나노물질
산업 제조
이 작업에서 우리는 U2OS 셀이 평평한 유리 표면에 제작된 폴리머 나노기둥 어레이에 의해 어떻게 영향을 받는지 탐구합니다. 우리는 액틴 세포골격의 조직과 국소 유착의 위치, 수 및 모양의 변화를 설명하는 데 중점을 둡니다. 우리의 연구 결과에서 우리는 세포가 나노 기둥에 대한 확산 및 접착 거동에 따라 다른 체제로 분류될 수 있음을 확인했습니다. 정량적 분석은 조밀한 나노기둥 어레이에 시드된 세포가 평평한 표면 또는 희박한 기둥 어레이에 비해 세포 주변부에 더 가깝게 형성되는 초점 유착으로 기둥 상단에 매달려 있음을 시사합니다. 이 변화는 부드러운 기질에 파종된 세포에 대한 유사한 반응과 유사합니다.
이 작업에서 우리는 U2OS 셀이 평평한 유리 표면에 제작된 폴리머 나노기둥 어레이에 의해 어떻게 영향을 받는지 탐구합니다. 우리는 액틴 세포골격의 조직과 국소 유착의 위치, 수 및 모양의 변화를 설명하는 데 중점을 둡니다. 우리의 연구 결과에서 우리는 세포가 나노 기둥에 대한 확산 및 접착 거동에 따라 다른 체제로 분류될 수 있음을 확인했습니다. 정량적 분석은 조밀한 나노기둥 어레이에 시드된 세포가 평평한 표면 또는 희박한 기둥 어레이에 비해 세포 주변부에 더 가깝게 형성되는 초점 유착으로 기둥 상단에 매달려 있음을 시사합니다. 이 변화는 부드러운 기질에 파종된 세포에 대한 유사한 반응과 유사합니다.
전반적으로, 우리는 높은 처리량의 나노 제조, 고급 광학 현미경, 세포 과정을 시각화하는 분자 생물학 도구 및 데이터 분석의 조합이 세포가 나노 구조 표면과 상호 작용하는 방식을 조사하는 데 사용할 수 있으며 미래에 특정 유도 배양 기질을 만드는 데 도움이 될 것임을 보여줍니다. 세포 기능.
<섹션 데이터-제목="배경"> 생체 내에서 세포는 일반적으로 세포외 기질(ECM)이라고 하는 복잡한 3D 환경에 있습니다. ECM은 세포의 구조적 스캐폴드 역할을 할 뿐만 아니라 생체 역학 및 생화학적 신호의 전달자이기도 하므로 조직 형태 형성, 항상성 및 분화와 같은 다양한 과정을 조절합니다. 그것은 물, 다당류 및 단백질로 구성되어 있으며[1,2,3,4], 그 구성은 조직 유형에 따라 다릅니다.
생체 내 조건을 더 잘 나타내는 세포 배양 모델을 생성해야 할 필요성에 동기를 부여받은 연구자들은 3D 매트릭스 및 "반3D" 시스템에서도 세포 행동을 연구하기 시작했습니다. 평평한 기질과 더 높은 차원을 가진 시스템 사이의 세포 표현형의 많은 차이점이 확인되었습니다[5, 6]. 예를 들어, 생존, 증식, 분화 및 형태와 같은 특성은 평평한 표면의 세포와 3D 매트릭스에 포함된 세포 간에 다른 것으로 알려져 있습니다[3, 7].
생체 내 기질은 다양한 나노구조로 장식된 평평한 표면과 같은 "반3D"/2.5D 기질에서 콜라겐 겔 또는 매트리겔 매트릭스와 같은 "진정한 3D" 시스템에 이르기까지 다양합니다[8,9,10,11]. 또한, 표면에 리간드의 제어된 위치 지정은 세포가 다양한 화학적 패턴과 상호 작용하는 방법에 대한 새로운 통찰력을 제공할 수 있습니다[12,13,14]. 또한 구조 강성 또는 표면 화학과 같은 기계적 요인이 세포 기능에 영향을 미치는 것으로 나타났습니다[15,16,17]. 이를 위해 세포 연구를 위한 다양한 기질이 많이 개발되었습니다[3, 18,19,20,21,22].
또한 3D 배양 시스템이 약물의 생체 내 효과를 보다 정확하게 예측할 수 있으므로 이러한 시스템이 약물 발견에 응용될 수 있다고 제안되었습니다[16, 23, 24]. 나노 규모의 지형 패턴을 정밀하게 제어하여 세포 형태를 조절하는 데에도 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 주름과 홈은 심근세포의 줄무늬 정렬을 재현하는 데 사용할 수 있으므로 다양한 질병을 모델링하는 데 생리학적으로 관련된 조건을 더 잘 나타낼 수 있습니다[25, 26].
ECM에 연결된 세포의 세포 골격은 세포 표면 인테그린 및 스캐폴드 단백질을 포함하는 다중단백질 복합체인 국소 접착(FA)에 의해 촉진됩니다. 복잡한 규제 메커니즘 세트에 따라 FA는 예를 들어 세포 이동과 같은 전방 이동에 필요한 회전율로 형성 및 분해됩니다. FA는 ECM에 기계적 힘을 가하는 것으로 알려져 있으며, 역으로 세포에 힘을 가하는 ECM은 막의 인테그린 친화도 및 결합력에 영향을 미치는 것으로 알려져 있습니다[27].
