골수 줄기세포 유래 엑소좀 miR-133a, MAML1 억제로 바이러스성 심근염에서 섬유증 및 EMT 완화

요약

심근염은 효율적인 치료법 없이 심근의 국소적 또는 미만성 염증이 특징인 질환입니다. 본 연구에서는 골수 중간엽 줄기세포 유래 엑소좀(BMSC-Exo)에서 분비되는 마이크로RNA-133(miR-133)이 마스터마인드 유사 1(MAML1) 조절을 통해 바이러스성 심근염(VMC) 쥐 모델에서 심근 섬유증과 상피-중배엽 이행(EMT)에 미치는 조절 기전을 탐구했습니다. 쥐 BMSCs를 분리 배양해 면역 표현형과 골아세포/지방세포 분화 능력을 확인하고, BMSC-Exo를 추출해 동정했습니다. 엑소좀은 초원심분리법으로 얻었으며 투과전자현미경과 웨스턴 블롯으로 동정했습니다. 콕사키 B3 바이러스(CVB3)를 쥐에 복강 주사해 VMC 모델을 제작했고, 심근세포를 분리 배양해 동물 실험과 동일하게 그룹화했습니다(NC^Exo, Ad-miR-133a^Exo, Adas-miR-133a^Exo). 체내 및 체외 실험으로 엑소좀 miR-133a와 MAML1이 염증, 아폽토시스, EMT, 섬유증, 세포 생존율에 미치는 역할을 규명했습니다. 이중 루시페라아제 리포터 유전자 분석으로 miR-133a와 MAML1의 표적 관계를 검증했습니다. BMSC-Exo는 VMC 쥐에서 miR-133a 발현을 높여 심장 기능과 심근 섬유증을 효과적으로 개선하고, 심근세포 생존율을 증가시키며 EMT 과정을 억제했습니다. 엑소좀 내 miR-133a 과발현은 이러한 개선 효과를 강화했습니다. miR-133a 억제는 BMSC-Exo의 VMC 쥐에 대한 효과를 효과적으로 역전시켰습니다. miR-133a는 MAML1을 표적으로 합니다. MAML1 억제는 VMC 쥐에서 심장 기능과 심근 섬유증을 개선하고 miR-133a 억제 엑소좀의 VMC 쥐에 대한 효과를 역전시켰습니다. 본 연구는 엑소좀 miR-133a 고발현이 MAML1 하향 조절을 통해 VMC 쥐에서 심근 섬유증과 EMT를 억제함으로써 심근염 진행을 억제함을 시사합니다.

서론

심근염은 심장 근육 세포의 염증성 질환으로 간주됩니다. 여성보다 남성에서 더 흔하게 발생합니다. 바이러스성 심근염(VMC)은 확장성 심근병증(DCM)과 젊은 층 돌연사의 주요 원인입니다. 심근염의 임상 양상은 무증상부터 바이러스와 면역 세포에 의한 심각한 심근 파괴로 인한 심인성 쇼크와 부정맥까지 다양합니다. 바이러스, 박테리아, 클라미디아, 리케차, 진균, 원생동물 등 다양한 감염원과 비감염 유발 인자가 심근염을 일으킬 수 있으며, 그중 바이러스 감염이 가장 흔한 원인입니다, 특히 소아에서 그렇습니다. 콕사키 B3 바이러스(CVB3)는 심근염을 유발하는 가장 중요한 바이러스로, VMC 발병 기전에서 산화 스트레스 반응과 아폽토시스를 유발하지만 VMC 특이 치료법은 아직 보고되지 않았습니다. 또한 VMC 발병 기전이 잘 규명되지 않았고 정확한 임상 치료법도 부족하므로 새로운 표적이 시급합니다.

