 모드(B 2 g 그리고 A 2 g )의 BP, [17, 18], 각각. XRD(그림 1E)는 평균 결정 크기가 102.7nm인 준비된 물질의 상 순도를 보여줍니다. 회절 패턴의 확장은 개별 결정자의 나노미터 크기를 나타냅니다. P2p의 고해상도 XPS 스펙트럼(그림 1F)은 표면 산화로 인한 P-O 결합에서 비롯된 135eV의 추가 피크 외에 흑린의 P-P 결합에 해당하는 130eV의 주요 피크를 보여줍니다. BP의. BP 표면은 와이드 스캔 X선으로 검사했습니다(그림 1G).
비점막의 면역형광 염색은 네스틴 양성 EMSC가 비강 중격의 호흡기 상피 아래 고유판에 위치함을 보여주었다(그림 2A). 세 번째 계대에서 배양된 EMSC는 섬유아세포 유사 세포로 나타났고 플라스틱 판에서 빠르게 증식했습니다(그림 2B). 우리는 28일째에 알리자린 레드 염색을 통해 골형성 배지에서 골형성 분화를 평가했습니다(그림 2C). 21일째에 oil red-O 용액으로 염색하여 지방생성 유도 배지에서 지방생성 분화를 평가했습니다(그림 2D). 면역형광 염색은 거의 모든 EMSC가 도 2E에 나타낸 바와 같이 네스틴(> 95%) 및 도 2F에 나타낸 바와 같이 비멘틴(> 95%)과 같은 신경 능선 세포 마커를 발현함을 보여주었다. 줄기세포 마커의 동시발현 결과는 이러한 EMSC가 일종의 중간엽 줄기세포임을 나타냅니다.
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외배엽 간엽줄기세포(EMSC)의 식별. A 네스틴 양성 EMSC(cy3, red)는 비강 중격의 호흡 상피 아래 고유판에 위치했습니다. 나 위상차 이미지는 세 번째 계대에서 배양된 EMSC가 섬유아세포 유사 세포로 나타나고 플라스틱 플레이트에서 빠르게 증식하는 것으로 나타났습니다. ㄷ 골형성 배지에서 골형성 분화된 EMSC는 알리자린 레드로 염색되었고; 디 지방 생성 유도 배지에서 지방 생성 분화 EMSC는 오일 레드 O로 염색되었습니다. 이 , F 신경 능선 세포 마커의 면역형광 염색은 거의 모든 EMSC가 네스틴 및 비멘틴을 발현함을 보여주었다. IgG-Cy3(빨간색)은 면역형광 염색을 위한 두 번째 항체로 사용되었으며 핵은 Hoechst 33342(파란색)로 대조 염색되었습니다.
예비 실험으로 BP의 세포 독성을 평가하기 위해 CCK-8 분석을 수행했습니다. BP에 노출된 지 24시간 후 EMSC의 생존 가능성은 그림 3에 나와 있습니다. 최대 32μg/ml의 BP에 노출된 후 유의한 세포독성은 관찰되지 않았습니다. 그러나 BP에 노출되면 고용량(> 32μg/ml)에서 상당한 세포독성이 발생합니다. 핵소체와 염색체에서 Ki-67 발현은 저용량 그룹에서 관찰되었습니다(그림 4A-C). 그러나 Ki-67 양성 핵과 전체 핵 인구 사이의 비율은 처리되지 않은 대조군과 비교하여 저용량 BP 처리 EMSC에서 유의한 차이를 나타내지 않았습니다(그림 4D). 따라서 본 연구에서는 유의한 세포독성이 관찰되지 않은 다음 실험에서 2 및 4μg/ml의 BP 농도를 선택합니다.
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BP의 세포 독성. 세포를 24시간 동안 BP(0, 2, 4, 8, 16, 32, 64,128, 256, 512 µg/ml)로 처리하고 EMSC 생존력을 세포 계수 키트(CCK-8) 증식 분석(<난 =9). 데이터는 평균 ± 표준편차(SD)로 표현하였다. **p <0.01.