FAs의 필수적인 부분으로 알려진 단백질 중 하나는 vinculin입니다. F-액틴을 인테그린-복합체에 고정시키는 데 관여하는 링커 단백질 중 하나입니다. vinculin의 결핍은 세포 형태, 접착 및 운동성을 변화시키고[28], 세포가 기질에 힘을 전달하는 능력을 손상시킵니다[29,30,31]. Vinculin은 인테그린 복합체에 대한 액틴 세포골격의 기계적 연결에 관여할 뿐만 아니라 액틴 필라멘트를 가교 및 묶는 능력[32,33,34], 기존 액틴 다발을 수정하는 능력[35], 액틴 필라멘트 캡, 새로운 액틴 중합 부위의 핵을 생성하고[36] 액틴 변형자를 모집합니다[37].
세포는 세포-기질 접착의 수와 유형을 변경하여 3D 매트릭스에 반응하고 세포골격의 공간 구성에 변화를 유도합니다. 이러한 변화는 차례로 형성된 접착의 분포, 크기 및 역학에 영향을 미칩니다[4, 38,39,40,41]. 이러한 재배열은 세포 증식, 형태 및 운동성의 변화로 이어질 수 있습니다[42].
복잡한 3D 환경이 세포에 미치는 영향을 이해하려면 세포 프로세스를 연구하고 평면 대조군과 비교할 수 있는 새로운 모델 시스템을 개발할 필요가 있습니다. 세포 반응은 배양 기질의 물리적, 기계적, 화학적 특성에 의존하는 것으로 알려져 있기 때문에 정밀하게 제어되는 특성을 갖는 세포 기질을 제작하는 것이 바람직하다[43,44,45]. 또한 광학현미경 등 이미 확립된 분석기술을 이용하여 세포와 기질을 쉽게 연구할 수 있다는 점에서 매우 유리하다.
최근 주목받고 있는 기판 유형 중 하나는 나노 기둥 또는 나노 와이어로 장식된 평평한 표면이다[18, 21, 46,47,48,49,50,51,52,53]. 예를 들어 하이드로겔과 비교하여 이러한 구조화된 표면은 실제 3D 환경을 모방하지 않지만 표면 지형이 잘 정의되어 있습니다. 이러한 기판은 일반적으로 2.5D라고 합니다. 이러한 시스템은 생물학적으로 관련된 분자를 세포로 전달하는 것을 용이하게 하고 [54, 55], 효소 활성을 모니터링하고 [56] 핵 역학을 테스트하고 [57] 막 곡률을 조정하는 것이 다양한 세포막 관련 영향에 미치는 영향을 연구하기 위해 이미 적용되었습니다. 프로세스 [58,59,60]. 투명 기판에 나노구조를 제작함으로써 이 접근법을 광학 현미경과 통합하는 것이 가능합니다.
다른 세포주, 나노구조 유형 및 기하학의 가능한 조합의 수는 많고 문헌의 예는 풍부합니다. Li et al. 무작위로 위치한 갈륨 인화물 나노구조로 장식된 표면의 세포 거동을 설명하고 큰 FA를 가진 세포의 비율을 정량화했습니다[61]. 세포 및 FA 형태는 나노와이어의 다양한 면적 밀도를 갖는 표면에서 조사되었다. 결과는 저밀도 표면에 씨를 뿌린 세포가 기질과 접촉하고 세포 가장자리 주위에 큰 FA를 형성했음을 나타냅니다. 이러한 어레이의 높은 비율의 셀에서 큰 FA가 감지되었습니다. 높은 나노와이어 면적 밀도의 경우 세포가 나노와이어 어레이의 상단에 매달려 있고 세포 아래의 점형 FA가 관찰되었습니다. 이 어레이의 더 낮은 비율의 세포는 낮은 나노와이어 면적 밀도를 가진 표면의 세포에 비해 큰 FA를 나타냅니다.
Buch-Månson et al. Si 기판에 무작위로 위치하는 실리콘 나노컬럼 어레이에 대한 세포-나노구조 표면 상호작용을 연구했습니다[62]. 사용된 제조 공정에서 영역 밀도는 제어되지만 기둥-기둥 거리는 제어되지 않았습니다. FA의 조사는 중간 면적 밀도를 갖는 어레이 상의 세포가 가장 비대칭적인 형태를 갖는 가장 많은 수의 FA를 갖는다는 것을 보여주었다. 이러한 FA 중 일부는 나노 컬럼의 측벽에 형성되었다고 제안되었습니다. 이것은 낮고 높은 면적의 나노컬럼 밀도를 가진 표면에서는 관찰되지 않았습니다.
이전 연구에서 우리는 평평한 유리 표면에 SU-8 폴리머 나노구조를 제조하기 위한 자세한 프로토콜을 설명했으며[63], 이러한 표면에서 두 개의 서로 다른 세포주에 대한 세포 거동을 조사했습니다[45, 48]. 이 작업에서 우리는 전자빔 리소그래피(EBL)를 사용하여 수직으로 정렬된 SU-8 폴리머 구조로 장식된 표면을 제작하여 골육종 상피 세포주 U2OS에서 액틴 세포골격 및 FA 조직의 변화를 연구합니다. 우리는 서로 다른 위상적 단서로 표면에 의해 유발된 변화의 정성적 및 정량적 분석을 모두 수행합니다.