마이크로RNA(miRNA)는 단백질 암호화 유전자 발현을 조절하는 내인성 비암호화 RNA입니다. 심장 특이적 miRNA 중 하나인 miR-133a는 심장 발달과 심근경색(MI) 등 일부 심혈관 질환에 관여합니다. 또한 만성 샤가스병 심근병증에서 비정상적으로 발현되는 miRNA 중 하나입니다. 게다가 miR-133a 수치는 염증, 좌심실 기능, 염증성 심근병증의 임상 예후와 연관됩니다. miRNA는 쥐와 인간 비만세포 유래 엑소좀에서 발견되었습니다. 엑소좀은 대부분의 세포 종류에서 분비되는 나노크기 소포로 다양한 생체액에서 발견됩니다. 엑소좀은 화물을 수신 세포로 전달해 수신 세포의 생화학적 구성과 신호 전달 경로를 변화시킬 수 있습니다. 변형된 엑소좀 miRNA가 CVB3 유도 심근염 발병 기전과 연관됨이 보고되었습니다. 저산소 조건 처리된 골수 중간엽 줄기세포 유래 엑소좀 miR-125b-5p가 심근세포 아폽토시스 감소와 허혈성 심장 복구 촉진에 기여함이 밝혀졌습니다. 또한 MSC 유래 엑소좀 miR-25-3p가 심근세포 아폽토시스와 염증 반응 감소로 심근경색을 완화함이 보고되었습니다. 흥미롭게도 엑소좀 심장 발현 miR-133a가 심장 트로포닌 I와 연관됨이 알려졌습니다. 마스터마인드 유사 1(MAML1)은 본 연구에서 miR-133a의 하류 표적 유전자로 교차 스크리닝되었으며, 심근 허혈/재관류(I/R) 손상에 관여함이 보고되었습니다. 또한 최근 연구에서 MAML1 녹다운이 간 섬유증에서 항섬유화 기능을 가짐이 언급되었습니다.

선행 연구들에 비추어 BMSC 유래 엑소좀 miR-133a가 심근염을 매개할 수 있는지 의문이 제기되었습니다. 따라서 본 연구는 BMSC 유래 엑소좀(BMSC-Exo)이 전달하는 miR-133이 MAML1 조절을 통해 VMC 쥐에서 심근 섬유증과 상피-중배엽 이행(EMT)을 개선한다는 가설로 시작되었습니다.

재료 및 방법

윤리적 승인

본 연구는 저장대학 의학부 제4부속병원 실험동물 관리 및 사용 위원회 승인을 받았습니다. 동물은 인도적으로 처리되었습니다.

BMSCs 분리

실험 동물은 성숙한 특정 병원체 무감염(SPF) 등급 스프라그-도ली(SD) 수컷 쥐(저장대학 의학부 실험동물 센터, 저장, 중국)였습니다. 쥐를 펜토바르비탈 나트륨 복강 주사로 안락사시키고 75% 알코올로 멸균했습니다. 초청결 작업대에서 대퇴골과 경골을 꺼내 근육과 결합 조직을 제거하고 골수강을 저당 둘베코 변형 이글 배지(DMEM)로 반복 세척했습니다. 액을 원심분리해 침전물을 모아 재현탁하고 24시간 배양했습니다(배지는 2-3일마다 교체). 증식기에 도달하면 0.25% 트립신(기브코, 칼스배드, 캘리포니아, 미국)으로 BMSCs를 떼어내 원심분리 후 MSC 배양액(사이아젠 바이오사이언스, 광저우, 중국)에 재현탁했습니다. 1:2 비율로 계대 배양했으며, 위 과정을 반복해 4번째 계대 BMSCs를 후속 실험에 사용했습니다.

BMSCs 동정

증식기 4번째 계대 BMSCs의 표면 항원을 유세포 분석기로 동정했습니다. 0.25% 트립신(1 mL, EDTA 함유)으로 BMSCs를 떼어내 원심분리, 적절한 인산완충생리식염수(PBS)에 재현탁해 151 g 원심분리했습니다. BMSCs를 2% 신선한 태아소혈청(FBS, 기브코) 함유 PBS에 재현탁해 단일 세포 현탁액을 만들었습니다. FITC-CD34, PE-CD29, PE-CD44 단클론 항체(각 5 μL, BD 바이오사이언스, 프랭클린 레이크스, 뉴저지, 미국)를 세포 현탁액(100 μL)과 배양 후 151 g 원심분리, 1% 파라포름알데히드 함유 PBS 500 μL에 재현탁해 30분 고정했습니다. 동형 대조군 단클론 항체로 배경 마커를 동정했습니다.

유세포 분석: 단일 세포 현탁액을 고정하고 151 g 원심분리. BMSCs를 1% 파라포름알데히드 함유 PBS에 재현탁해 MACS Quart 유세포계로 분석하고 해당 소프트웨어로 분석했습니다.

BMSCs 골아세포/지방세포 분화 유도

4번째 계대 BMSCs를 200 cells/mL로 6웰 플레이트에 파종했습니다. 60-70% 컨플루언시 도달 시 골아세포 유도액과 지방세포 유도액(사이아젠 바이오사이언스)을 첨가했습니다. 다른 두 웰은 대조군으로 유도액을 첨가하지 않았습니다. 14일 유도 후 4% 파라포름알데히드로 고정했습니다. 분화된 골아세포와 지방세포를 알리자린 레드 염색과 오일 레드 O 염색(우한 풀란데 생물기술, 우한, 중국)으로 염색해 현미경으로 관찰했습니다.