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BPs 처리군의 세포 증식 평가. EMSC를 24시간 동안 BP(0, 2, 4μg/ml)로 처리했습니다. 세포 증식은 항-Ki67 항체(빨간색)와 DAPI(파란색)를 이용한 면역형광 염색으로 측정하였고 병합된 이미지를 보여주었다(A –C ). 4',6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)-양성 세포 중 Ki67-양성 세포를 3개의 플레이트 각각에서 2개의 고전력 필드에서 계수하였다. 데이터는 평균 ± SD(D ).
도 5A에 나타난 바와 같이, 세포의 무기질화는 14일 동안 조건 배지를 처리한 후 Alizarin red S 염색으로 평가하였다. 칼슘 결절은 3개 군에서 모두 관찰되었으며, 대조군에는 형태가 없는 칼슘 결절이 존재하였다. 대조군과 비교하여 2 및 4 μg/ml 그룹에 침착된 칼슘 결절이 더 컸습니다(p <0.05), 그러나 치료 그룹 간에 명백한 차이가 관찰되지 않았습니다(p> 0.05) 그림 5C와 같이
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알칼리성 인산분해효소(ALP) 및 Alizarin Red 염색 분석. A 14일째에 Alizarin Red 용액으로 염색된 골형성 분화 EMSC; 나 ALP 염색은 현미경으로 시각화했습니다. ㄷ 차트는 Alizarin 적색 침착 영역의 정량화를 보여줍니다. 디 유의하게 더 높은 ALP 활성이 대조군보다 BP 처리된 EMSC 그룹에서 나타났다. 데이터는 평균 ± SD로 표현되었습니다. **p <0.01
ALP 염색은 EMSC의 골 형성 분화를 연구하기 위해 수행되었습니다. 대조군과 비교하여 2 및 4 μg/ml BP 그룹의 EMSC는 색상이 더 짙었으며(그림 5B), 이는 BP의 추가가 EMSC에서 ALP 발현의 향상을 야기했음을 시사합니다. BP로 처리된 세포는 7일째에 대조군보다 더 높은 ALP 활성을 보였습니다(p> 0.05), 2와 4μg/ml 사이에는 유의한 차이가 관찰되지 않았습니다(p> 0.05) 그림 5D와 같이
런트 관련 전사 인자 2(RUNX 2), ALP, COL 1, OCN, OPN 및 뼈 형성 단백질 2(BMP-2)를 포함한 주요 분화 마커는 그림 6과 같이 14일째에 분석되었습니다. 7일째에 이 모든 유전자 마커의 3개 그룹에서 세포가 발견되었습니다. 2 및 4μg/ml 그룹 간에 유전자 발현의 명백한 차이는 발견되지 않았습니다. 그러나 대조군 세포에 비해 BP 처리 세포에서 상기 유전자의 발현이 유의하게 증가하였다.
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BP는 EMSC의 골형성을 강화합니다. EMSC는 0μg/ml, 2μg/ml, 4μg/ml BP가 포함된 골형성 배지에서 14일 동안 성장했습니다. EMSC의 골형성에 관여하는 유전자의 발현은 정량적 역전사효소 중합효소 연쇄 반응(RT-qPCR)에 의해 정량화되었습니다. **p <0.01, *p <0.05.