<섹션 데이터-제목="결과">이전에 확립된 프로토콜을 사용하여 가변 분리 및 정의된 기하학 [63]을 사용하여 수직으로 배향된 SU-8 나노기둥(NP)의 정확하게 정의된 어레이로 장식된 유리 커버 슬립을 제작했습니다. NP 면적 밀도가 456, 205, 115 및 29NPs/100μm 2 인 표면 (500 nm, 750 nm, 1000 nm 및 2000 nm의 피치에 해당)이 사용되었습니다. 먼저 우리는 세포 형태, 액틴 세포 골격의 구조 및 세포-기질 상호 작용의 일반적인 경향을 조사합니다. 우리는 다양한 나노 구조 기판 및 평면 유리 컨트롤에 대한 세포 및 FA 형태의 정량적 비교를 따릅니다. 고해상도 현미경과 고처리량 제작을 결합하여 각 표면 유형에 대해 최소 \({\approx 100}\) 세포의 정성 분석을 수행하고 24시간 및 48시간 후 이미징을 수행합니다. 총 400개 이상의 고해상도 이미지와 20개의 3D 데이터 세트를 분석합니다.
그림 7은 NP 어레이(A, B)와 제작된 기판(C, D)의 전자 현미경 이미지의 개략도를 보여줍니다. 나노 가공된 구조를 포함하는 유리 슬라이드는 중공 바닥, 구조가 위쪽을 가리키는 35mm 배양 아래에 파라핀을 사용하여 장착되었습니다. 그림 1C, D에 표시된 하향식 및 제목 측면 전자 현미경 이미지는 피치와 높이가 1000nm인 나노 기둥 어레이를 보여줍니다. 표 1은 이 작업에 사용된 배열의 기하학적 매개변수, 분류 및 해당 NP 영역 수 밀도를 보여줍니다. 관찰된 세포 접착 거동에 따라 NP 어레이를 조밀하고 희박한 것으로 분류합니다(아래 참조).
그림 1은 유리(A)와 나노구조 표면(B–F)에서 24시간 동안 배양된 대표적인 U2OS 세포를 보여줍니다. 세포는 각각 형광성 LifeAct-TagGFP2(이하 LifeActGFP) 및 TagRFP-빈쿨린 융합 단백질의 생산을 통해 F-액틴 및 빈쿨린의 시각화를 허용하는 pCMV-LifeAct-GFP 및 pTAG-RFP-빈쿨린으로 공동 형질감염되었습니다. FA의 F-액틴 네트워크 및 빈쿨린이 풍부한 영역이 명확하게 감지됩니다. 세포 주변에서 LifeActGFP 신호는 막에 매우 근접하므로 이 신호를 사용하여 세포 형태를 시각화합니다. SU-8 NP의 신호는 파란색으로 표시됩니다("실험" 섹션 참조).
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다양한 표면 유형에서 형광 LifeActGFP(녹색) 및 TagRFP-빈쿨린(빨간색)을 발현하는 U2OS. 노란색 색상은 LifeActGFP 및 TagRFP-vinculin 채널에서 겹치는 신호를 나타냅니다. 각 현미경 사진 아래에는 해당 NP 어레이의 개략적인 측면도가 획득 평면의 대략적인 위치와 함께 표시됩니다. A에 이미지화된 세포 구조화되지 않은 평평한 유리 표면 및 배열 피치 및 구조 높이가 다른 기둥 배열:B 500nm 피치 및 500nm 높이, C 1000nm 피치 및 500nm 높이, D 750nm 피치 및 1000nm 높이, E 1000nm 피치 및 1000nm 높이, F 2000nm 피치 및 1000nm 높이. 제시된 모든 이미지는 대표적인 세포입니다. 스케일바 25μm. C 다른 이미지와 스케일이 다릅니다.
형질감염된 세포를 사용한 예비 테스트에서는 유리 표면과 구조화된 표면 모두에 시드된 세포가 약 6시간 후에 완전히 퍼진 것으로 나타났습니다. 다른 표면 사이의 세포 퍼짐의 명확한 차이는 관찰되지 않았으며 육안 검사는 이 시점 또는 이후 실험에서 기둥 배열로 인해 감소된 세포 생존의 징후를 나타내지 않았습니다. 다음 실험에서 세포는 접종 6시간 후 형질감염된 다음 형질전환 24시간 후, 48시간 후 이미지화되었으며, 이는 접종 후 30시간, 54시간 후의 형질전환에 해당합니다. 다음에서는 이 두 시점을 파종 후 관찰 시간, 즉 24시간, 48시간으로 참조합니다.
세포는 높이 500nm, 1000nm 및 피치 750nm, 1000nm, 2000nm인 NP 어레이에 시딩되었습니다. 초기 퍼짐 후 세포는 평평한 표면의 상황과 유사하게 둥글거나 길쭉한 것으로 관찰되었습니다. 이 일반적인 형태는 여러 실험에서 일관된 것으로 밝혀졌습니다. 희소 NP 어레이에 시드된 세포는 일반적으로 유리 표면의 세포와 유사한 모양을 가졌습니다. 2000nm 피치 어레이의 대표적인 세포를 묘사하는 그림 1F 참조. F-액틴 섬유는 NP의 기저부와 유리 표면 근처에도 존재하여 세포가 기질에 가까운 영역에 접근할 수 있음을 나타냅니다. 이전에 관찰된 바와 같이[45, 62, 64], 조밀한 어레이의 세포는 일반적으로 NP 위에 매달려 있는 것으로 나타났습니다(그림 1B, D, E). 조밀한 어레이의 세포는 유리 표면 가까이에서 덜 두드러진 F-액틴을 갖는 것으로 보이며, 이는 액틴 섬유가 기판에 근접한 기둥 사이에 형성되지 않았음을 나타냅니다. NP 높이와 분리 사이의 관계는 세포가 기판에 부착되었는지 또는 NP 어레이의 상단에 매달려 있는지 결정했습니다. 이것은 예를 들어 더 짧은 NP가 기판과 접촉하는 세포로 이어지는 반면, 더 긴 NP는 접촉을 방해하는 그림 1C에 예시되어 있습니다(그림 1E). 액틴 섬유의 이러한 관찰은 그림 2에 제시된 것처럼 일부 표면에 대해 수행된 z-stack에 의해 더욱 확증되었습니다.