엑소좀 분리 및 동정

4번째 계대 BMSCs를 48시간 배양해 상등액을 수확했습니다. 800 g, 2000 g 원심분리, 0.22 µm와 100,000 MW 필터 멤브레인 여과, 100,000 g 원심분리로 침전물을 수집했습니다. 침전물을 PBS에 재현탁해 100,000 g 재원심분리해 엑소좀 침전물을 얻었습니다. BMSC-Exo PBS 현탁액을 비신코닌산(BCA)법으로 농도 검출하고, 엑소좀 표지 단백질(CD63, CD81, CD9) 웨스턴 블롯으로 검출했습니다(프로테인텍, 시카고, 일리노이, 미국).

재조합 아데노바이러스 감염으로 BMSCs miR-133a 유전자 조작

BMSCs를 오버나이트 계대했습니다. 정상 대조군(동량 PBS), miR-133a 음성 대조군(NC), miR-133a 과발현(Ad-miR-133a), miR-133a 저발현(Adas-miR-133a)(한바이오 바이오테크, 상하이, 중국)을 100 MOI(multiplicity of infection)로 BMSCs에 형질주입했습니다. BMSCs를 배양하고 해당 엑소좀(NC^Exo, NC^Exo, Ad-miR-133a^Exo, Adas-miR-133a^Exo)을 초원심분리법으로 얻었습니다.

쥐 VMC 모델 구축 및 실험 동물 그룹 분류

성숙한 수컷 SPF 등급 SD 쥐를 10그룹으로 나누고 각 그룹 8마리씩 배정했습니다. 콕사키바이러스 B3(CVB3)는 중국 의학과학원 의학생명공학연구소(베이징, 중국)에서 제공받았습니다.

CVB3(10 mg/kg)를 복강 주사하면서 PBS 또는 BMSC-Exo(100 µg)를 꼬리 정맥 주사했습니다. 정상 대조군 쥐에는 CVB3 배양액과 PBS를 주사했습니다. 10 mg/kg CVB3 주사 쥐에는 추가로 PBS, MSC^Exo, NC^Exo, Adas-miR-133a^Exo, Ad-miR-133a^Exo, si-NC, si-MAML1(리보바이오, 광저우, 중국)을 주사했습니다.

쥐를 7일간 지속 주사하고 안구 혈액을 채취했습니다. 혈액을 원심분리해 혈청을 분리, 분주, -20°C 보관했습니다. 쥐 안락사 후 심장 시료를 채취해 10% 포르말린 고정, 단계별 알코올 탈수, 자일렌 투명화, 파라핀 포매, 절편 제작해 조직학적 관찰용으로 사용했습니다. 일부 절편은 -80°C에 분자생물학 실험용으로 보관했습니다.

심장초음파 검사

바이러스 주사 7일째 펜토바르비탈 나트륨 25 mg/kg 복강 주사로 마취했습니다. 완전 마취 후 심전도 기계 사지 유도 전극 바늘을 쥐 사지 말단에 피하 삽입해 사지 유도 심전도 기록했습니다. 쥐를 좌측 약간 누운 앙와위 고정, 가슴 제모, II 유도 심전도 연결해 흉골 좌측 사심방 심실 단면에서 대동맥 혈류 맥파 도플러 스펙트럼을 얻었습니다. 지표: 좌심실 후벽 두께(LVPW), 좌심실 수축기 말기 내경(LVIDs), 좌심실 단축률(FS), 좌심실 박출률(LVEF).

헤마톡실린-에오신(HE) 염색

조직을 4% 파라포름알데히드 고정, 탈수, 투명화, 파라핀 포매. 4 µm 절편을 탈랍, 헤마톡실린(서비스바이오, 우한, 중국) 염색, 1% 염산 알코올 탈색, 청색화, 에오신 염색, 탈수, 자일렌 투명화, 중성 검 봉입, 광학현미경(올림푸스, 도쿄, 일본)으로 관찰했습니다.

매슨 콜라겐 염색

파라핀 절편을 탈랍, 헤마톡실린 2분 미만 염색, 리춘 마젠타 용액 염색, 0.5% 빙초산 용액 급속 세척. 1% 인산알루미늄 수용액 염색, 암적색→밝은 적색→분홍색 변화 관찰, 현미경 관찰. 아닐린 블루(풀란데) 염색, 관례적 자일렌 탈수, 봉입. 의료 영상 분석 소프트웨어 Image-Pro Plus 6.0으로 콜라겐 섬유 양성 염색 면적 측정, 콜라겐 부피 분율(CVF) = 콜라겐 면적/전체 시야 면적 계산. 염색 위치와 색으로 콜라겐 섬유 구분(심근세포는 적색, 콜라겐 섬유는 세포 간 간격의 청색 띠 또는 균질 구조).