인테그린 매개 분화 및 ECM 침착에 대한 TG2의 상당한 영향이 광범위한 세포에 대해 입증되었기 때문에, 우리는 BP가 TG2 발현의 상향 조절을 통해 EMSC의 골 형성 분화를 촉진하는지 여부를 조사했습니다. 그림 7에서 볼 수 있듯이 BP 처리 그룹에서 세포 내 및 세포 외 TG2의 명백한 상향 조절을 감지했습니다. 2 및 4 μg/ml BP 처리 세포에서 라미닌(LN)과 피브로넥틴(FN)은 대조군보다 높은 수준이었습니다(그림 7A). BP에 노출된 EMSC는 대조군에 비해 TG2 수치가 약 2배 증가했지만 BP 처리군 간에는 유의한 차이가 관찰되지 않았습니다(그림 7B). 거대 분자 단백질로서 항 TG2 항체는 세포막을 통과하지 못했습니다. 따라서 세포 외 TG2는 항체에 의해 차단되어 다양한 성장 인자와 ECM 단백질을 가교하지 못했습니다. Alizarin Red S(그림 8A, C) 결과는 항-TG2가 칼슘 및 ECM 침착의 BP 매개 증가를 현저하게 억제함을 보여주었습니다. 한편, 도 8D에 나타난 바와 같이 항-TG2는 BP 처리된 세포의 ALP 활성 증가를 유의하게 억제하였다. 또한, anti-TG2는 OCN, OPN 및 COL I을 포함한 골기질 단백질 발현에 대한 BP의 영향을 효과적으로 제거했습니다(그림 9).
Transglutaminase 2 (TG2) was involved in the osteogenic differentiation of EMSCs. EMSCs were incubated with BPs (2 and 4 μg/ml) for 14 days, and fibronectin (FN), LN, and TG2 levels were assessed by immunoblotting. Data were expressed as mean ± SD. **p < 0.01; *p < 0.05.
Osteogenic differentiation of EMSCs with TG2 neutralizing antibody. A ALP staining. B ARS staining performed to examine extracellular mineralization. C Quantitative ALP analysis. D Quantitative Alizarin red staining analysis. **p < 0.01
Anti-TG2 inhibited BP-induced EMSC osteogenic differentiation. A Representative western blots of osteoponin, osteocalcin, and collagen 1 (OPN, OCN, LN, FN, and COL I, respectively) in differentiated EMSCs following treatment with 2 μg/ml BPs and 2 μg/ml anti-TG2 or 2 μg/ml BPs alone. B Quantification of OPN, OCN, and COL I protein expression. Data were expressed as mean ± SD. **p < 0.01; *p < 0.05
To the best of our knowledge, modification of phosphorus was first exhaustively studied as early as 1914; unfortunately, these studies did not receive much attention for an entire century [27]. Phosphorus is one of the essential elements making up about 1% of the total body weight as a bone component in the human body [28], while most of the other materials cannot warrant such a natural biocompatibility. In 2014, BP was introduced as a new member of the 2D layered materials.
In this study, the BP nanoparticles were prepared on a large scale from bulk BP crystals by using an improved mechanical grinding and continuous ultrasound method. Compared with other methods, this ultrasound and mechanical grinding synthesis is facile and efficient and enables production of BPs on a large scale. For characterization of BPs, SEM was carried out to examine the morphology of BPs. SEM images illustrated that BPs were successfully synthesized, and the typical sizes of BPs are about 100 to 150 nm. The size of particles was further investigated using DLS in the relatively narrow range around 133 nm. The result of SEM corresponded well with the measurement of particle size measurements based on DLS. Interestingly, previous studies demonstrated that BP with larger lateral size has higher cytotoxicity than small BP, while ultra-small BPs were even considered nontoxic up to the high concentration of 1000 μg/ml [29, 30]. Thus, for biomedical applications, the BP nanomaterials still need further study. In addition, Raman scattering revealed the presence of three prominent peaks at 361.5, 437.1, and 465.2 cm −1 that were associated with the out-of-plane phonon mode (A 1 g ) and two in-plane modes (B 2 g and A 2 g ) of BPs. These results were consistent with previous reports [31] in which showed that the BPs had been prepared successfully from bulk BP. XRD shows the phase purity of the prepared BPs. Broadening of the diffraction pattern indicates the nanometer size of individual crystallites.