세포가 구조화된 표면과 구조화되지 않은 표면에 어떻게 부착되는지에 대한 더 자세한 이해를 얻기 위해 우리는 TagRFP-빈쿨린 융합 단백질의 존재에 의해 시각화된 바와 같이 FA의 분포를 평가했습니다. 평평한 표면의 세포는 일반적으로 그림 1A와 같이 전체 세포체 아래에 분포된 긴 FA를 형성했습니다.
희소 어레이에서 U2OS는 NP 사이의 유리 표면에 접촉할 수 있었고 그림 1C, F에 표시된 유리 위의 세포와 유사하게 부착되었습니다. 이러한 NP 어레이의 경우 NP 사이의 유리에 형성된 FA 및 F-액틴 신호 NP의 기저부 가까이에서 획득한 이미지에서도 검출되었다. 이것은 세포가 나노구조 주위의 막을 구부릴 수 있음을 나타냅니다. 그러나 750nm, 1000nm nm 분리 및 1000nm 높이와 같은 더 조밀한 어레이의 세포는 이미지 그림 1D, E에서 볼 수 있듯이 나노구조 사이의 기판에 부착하는 데 방해가 되었습니다. NP. 그러나 주변부에서 세포는 일반적으로 기본 기둥 어레이의 대칭에 의해 지시되는 FA를 형성하는 나노구조 사이의 기판에 부착할 수 있었습니다.
길이가 더 짧고 기둥 사이 간격이 1000nm인 NP 어레이에 퍼지는 세포는 주변부와 세포체 아래 모두에 접착을 형성했습니다. F-액틴 섬유 배향은 그림 1C와 같이 기본 어레이의 대칭에 의해 지시되었습니다. 그러나 FA를 포함하는 vinculin의 위치와 방향은 FA가 NP 사이를 형성하는 명확한 패턴을 나타내지 않았습니다.
기둥 간 거리가 500nm인 500nm 기둥의 U2OS 셀은 일반적으로 그림 1B에 표시된 것처럼 평면 표면에 비해 점점 더 적은 접착력을 형성했습니다. 이 어레이에 시드된 세포의 경우, 액틴 섬유는 FA에서 종결되는 위치에서 유리 표면 근처에서 주로 관찰되었습니다. 다시 말하지만, 이것은 액틴 네트워크가 표면과 접촉하는 것을 방해했기 때문에 세포가 어레이 상단에 매달려 있다고 가정했다는 표시입니다. 그러나 세포는 기둥 위에 더 손상되지 않은 F-액틴 네트워크가 형성되는 것으로 나타났습니다. 기둥 사이에서 관찰된 액틴 네트워크의 일부는 기본 NP 어레이의 구조와 정렬되는 것으로 나타났습니다. 이것은 F-액틴 섬유와 FA가 주로 기둥 어레이의 격자 방향 중 하나, 즉 열린 "선"에 평행하게 형성되기 때문에 그림 1B에서 볼 수 있습니다.
조밀하고 희박한 어레이에서 우리는 세포체로 위쪽으로 돌출된 NP 주위에 형성된 "고리형" F-액틴 구조를 관찰했습니다. F-액틴 고리 구조는 그림 1E, F에 표시된 것처럼 희소 배열에서 더 두드러진 것으로 나타났습니다.
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A 서로 다른 표면에 있는 U2OS 세포의 이미지는 3개의 표시된 초점면에서 획득되었습니다. 이미지는 기둥 베이스에 가깝게, 대략 절반 기둥 높이에서, 기둥 정점에 가깝게 획득되었습니다. 이미징 평면은 평평한 유리 표면에서 0.0μm, 0.4μm, 0.8μm에 위치했습니다. 나 –디 ) 서로 다른 표면 유형에서 형광 LifeActGFP(녹색) 및 TagRFP-vinculin(빨간색)을 발현하는 U2OS를 보여주는 병합 형광 이미지, 노란색은 LifeActGFP 및 TagRFP-vinculin이 중첩되었음을 나타냅니다. 이미지 표면은 B였습니다. 구조화되지 않은 유리 표면, C 1000nm 피치 기둥 어레이, D 2000nm 피치 기둥 어레이. 제시된 이미지는 각 표면 유형의 세포를 대표합니다. 각 표면 유형의 초점면 사이의 수직 거리는 약 400nm입니다. 스케일바 25μm
위에 제시된 결과를 기반으로 세포 형태 및 FA에 대한 보다 자세하고 정량적인 설명을 위해 3개의 표면을 선택했습니다. 우리는 조밀한 어레이(피치 1000nm, 길이 1000nm), 희소 어레이(피치 2000nm, 길이 1000nm)의 세포를 연구하고 대조군으로 사용된 평평한 유리 표면의 세포와 결과를 비교합니다.