TUNEL 염색

파라핀 절편을 탈랍, 시트르산 완충액에 넣고 350 W로 10분 가열. 50 µL TUNEL 용액 첨가, 50 µL 전환 효소-퍼옥시데이스 결합, DAB 발색, 현미경 관찰. 헤마톡실린 대조 염색, 95% 에탄올 I-II, 무수 에탄올 I-II, 자일렌 I-II, 봉입. 광학현미경으로 분석했습니다.

ELISA

종양괴사인자 α(TNF-α), 인터루킨(IL)-1β, IL-6를 ELISA 키트(보스터 생물기술, 우한, 중국)로 검출했습니다. 안구 혈액을 604 g 원심분리해 상층 혈청 수집. 세포 배양 상등액 원심분리 상등액을 세포 실험용으로 검출. 시료 희석 표준에 7개 농도 기울기 설정. 블랭크 웰에 시료 희석액, 다른 웰에 테트라메틸벤지딘(TMB), 각 농도당 중복 웰 설정. 시료 웰에 50 µL 시료 희석액과 시료 순차 첨가. TMB 웰 제외 각 웰에 100 µL 1차 항체 1시간 반응, 300 µL 0.01 M TBS와 100 µL 아비딘-비오틴-퍼옥시데이스 복합체 작동 용액 반응(TMB 웰 제외). 각 웰에 300 µL 0.01 M TBS와 100 µL TMB 첨가. 광학 밀도(OD) 값과 각 웰 농도 즉시 측정, 표준 곡선 작성.

RT-qPCR

심근 조직과 심근세포에서 miR-133a, 콜라겐 I, 콜라겐 III, α-SMA, TGF-β1, CTGF, E-카드헤린, FSP-1 발현을 RT-qPCR로 검출했습니다. 심근세포나 심근 조직에서 총 RNA 추출 후 RNA 추출 키트(타카라, 다롄, 중국)로 cDNA 역전사. RT-PCR 프라이머는 인비트로젠(광저우, 중국)에서 합성, 서열은 표 1에 표시. 글리세랄데히드-3-인산 탈수소효소(GAPDH) 또는 U6을 로딩 컨트롤로 2^-ΔΔCt법으로 상대적 정량 유전자 발현 분석.

웨스턴 블롯 분석

쥐를 마취 안락사시키고 심근 조직을 액체 질소에서 동결 분쇄했습니다. 단백질 분해 효소 억제제 페닐메탄설포닐플루오라이드 스톡 용액을 세포 용해 버퍼와 1:100 비율로 혼합(베이오타임 바이오테크, 상하이, 중국). 혼합 용액으로 시료 용해, 세포 단백질 추출. BCA 키트로 총 단백질 농도 측정. 시료를 5× 로딩 버퍼와 4:1 혼합, 100°C 수조 10분, 얼음 욕, 원심분리. 전기영동 분리, 폴리비닐리덴 플루오라이드 멤브레인(서비스바이오)에 전기전사. 5% 탈지분유로 블로킹, 1차 항체 CD63, CD81, CD9(토끼 항쥐 폴리클로날, 프로테인텍, 1:100), MAML1(ab65090, 압캠, 매사추세츠, 미국, 1:1000), GAPDH(산타크루즈 바이오테크, 캘리포니아, 미국, 1:1000) 반응. 2차 항체 퍼옥시데이스 표지 IgG(셀 시그널링 테크놀로지, 베벌리, 매사추세츠, 미국, 1:1000) 반응, 향상된 화학발광 반응 용액(피어스, 록포드, 일리노이, 미국) 침지. GAPDH를 로딩 컨트롤로 ImageJ2x 소프트웨어로 단백질 인쇄 이미지 분석.

심근세포 배양 및 계대

생후 3-5일 SD 쥐(저장대학 의학부 실험동물 센터, 저장, 중국)를 사용했습니다. 심실 부위를 예냉 행크스 균형 염액으로 세척, 잘게 자르고 0.25% 트립신으로 분리. 10% 완전 배지 적량 첨가해 분리 중단, 151 g 원심분리. 20% FBS 함유 DMEM으로 세포 재현탁. 차등 부착법으로 심근세포 정제, 트립란 블루 염색으로 생존율 관찰, 생존 심근세포 배양. 24시간 후 부착해 박동 시작, 72시간 후 가성족 확장.