To evaluate the stability and degradation rate of BPs, Wang and co-workers performed an experiment in which normalized absorption spectra of the BP nanosheets were dispersed in water and exposed to air. After 6 days, they found that the absorbance of the BP nanosheets at 450 nm decreased by 43% compared to the initial value, indicating that BP is easily degraded in the physiological environment [32]. Also, it is well-known that BP is sensitive to water and oxygen, but this shortcoming is considered a merit for biomedical applications. Because of these special characteristics compared with other biomaterials, BPs could potentially avoid material accumulation in human body and then reduce cytotoxicity caused by such material noumenon.
Since MSCs play key roles in bone formation, there is no doubt that transplanting MSCs in animal models of bone defects enhance bone regeneration and promotes functional recovery via BMSC acquisition [33]. Unfortunately, BMSC acquisition procedures are painful for the donor and frequently cause surgical site infection, and the number of harvested BMSCs is low [34]. Previous studies from our laboratory and other reports have shown that EMSCs could be isolated from several adult tissues, such as dental pulp and the nasal mucosa, without causing invasive injury. Moreover, EMSCs were easily induced into osteoblasts, rendering those cells as promising seed cells for bone tissue engineering. Therefore, EMSCs were used in this study. We attempted to obtain the maximum safety BP concentration for EMSCs. As shown in the results, we achieved the maximum safe concentration of BPs (less than 64 μg/ml). The concentrations of 2 and 4 μg/ml of BPs were chosen for further study to avoid any possible potential toxic. The Ki-67 assay was also used to quantify and evaluate EMSC proliferation in these samples after treating these cells with BPs (2 and 4 μg/ml) for 24 h. We did not observe any statistically significant suppression of EMSCs growth in the case of BPs. Meanwhile, our results indicate that during treatment with safe concentrations of BPs, promotion of EMSCs proliferation also occurred.
Some reports have shown that the concurrent binding of BP and calcium ions may benefit osteogenic differentiation, thereby leading to enhanced bone regeneration [35, 36]. To investigate these effects, in vitro EMSCs exposed to BPs were used in osteogenic differentiation experiments. Interestingly, the results of the ALP test and Alizarin Red S staining show that exposure to BPs could promote rather than compromise osteogenetic differentiation of EMSCs compared to the control group. Similar findings have been reported in which phosphorus-rich materials can stimulate mineralization and bone regeneration. Co-expression of osteogenesis-related genes, including ALP, OPN, OCN, COL1, and RUNX2, in differentiated EMSCs was detected at days 7 and 14 by RT-qPCR. Indeed, the expression levels of these osteogenic genes significantly increased in differentiated EMSCs treated with BPs, also providing confirmation of the osteogenic potential of the BPs. Similar results were reported in which BP could induce both the proliferation and osteogenic differentiation of human pre-osteoblast cells. Together these results indicate that the BPs were able to induce osteogenic differentiation of EMSCs.
It can be asked, “How do BPs promote osteogenetic differentiation of EMSCs?” It is well accepted that phosphorus can capture Ca 2+ in vivo to form calcium phosphate deposits that accelerate bone regeneration, while BP can be the resource of phosphorus ions [36]. Tong et al. believes that BP generate mild heat (40–42 °C), which causes up-regulation of heat shock protein (HSPs) expression and stimulates bone regeneration [37, 38]. Moreover, in this study, the upregulated activation of TG2 levels was also observed in BPs treatment groups. To the best of our knowledge, TG2 has important enzymatic and non-enzymatic functions at these locations in which it crosslinks various ECM proteins and modulates the interactions of cells with the ECM and soluble growth factors by non-covalent interactions with and regulation of integrins [39,40,41]. Obviously, the BPs can react strongly with oxygen and water and finally degrade to non-toxic phosphate in aqueous solutions, which is a crucial component of ATP. Nakano Y et al. reported that ATP can act as a significant phosphate (Pi) source for mineralization in MC3T3-E1 osteoblast cultures, indicating that ATP-hydrolyzing enzymes could induce mineral deposition [42]. They also found that TG2 could not only act as a phosphatase but could be involved in ATP hydrolysis in the osteoblast cultures thus further contributing to the elevation in Pi levels required for mineral deposition, which may be beneficial to EMSC energy metabolism. This process may be part of the contribution that BPs makes toward enhancement of EMSC osteogenic differentiation. On the other hand, thanks to TG2 bio-functions, a wide variety of ECM adhesion proteins, including LN, COL I, and FN, could maintain a stable state. Indeed, in the present study, we observed that ECM (FN, COL I, and LN) were significant higher in BP-treated EMSC groups. BPs provide a favorable ECM microenvironment for promoting greater osteogenic EMSC differentiation and proliferation.