전용 이미지 후처리와 함께 Airyscan 검출기를 사용하여 약 140nm의 xy 해상도와 약 400nm의 z 해상도로 이미징을 수행할 수 있었습니다[65]. 그림 2는 약 400nm로 분리된 이미징 평면과 함께 3개의 표면에 있는 세포의 이미지를 보여줍니다. 다른 z에서 F-액틴 번들의 조사 . 평평한 표면의 세포는 동일한 초점면 또는 FA 바로 위에 명확하게 보이는 F-액틴 네트워크를 가지고 있습니다(그림 2-B2 참조). 조밀한 어레이에 있는 세포의 경우 F-액틴 네트워크는 유리 지지체와 접촉하는 FA 평면에 비해 세포 내 더 높은 초점 평면에서 발견되었습니다(그림 2-C1 및 C2/C3). 희소 배열의 세포의 경우 상황은 유리 대조군의 세포와 유사했고 액틴 네트워크와 FA가 동일한 높이에서 감지되었습니다(그림 2-D2). 이 데이터는 희소 배열의 세포가 구조 사이의 표면에 부착된 반면 조밀 배열의 세포는 주로 세포 주변부 표면에 부착할 수 있다는 초기 관찰을 뒷받침합니다.
세 개의 선택된 표면에 대한 FA 및 세포 형태의 차이를 분석하고 정량화하기 위해 Python 기반 이미지 분석 스크립트를 사용했습니다("실험" 참조). 정량 분석을 위해 300개 이상의 고해상도 이미지를 분석했습니다. 이 이미지에서> 400개 세포 및> 7700개 FA가 식별되었으며, 표 2는 분석에 포함된 세 가지 표면 유형에 대해 감지된 세포 및 FA의 수를 나열합니다. 모든 표면에 대해 세포는 형질감염 후 24시간, 48시간 모두에서 이미지화되었습니다. 다음 분석에서는 3가지 표면 유형과 24시간, 48시간 후 셀에 대한 표면적, 원형도 및 종횡비와 같은 기하학적 매개변수를 비교합니다. 추가 분석은 보충 정보에서 찾을 수 있습니다. 셀에 대한 표면적, 원형도 및 종횡비는 그림 3에 표시되고 FA 수에 대해 셀당 결합된 FA 면적 및 셀에 대한 FA 면적 비율은 그림 4에 표시됩니다. 기하학적 매개변수는 "실험"에 설명된 대로 정의되었습니다. 부분.
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형질감염 후 24시간 및 48시간에 이미징된 다양한 표면에서 형광 LifeActGFP 및 TagRFP-빈쿨린 융합 단백질을 발현하는 U2OS 세포에 대한 계산된 세포 면적, 세포 원형도 및 세포 종횡비. LifeActGFP 신호의 강도를 기반으로 이미지 감지를 수행했습니다. 각 회색 점은 하나의 셀에 해당하며 상자 플롯은 중앙값(Q 2) 첫 번째(Q) 1) 및 3사분위수(Q 삼). 분포 간의 통계적 차이는 Mann-Whitney 비모수 검정을 사용하여 평가되었습니다.
그림 3은 평평한 표면과 구조화된 표면 모두에 대해 수집된 데이터를 요약합니다. 도 3A에 나타난 바와 같이, 24시간 세포 배양 후에 세포 면적의 유의한 차이가 관찰되었다. 그러나 48시간 후에는 연구된 표면의 평균 세포 면적 간에 유의한 차이가 없었습니다. 세포 원형성을 고려할 때(그림 3B), 24시간 후에 이미지화된 조밀한 기둥과 성긴 기둥에 시드된 세포를 제외하고 서로 다른 표면 간에는 유의한 차이가 감지되지 않았습니다. 세 표면 모두의 셀은 그림 3C에 제시된 것과 같이 평균 종횡비가 동일했습니다.
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FA 수, 3가지 다른 표면 유형(1000nm 및 2000nm 피치의 평면 및 기둥 어레이)에서 이미징된 셀의 셀당 결합된 FA 영역 및 FA 영역 대 셀 영역의 비율입니다. 각 회색 점은 한 셀의 관찰에 해당합니다. 분포 간의 통계적 유의성은 Mann-Whitneys 비모수 검정을 사용하여 결정되었습니다.
그림 4는 셀당 검출된 FA의 수, 각 셀에서 FA의 총 표면적 및 셀 면적에 대한 FA 면적의 비율의 분포를 보여줍니다. 24시간 후 3개의 서로 다른 표면에서 세포에 의해 형성된 FA의 수는 상당히 달랐습니다. 도 4B에 도시된 바와 같이, 세포당 총 FA 표면적은 평평하고 구조화된 표면에 파종된 세포에 대해 달랐다. 그림 4C와 같이 서로 다른 표면에 대해 상대적인 FA의 양(검출된 FA의 전체 면적을 전체 셀 면적으로 나눈 값)을 비교할 때도 마찬가지입니다.
그러나 배양 48시간 후에는 세포 집단 간의 유의한 차이가 더 이상 관찰되지 않았습니다. 세포당 FA의 수, 세포당 결합된 FA 면적 또는 FA 표면 분율을 고려할 때 세 표면 간에 차이가 발견되지 않았습니다.