심근세포 VMC 모델 구축

증식기 4번째 계대 심근세포를 선정해 MSC^Exo, NC^Exo, Adas-miR-133a^Exo, Ad-miR-133a^Exo로 감염시켰습니다. 100 TCID50 CVB3 바이러스 용액(100 µL)을 세포에 첨가해 세포 VMC 모델 유도. 동량 유지 배지를 대조군에 첨가, 감염 1시간 후 해당 엑소좀을 심근세포에 첨가해 47시간 배양.

CCK-8 분석

CCK-8 세포 검출 키트(베이오타임)로 심근세포 생존율 검출. 증식기 세포를 0.25% 트립신으로 떼어내 96웰 플레이트에 2.5×10⁴ cells/well 파종. CCK-8 용액(10 µL/well) 첨가, 1-4시간 추가 배양, 마이크로플레이트 리더로 OD_{450 nm} 측정.

유세포 분석

Annexin V-APC/프로피듐 아이오다이드(PI) 이중 염색법으로 세포 아폽토시스 검출. 세포 원심분리, 250 µL 바인딩 버퍼(4 mL 바인딩 버퍼 + 12 mL 탈수)에 재현탁, 1×10⁶ cells/mL 조정. 100 µL 세포 현탁액에 5 µL Annexin V-APC(BD 바이오사이언스), 5 µL PI 용액(BD 바이오사이언스) 첨가, 유세포계 로드, 컴퓨터 자동 분석.

이중 루시페라아제 리포터 유전자 분석

MAML1 3' 비번역 영역(UTR) 야생형(wt) 또는 돌연변이형(mut) 서열을 pGL3-M 벡터(프로메가, 위스콘신, 미국)에 클로닝해 MAML1-3'UTR-wt 또는 MAML1-3'UTR-mut 생성. 벡터와 miR-133a 미믹 또는 NC를 리포펙타민 2000으로 심근세포에 공동 형질주입. 48시간 후 이중 루시페라아제 리포터 유전자 시스템(프로메가)으로 루시페라아제 활성 측정.

RNA 면역침전(RIP) 분석

RIP 키트(밀리포어, 미국)로 MAML1과 miR-133a 결합 검출. 세포를 라디오면역침전 분석 버퍼(P0013B, 베이오타임, 상하이, 중국)로 용해, 1400 g 원심분리, 항체와 함께 공동침전. 자성 비드(50 µL) 100 µL RIP 세척 버퍼에 재현탁, 5 µg 항-MAML1 항체(1 µg/mL, ab155786) 또는 IgG(1:100, ab172730) 배양. 자성 비드-항체 복합체 900 µL RIP 세척 버퍼에 재현탁, 100 µL 세포 추출물과 상호작용, 프로테이나제 K 소화, RT-qPCR로 검출.

통계 분석

SPSS 21.0(IBM, 아몬크, 뉴욕, 미국)으로 데이터 분석. 측정 데이터는 평균 ± 표준편차로 표현. 두 그룹 간 비교는 t검정, 그룹 간 비교는 일원배치 분산분석(ANOVA), 사후 쌍별 비교는 Tukey 검정. P값 0.05 이하에서 유의한 예측 인자 유지.

결과

BMSCs 및 BMSC-Exo 동정

현미경에서 BMSCs는 방추형과 원형으로 벽에 소용돌이 또는 방사형 패턴으로 부착했습니다(Fig. 1A). 지방세포 분화 유도 후 오일 레드 O 염색에서 4번째 계대 BMSCs 지질 방울이 적색, 다양한 크기 원형 지질 방울 관찰(Fig. 1B). 골아세포 분화 유도 후 알리자린 레드 염색에서 석회화 결절 발현 세포가 적색, 불균일 분포와 중첩 세포 관찰(Fig. 1C). 유세포 분석에서 MSC 마커 CD29, CD44(>95%) 발현, 조혈 줄기세포 표면 항원 CD34(<95%) 미발현(Fig. 1D). 이 결과로 BMSCs가 높은 순도로 국제세포치료학회 MSC 기준에 부합함 확인.

투과전자현미경에서 BMSC-Exo가 명확한 주변 막 구조, 다양한 크기, 직경 40-100 nm 타원형 소포로 관찰됨(Fig. 1E). 웨스턴 블롯에서 추출물에서 엑소좀 기원 특성 단백질 CD9, CD63, CD81 발현 확인(Fig. 1F).