Until now, no secretory signal sequences and hydrophobic or transmembrane domains have been clearly identified in TG2 because the protein is not localized in the endoplasmic reticulum (ER)/Golgi compartments [39, 43], and only few studies reported about these factors that control TG2’s secretion. Therefore, it remains unclear as to the exact mechanism of BP regulation of expression patterns of TG2 in the progress of EMSC osteogenic differentiation.
In the present study, BPs were successfully fabricated using mechanical grinding and continuous ultrasound method. At bio-safe concentrations, BPs activated TG2, and promoted the expression of ECM, which further promoted osteogenic differentiation of EMSCs. From these results, we can conclude that BPs would be suitable for incorporation into tissue-engineered scaffolds that utilize EMSCs to repair bone defects. Although our research highlights the great potential of BPs in nano-biomedicine, large-scale preclinical and clinical studies concerning its safety are needed before any clinical applications are established.
The datasets generated during and/or analyzed during the study are available from the corresponding author on reasonable request.
Black phosphorus nanoparticles
Ectodermal mesenchymal stem cells
Transglutaminase 2
Two-dimensional
Extracellular matrix
Dimethyl sulfoxide
N -Methyl-2pyrrolidone
Phosphate-buffered saline
Dulbecco's modified Eagle's medium/nutrient mixture F12
Fetal bovine serum
Sprague Dawley
Scanning electron microscopy
X-ray photoelectron spectroscopy
Cell counting kit
Optical density
Reverse transcriptase polymerase chain reaction
Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase
Bovine serum albumin
Tris-buffered saline
4′6-Diamidino-2-phenylindole
Dynamic light scattering
나노물질
초록 나노하이드록시아파타이트(nano-HA)는 재생의학 분야에서 상당한 주목을 받고 있다. 내피 세포(EC)-중간엽 줄기 세포(MSC) 상호 작용은 뼈 재건에 필요하지만 나노 HA가 이 과정에서 상호 작용하는 방식은 아직 알려지지 않았습니다. 여기에서 우리는 EC에 의해 중재되는 간접 공동 배양 모델을 사용하여 MSC에 대한 HA 나노 입자(HANP)의 세포 독성 및 골유도 효과를 조사하고 기본 메커니즘을 강조했습니다. 준세포독성 용량에서 HANP는 MSC의 광물화된 결절 및 알칼리성 포스파타제 생산뿐만 아니라 조골 세포 유전자의
초록 심근염은 효과적인 치료 없이 심근의 국소화 또는 확산 염증을 특징으로 하는 질병이다. 이 연구는 조절을 통해 바이러스성 심근염(VMC) 쥐의 심근 섬유증 및 상피-중간엽 전이(EMT)에 대한 골수 중간엽 줄기세포 유래 엑소좀(BMSC-Exo)에서 분비되는 microRNA-133(miR-133)의 조절 메커니즘을 탐구했습니다. 마스터마인드 1(MAML1). 쥐의 BMSC를 분리 배양하여 면역 표현형과 골 형성 및 지방 형성 능력을 확인하고 BMSC-Exo를 추출하여 확인했습니다. 초원심분리를 통해 엑소좀을 얻었고, 투과전자현미