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A를 표현하는 2000nm 기둥 어레이의 예시 셀 LifeActGFP(녹색) 및 B TagRFP-빈쿨린(빨간색). 두 그림에 중첩된 감지된 세포 가장자리는 LifeActGFP의 발현 신호를 사용하여 결정된 것입니다(A 참조). ). ㄷ 감지된 셀 가장자리와 감지된 FA로부터의 거리 맵을 표시합니다. 최단 거리(d로 표시됨) 그림에서) 분할된 각 빈쿨린 반점(흰색 영역)에서 세포 주변부(흰색 실선으로 표시)까지가 이미지의 모든 FA에 대해 계산되었습니다.
NP의 존재가 세포에서 FA의 위치에 영향을 미치는지 여부를 이해하기 위해 FA의 위치를 사용하여 추가 분석을 수행했습니다. 현미경 데이터는 밀도가 높은 NP 어레이의 세포에서 FA가 그림 1 및 2에 표시된 것처럼 세포 주변에 더 가깝게 위치했음을 나타냅니다. 1 및 2. 이러한 경향을 정량화하기 위해 각 FA에서 셀 가장자리까지의 최단 거리를 계산했습니다. 이는 Fig. 5와 같이 수행하였다. F-actin을 이용하여 주변부의 위치를 파악하고, distance map을 구성하여 검출된 FA의 각 중심에서 세포 주변까지의 거리를 계산하였다. 셀 크기의 차이를 설명하기 위해 감지된 셀 가장자리와 FA 사이의 거리를 가장자리에서 각 셀의 기하학적 중심까지의 최대 거리(원 모양의 셀의 반경과 동일한 거리)로 정규화했습니다. 최대 거리로 정규화된 데이터는 그림 6과 표 3에 나와 있습니다. 평평한 표면의 셀의 경우 FA가 셀 중심 쪽으로 더 많이 분포되어 있는 반면, 희소 2000nm 어레이와 밀집된 1000nm 어레이 모두에서 FA는 세포 주변부에 더 가깝습니다. 이 효과는 1000nm 피치의 고밀도 어레이에서 가장 두드러집니다. FA 위치가 세포 표면적에 의해 정규화된 대체 정규화 접근법의 결과는 보충 정보에 포함되어 있습니다. 이 데이터는 그림 6에 제시된 각 셀의 가장자리까지의 최대 거리로 정규화한 데이터와 동일한 정성적 경향을 보여줍니다.
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셀의 기하학적 중심에서 가장자리까지의 최대 거리로 정규화된 가장 가까운 셀 가장자리와 관련된 FA 위치 분포. 거리는 각각의 관찰된 FA에서 LifeActGFP 신호에 의해 정의된 세포 가장자리까지의 거리를 계산하여 얻었고 24시간 및 48시간에 세 가지 표면 유형에 대해 표시했습니다. 회색 점은 FA의 개별 관찰을 나타내며 해당 분포는 상자 그림에 요약되어 있습니다. 서로 다른 표면과 시점의 FA가 동일한 분포에서 나올 가능성을 테스트하기 위해 모든 분포에서 Mann-Whitney 테스트를 그림에 표시된 유의 수준으로 수행했습니다.
액틴 세포골격의 조직화 및 유착 형성은 평평한 표면에서 광범위하게 연구되는 과정입니다. 본 연구는 나노기둥 어레이에 대한 액틴 세포골격 및 초점 접착 조직의 변화를 조사하고 정량화하기 위해 설계되었습니다. 이 연구에서 우리는 나노기둥 어레이가 세포 이동에 어떻게 영향을 미치는지 조사하지 않았습니다. 그러나 우리는 배아 마우스 섬유아세포에 대한 동일한 기둥 어레이에서 이전에 관찰된 바와 같이 조밀한 어레이의 세포가 더 높은 운동성을 가질 것으로 예상합니다[45].
세포가 장기간 표면에 퍼지고 부착되도록 하면 액틴 세포골격 조직과 완전히 성숙한 FA의 존재를 관찰할 수 있습니다. 시드 24시간 후 표면에 시드된 세포의 세포 면적, 원형도 및 종횡비에서 상당한 차이를 관찰했습니다. 그러나 48시간 후에는 유의한 차이가 감지되지 않았으며, 이는 24시간 후에 세포가 아직 표면에 완전히 부착되지 않았으며 나노구조가 완전히 성숙되기 전에 주로 FA 조직에 영향을 미친다는 것을 나타냅니다. 24시간 후나 48시간 후에도 NP의 상단이나 측면에서 FA 형성이 관찰되지 않습니다.
액틴 세포골격 조직의 변화는 세포가 주변 환경과 상호 작용하는 방식과도 관련이 있습니다. 예를 들어, 응력 섬유와 섬유소는 모두 스트레칭을 받을 때 성장하고 기능적으로 상호 의존적으로 보입니다[66]. 다른 사람들은 더 둥근 세포와 가장자리 주변의 FA 국소화가 종종 부드럽고 유연한 표면에 씨를 뿌린 세포에서 관찰된다고 보고했습니다[67]. 우리의 결과에서 우리는 유사한 경향을 관찰합니다. 조밀한 어레이의 세포는 그림 1 및 2와 같이 세포 가장자리 주위에 섬유를 보이는 경향이 있습니다. 1E 또는 2B. FA는 이러한 세포의 세포 가장자리에 가깝게 형성되는 것으로 보입니다. 우리는 세포가 기둥 위에 매달려 있을 때와 같이 세포에 평평한 표면이 없을 때 FA 분포가 Prager-Khoutorsky와 동료들이 사용하는 것과 같은 부드러운 기질의 FA와 유사하다고 추측합니다.