과발현 엑소좀 miR-133a, 심근염 증상 개선

BMSCs에 miR-133a 재조합 아데노바이러스 형질주입 관찰(Fig. 2A). 역형광현미경에서 NC, Ad-miR-133a, Adas-miR-133a 녹색 형광 다수 관찰돼 재조합 아데노바이러스 벡터가 BMSCs에 효과적 형질주입됨 확인. miR-133a 형질주입 효율 검증 위해 BMSCs와 엑소좀에서 miR-133a 발현 RT-qPCR 측정. miR-133a 상향 조절 시 발현 증가, 하향 조절 시 감소 확인(Fig. 2B). 이후 miR-133a 함유 엑소좀 쥐 주사. 역형광현미경에서 NC^Exo, Ad-miR-133a^Exo, Adas-miR-133a^Exo 처리 VMC 쥐 심근 조직에서 녹색 형광 관찰돼 재조합 아데노바이러스 벡터가 쥐 심근 조직 감염 확인(Fig. 2C). RT-qPCR에서 VMC 쥐 miR-133a 발현 명백히 감소, Ad-miR-133a^Exo 주사 쥐에서 명백히 상승, Adas-miR-133a^Exo 주사 쥐에서 감소(Fig. 2D). 쥐 전반적 상태에서 정상 대조군 정상, VMC 쥐와 Adas-miR-133a^Exo 주사 쥐에서 털 거칠고 무질서, 호흡곤란, 식욕 저하 등 VMC 특성 명백. MSC^Exo, NC^Exo, Ad-miR-133a^Exo 처리군에서 이들 징후 다양한 정도 개선. VMC 쥐 체중 1일째부터 지속 감소, MSC^Exo, NC^Exo, Ad-miR-133a^Exo 주사군 체중 증가. Ad-miR-133a^Exo 처리군 체중 명백히 증가, Adas-miR-133a^Exo 주사군 체중 명백히 감소(Fig. 2E).

심장 기능 관찰(Fig. 2F)에서 VMC 쥐 LVPW, LVIDs 증가, FS, LVEF 감소. 엑소좀 주사 후 VMC 쥐 LVPW, LVIDs 감소, FS, LVEF 명백히 상승. Adas-miR-133a^Exo 처리군 손상, Ad-miR-133a^Exo 처리군 개선 확인.

과발현 엑소좀 miR-133a, VMC 쥐 심근 조직 염증 억제

HE 염색에서 정상 대조군 심근 섬유 밀착 배열, 간질에 염증 세포 침윤 없음. VMC 쥐 심근세포 무질서 배열, 간질에 다수 염증 세포 침윤. MSC^Exo 또는 NC^Exo 주사 VMC 쥐 심근세포 질서 배열, 간질에 소량 염증 세포 침윤. Adas-miR-133a^Exo 처리군 무질서 배열, 염증 세포 침윤. Ad-miR-133a^Exo 처리군 질서 배열, 명백한 염증 세포 침윤 없음(Fig. 3A).

ELISA에서(Fig. 3B, C) 염증 인자(TNF-α, IL-1β, IL-6) VMC 쥐서 명백히 증가. Ad-miR-133a^Exo 주사군 염증 인자 감소. Adas-miR-133a^Exo 처리군 염증 인자 상승.

과발현 엑소좀 miR-133a, VMC 쥐 심근 조직 CVF 감소

매슨 염색에서 정상 쥐 심근 섬유 밀착, 청색 콜라겐 섬유 거의 없음. CVB3 주사 후 심근세포 비대, 결합 조직 증식, 다수 청색 콜라겐 섬유, CVF 명백 상승. 엑소좀 처리군 심근세포 질서 배열, 세포 간 결합 조직 증식 감소, 청색 콜라겐 섬유와 CVF 명백 감소. Adas-miR-133a^Exo 주사군 세포 간 간격 확대, 세포 명백 비대, 청색 콜라겐 섬유와 CVF 명백 증가. Ad-miR-133a^Exo 처리군 세포 간 간격 감소, 청색 콜라겐 섬유 분포와 CVF 감소(Fig. 4A, B).

과발현 엑소좀 miR-133a, VMC 쥐 심근 조직 콜라겐 I, III, TGF-β1, CTGF 발현 감소

콜라겐 I, III는 콜라겐 주성분으로 세포 접합부, 세포막, 세포간 물질, 세포질에 주로 분포. TGF-β1, CTGF는 섬유증 표지 단백질. RT-qPCR 결과 콜라겐 I, III, TGF-β1, CTGF mRNA 발현 VMC 쥐서 증가, 엑소좀 처리 후 감소. Ad-miR-133a^Exo 처리군 콜라겐 I, III, TGF-β1, CTGF mRNA 발현 감소, Adas-miR-133a^Exo 처리군 반대 양상(Fig. 5A-C).