우리의 결과에서 기둥 위에 매달린 세포가 기둥 위에 발달된 액틴 네트워크가 있는 것처럼 보이지만 기둥 자체에 FA가 형성되지 않는 것을 관찰했습니다. 그러나 희소 배열에 있는 세포의 경우 세포는 NP의 영향을 덜 받는 것으로 보이며 액틴 네트워크와 FA는 모두 "평평한 표면"처럼 보입니다.
FA와 액틴 세포골격 사이의 상호작용은 복잡하고 아직 완전히 특성화되지 않았습니다. 액틴 세포골격을 ECM에 연결하는 FA는 견인점으로 작용하고 세포에서 스트레스 섬유 형성을 촉진하는 것으로 알려져 있습니다. 역으로, 액틴 섬유는 다시 FA의 조직과 성숙에 영향을 미치고 있습니다. 수많은 연구에서 세포가 조밀한 NP 어레이 위에 매달려 있는 경향이 있고 [61, 62, 68] 세포막이 단일 NP와 상호 작용하는 방식이 설명되어 있습니다[69,70,71]. 이러한 관찰은 이론적 연구[64]에 의해 확증되었으며 기둥에 대한 세포 거동은 상당히 잘 이해되고 있습니다.
조밀한 어레이에서 세포 가장자리 주변의 기질에 대한 FA 형성 및 부착의 메커니즘은 아직 명확하지 않습니다. 이와 관련하여 부드러운 기질의 세포와 비교하는 것이 특히 흥미 롭습니다. 연질 기질의 경우, 액틴 섬유는 세포 가장자리에 가깝게 고리와 같은 방식으로 조직되고 FA는 세포 주변부 주위에 형성됩니다[67]. On the nanopillar arrays similar type of architecture is observed, but the actin fibres are typically shorter. Similar qualitative trends in terms of actin organisation and FA formation were observed by Li et al. for cells seeded on random nanowire arrays made from gallium phosphide [61].
In our studies we also observed formation of F-actin rings around NPs. The formation of F-actin rings around NP has previously been described for fibroblasts on similar surfaces [45] and for U2OS cells on nanostructures with a range of structure sizes [58].
Contrasting our results to other studies highlight an important aspect of studies on cellular response to NP arrays:cellular response may vary considerably depending on cell type, NP material, NP geometry and as well as other parameters. For example, Buch-Månson et al. studied fibroblasts and investigations of FAs showed that cells suspended on arrays with intermediate NP density had the highest number of FAs. In our results we do not see a similar trend. However, these studies cannot be directly compared as Buch-Månson et al. studied another cell line using a system with different array geometry, surface porosity and NPs length [62].
There are also studies describing the effect FAs placement has on cells [41]. By modelling cells on planar substrates Stolarska et al. suggest that the cells can control intra-cellular stresses by three mechanisms:FA position, FA size and attachment strength. FAs around the periphery allows the cells to be more sensitive to changes in the micro-environment. This could also be an underlying mechanisms for cells on NPs. Yet, it is not obvious that the results for the planar substrate are directly transferable to NP decorated surfaces.
Cell-interactions with the surrounding environment, for flat substrate, NPs arrays or in vivo ECM, are regulated by a complex set of relations between actin organisation, membrane mechanics, cell dynamics and contact with FAs. To further explore these relations, applying flat surfaces structured with NPs could be one promising approach. Such surfaces may also aid in exploring discrepancies in the cellular response to environmental cues between different cell lines.
In order to create more physiologically relevant systems for cellular studies, a plethora of 3D and 2.5D approaches have been proposed. One approach is to use flat-surfaces decorated with vertically aligned nanostructures as a simple model system. High resolution live cell imaging of co-transfected U2OS cells expressing pCMV-LifeAct-GFP and pTAGRFP-Vinculin have been used to study the influence of nanopillar arrays on actin cytoskeleton focal adhesion organisation. Our present results indicate that the U2OS cells spreading on surfaces decorated with nanopillars can be categorised into three different regimes by how they respond to the nano-structures. These observed changes are quantified by analysing more than 400 high-resolution images, and indicate that tuning geometrical properties of the nanostructured surface can be used to direct cell behaviour.
More specifically, the U2OS cells were found to either contact the substrate, attach preferably around the cell edge, or be fully suspended on top of the vertical NP arrays. In the latter case, we hypothesise that the resulting reorganisation of FA and cytoskeleton is an effect analogous to what is seen for softer substrates.
Increased understanding of how cells behave on nano-structured surfaces, such as pillar arrays, could help us discover more details about complex cellular processes. For example, it is still poorly understood how changes in the actin cytoskeleton and its architecture influence cell signalling. By studying the cell response on nanostructured surfaces in a systematic way, the potential connection between actin cytoskeleton, cell adhesions and a plethora of biochemical signalling pathways could be further explored. We therefore envision that further development of the presented platform and analysis could have implications for advanced in vitro applications or for development of smarter in vivo biointerfaces.