과발현 엑소좀 miR-133a, VMC 쥐 심근 조직 심근세포 아폽토시스 억제

TUNEL 염색에서 아폽토시스 심근세포 갈흑색/갈황색, 핵 응축. 아폽토시스 세포 수 VMC 쥐서 증가, 엑소좀 처리 시 감쇠. Ad-miR-133a^Exo 주사군 아폽토시스 세포 수 감소, Adas-miR-133a^Exo 주사군 증가(Fig. 6A, B).

과발현 엑소좀 miR-133a, VMC 쥐 심근 조직 EMT 억제

E-카드헤린, α-SMA, FSP-1은 EMT 핵심 지표. RT-qPCR 결과 VMC 쥐에서 α-SMA, FSP-1 mRNA 발현 상승, E-카드헤린 mRNA 발현 감소. 엑소좀 처리 후 α-SMA, FSP-1 mRNA 발현 감소, E-카드헤린 mRNA 발현 증가. Adas-miR-133a^Exo 처리군 α-SMA, FSP-1 상승, E-카드헤린 감소. Ad-miR-133a^Exo 주사군 반대 양상(Fig. 7A, B).

과발현 엑소좀 miR-133a, VMC 심근세포 염증 억제

역형광현미경에서 NC^Exo, Ad-miR-133a^Exo, Adas-miR-133a^Exo 처리 VMC 쥐 심근세포 녹색 형광 관찰돼 재조합 아데노바이러스 벡터가 쥐 심근세포 감염 확인(Fig. 8A). RT-qPCR과 ELISA에서(Fig. 8B, D) VMC 쥐 miR-133a 발현 감소, 염증 인자(TNF-α, IL-1β, IL-6) 증가, 엑소좀 처리로 역전. Ad-miR-133a^Exo 처리군 miR-133a 상향, 염증 인자 감소. Adas-miR-133a^Exo 처리군 miR-133a 감소, 염증 인자 증가.

과발현 엑소좀 miR-133a, VMC 심근세포 생존율 촉진 및 아폽토시스 억제

아폽토시스와 세포 생존율 Annexin V-APC/PI 이중 염색과 CCK-8 분석으로 검출. VMC 쥐 심근세포 아폽토시스율 명백 증가, 생존율 감소. 엑소좀 처리 아폽토시스율 감소, 생존율 향상. Adas-miR-133a^Exo 아폽토시스율 증가, 생존율 저해. Ad-miR-133a^Exo 반대 효과(Fig. 9A-C).

miR-133a, MAML1 표적

상향 조절 miR-193b가 MAML1 표적으로 심근 I/R 손상 감소 보고됨[18]. 바이오인포매틱스 웹사이트 PITA, miRanda, PicTar, microT, miRmap으로 miR-133a 하류 유전자 교차 스크리닝해 MAML1 선정(Fig. 10A). MAML1-wt 또는 MAML1-mut 구성, 심근세포에 miR-133a 미믹 또는 NC 공동 형질주입. miR-133a 미믹이 MAML1-wt 루시페라아제 활성 감소시킴(Fig. 10B). RIP 실험으로 miR-133a와 MAML1 표적 관계 추가 검증(Fig. 10C). RT-qPCR과 웨스턴 블롯으로 MAML1 발현 검출, miR-133a 미믹 형질주입 심근세포에서 MAML1 발현 감소(Fig. 10D, E).

MAML1 억제, 심근염 쥐 보호 효과 및 miR-133a 억제 엑소좀 효과 역전

miR-133a 조절 MAML1이 VMC 쥐에 미치는 영향 추가 연구 위해 si-MAML1 또는 si-NC 아데노바이러스 VMC 쥐 또는 miR-133a 억제 엑소좀 처리 VMC 쥐에 주사. 주사 성공 RT-qPCR과 웨스턴 블롯으로 검증(Fig. 11A, B). si-MAML1 주사군 VMC 쥐 체중 증가(Fig. 11C), 심장 기능 개선(Fig. 11D-G), 심근 조직 병리 및 섬유증 완화(Fig. 12A-C), 혈청 염증(Fig. 12D, E) 및 심근세포 아폽토시스(Fig. 13A-G) 억제 확인. 또한 miR-133a 억제 엑소좀의 VMC 쥐 해로운 효과가 si-MAML1 주사로 역전됨.

고찰

심근염은 DCM과 심부전 초래 염증성 심장 질환으로, CVB3 등 바이러스 감염이 가장 빈번한 원인입니다. miR-133이 VMC 쥐에서 심근세포 아폽토시스와 전기적 리모델링 완화함이 보고됨[23]. 또한 변형된 엑소좀 miRNA도 CVB3 유도 심근염 발병 기전과 연관됨[14]. 심장 전구세포 유래 엑소좀이 CVB3 증식 억제로 CVB3 유도 아폽토시스 완화함[24]. 본 연구는 BMSC 유래 엑소좀 miR-133이 VMC 쥐 심근 섬유증과 EMT 조절 기전 탐구(보충자료 1: Fig. 1).

본 연구에서 VMC에서 miR-133a 발현 감소 확인. 앞서 MI에서 miR-133a 발현 감소 보고됨[7]. VMC 쥐 심장에서 miR-133 상대적 발현이 대조군 대비 명백히 감소함 보고됨[23]. miRNA와 엑소좀 연관성 존재. 질병에서 엑소좀과 엑소좀 miRNA 차별적 발현이 비침습적 임상 진단 바이오마커이자 치료 잠재력 지표로 간주됨[25]. Lin 등은 miR-133이 저산소/재산소화(H/R) 유도 인간 내피 전구세포 유래 엑소좀에 특이적 분류돼 섬유아세포 혈관신생과 EMT 증가함 보고[26]. 또 다른 연구에서 MSC가 뇌 실질 세포와 소통하며 엑소좀을 통한 miR-133b 전달로 신경돌기 성장 조절 가능성 제시[27].

본 연구 주요 발견: 과발현 엑소좀 miR-133a가 VMC 쥐에서 세포 생존율 촉진, 염증, 아폽토시스, EMT, 섬유증 억제. 이는 miR-133a 침묵이 황기 다당류 처리 유도 골육종 MG63 세포 증식 억제 역전 및 아폽토시스 촉진과 일치[28]. 과발현 miR-133a가 혈관신생, 아폽토시스, 섬유증, 염증 억제, 허혈성 심장 질환에서 치료적 심장 리모델링 가속화 보고[29]. 본 연구와 유사하게 Li 등은 miR-133이 VMC 쥐 심장에서 아폽토시스 관련 유전자 발현 조절로 심근세포 아폽토시스 억제함 보고[23]. 과발현 miR-133a가 저산소 유도 아폽토시스 억제, 심근세포 생존 강화 보고[30]. 한편 상향 조절 혈청 엑소좀 miR-30a, miR-181d가 VMC 진단 바이오마커 잠재력 가짐[14].

또 다른 발견: 과발현 엑소좀 miR-133a가 VMC 쥐 CVF 감소, 콜라겐 I, III 발현 감소. 콜라겐 막에서 방출된 섬유아세포 성장 인자-18이 골아세포 활성 유도해 miR-133a 하향 조절 참여 보고[31]. 체외 miR-133a 과발현이 심근세포 비대 억제, 콜라겐 발현 감소 보고[32]. CVF = 콜라겐 면적 / (심근 면적 + 콜라겐 면적), 평균값이 절편 CVF 의미[33]. 본 발견은 Wang 등이 CVB3 감염 VMC 쥐 모델 성공 구축, 대조군 대비 명백히 높은 CVF 발현 보고와 일치[34]. 또한 Ferreira 등이 miR-133a가 만성 샤가스병 심근병증 발병 기전 유전자 발현 조절 주요 역할, 진단/예후 도구 잠재력 제시와 일치[8]. 게다가 MAML1 녹다운이 사전 처리 심근세포 비대 감소 증거[35]. 본 연구에서 MAML1이 miR-133a 표적 유전자이며 MAML1 억제가 miR-133a 억제 엑소좀의 VMC 쥐 효과 역전함 확인. 심근 허혈-재관류 손상에서 miR-193b 매개 MAML1 하향 조절이 경색 크기, 심근 효소, 심근세포 아폽토시스 부분적 감소 보고[18]. 또한 MAML1 결핍이 간 섬유화 완화 보고[19].

결론

본 연구는 VMC 쥐에서 miR-133a가 하향 조절됨을 입증했으며, 과발현 엑소좀 miR-133a가 MAML1 표적화를 통해 VMC 쥐 심장 기능 개선, 심근 섬유증 및 EMT 억제, 심근세포 생존율 향상 및 아폽토시스 억제 효과 있음을 제시했습니다. 또한 MAML1 억제가 심근염 쥐에 보호 효과를 가지며 miR-133a 억제 엑소좀의 VMC 쥐 효과를 역전시킴 확인. 심근염에서 심근 섬유증과 EMT에 대한 엑소좀 miR-133a 동정은 심근염 기저 기전 이해를 넓히고 새로운 분자 표적으로서 임상적 가치를 가질 수 있습니다. 이 질환 치료 돌파구를 위해 추가 연구 필요.