SU-8 nanostructures were fabricated as previously explained [63]. Briefly, 24 mm by 24 mm glass cover slips (#1.5, Menzel-Gläser, thickness 170 μm) were cleaned by immersion in acetone, isopropyl alcohol, rinsed in de-ionised water and dried. The cover slips were then oxygen plasma treated for 2 min (Diener Femto plasma cleaner, power 100 W, base pressure 0.3 torr), followed by dehydration for 10 min on a 150 °C hot plate. Samples were then placed in a desiccator containing an open vial of Hexamethyldisilazane (HMDS, Sigma Aldrich product no:440191). HMDS was applied by vapour deposition, the desiccator was pumped to low vacuum using a diaphragm pump for 5 min and the samples were kept in HMDS atmosphere for 60 min.
Substrates for EBL were prepared directly after HMDS treatment by spin coating SU-8 2001 (Microchem Corp.) to a desired thickness of 500 nm and 1000 nm. SU-8 was made fluorescent by adding either Oxazine 170 perchlorate, Rhodamine 800 or Coumarin 102 (all Sigma Aldrich) to a final concentration of 100 μg mL −1 저항하다. After spin coating samples were dehydrated on a hot plate at 95 °C. To mitigate charging during EBL exposure samples were then covered by a layer of conductive polymer AR-PC 5091 Electra 92 (AllResist GmbH) by spin coating at 2000 rpm for 60 s to thickness of 50 nm.
An Elionix ELS-G100 100 kV EBL-system was used to fabricate SU-8 nanopillars (NPs) with processing parameters as described in our previous work [63]. Table 1 summarise the arrays fabricated for this work. Pillar arrays were exposed using the Elionix dot-pattern generator where each pillar is exposed in a single exposure. Arrays were exposed over an area of 2000 μm by 4000 μm, with a current of 500 pA in write fields of 500 μm by 500 μm. NPs had a tip diameter of about 100 nm as a base diameter of 150 nm and 200 nm for structures of length 500 nm and 1000 nm respectively.
After EBL exposure, the samples were rinsed in DI-water to remove the conductive polymer, then post exposure baked for 2.3 min at 95 °C and developed twice in mr-Dev 600 (Micro Resist Technology GmbH) developer for 20 s, rinsed in isopropyl alcohol and dried. Samples were then treated with oxygen plasma (Diener Femto plasma cleaner, power 50 W, base pressure 0.3 torr) for 30 s to render SU-8 hydrophilic and to give it similar surface chemistry as glass by oxidising surface epoxy-groups to hydroxyl.
Fabricated structures were imaged using Scanning electron microscopy (SEM) and samples sputter coated with 5 nm Platinum/Palladium alloy deposited with a 208 HR B sputter coater (Cressington Scientific Instruments UK). SEM was performed with a FEI Apreo SEM, at 5 kV and 0.2 nA with sample 45° pre-titled stage and with additional tilting of 30°.
A Side view schematic representation of nano-structured surface mounted in petri dish. Glass slides are mounted using paraffin such that structures are pointing upwards. 나 Tilted schematic representation of nano-pillar array on flat surface, and two important parameters for the nano-pillar arrays (height and pitch). These figures are not drawn to scale. ㄷ , D Overview of the nanopillar arrays employed in this work. Top-down and tilted side-view scanning electron micrographs of fabricated nano-pillar array with pillars of height 1000 nm and pitch 1000 nm. Scalebars 2000 nm
When exposing the pillars, an indexing system was also exposed to make navigation during live-cell imaging more reliable. Arrays were optically inspected after fabrication to ensure free and standing pillars. The short Oxygen plasma treatment to render the SU-8 structures did not lead to any optically visible change to the structures. Lastly, the samples were mounted underneath 35 mm diameter dishes (Cellvis, Mountain View, CA, USA) with 14 mm holes and nano-structures pointing upwards, as indicated schematically in Fig. 7. As flat surfaces, areas outside the structured part of the same samples were used. Before usage, all dishes were disinfected with 70% ethanol twice and dried.
U2OS-cells (ATCC) were cultivated in Dulbecco’s modified Eagle’s Medium (DMEM Prod. 41965039, Fischer Scientific) with 10% fetal bovine serum (FBS) and kept at 5% CO2 and 37 °C. Before detachment, cells were washed with PBS and detached with Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid (trypsin-EDTA) and seeded on nanostrucutred or flat surfaces. For the diameter 14 mm glass wells 15,000 cells were seeded.
For the standard transfection experiments, cells were allowed 6 h for adhering to surfaces before transfection. U2OS cells were transiently transfected using Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Fischer Scientific) by adapting the manufacturer protocol to our system. Briefly, 2 μL Lipofectamine 2000 was added to 50 μL Opti-MEM I Reduced Serum Media (Prod. 11058021, Gibco , Fischer Scientific) and incubated for 5 min at room temperature. Plasmid DNA coding for fluorescent LifeAct-TagGFP2 and TagRFP-vinculin fusion proteins were co-transfected by using 0.5 μg plasmid DNA (vinculin-pTagRFP and pCMVLifeAct plasmids) was diluted in 50 μL Opti-MEM I and incubated at room temperature for 5 min. For co-transfection of TagRFP-vinculin and pCMVLifeAct 0.5 μg of each plasmid was used.
The diluted DNA was added to the diluted Lipofectamine 2000 in a 1:1 ratio, and left to incubate for 20 min at room temperature. 40 μL of the combined transfection complex was then added to each well. After 18 h, 1.5 mL DMEM (Prod. 41965039) supplemented with 10% FBS and 1% 10000U/mL Penicillin-Streptomycin was added to each dish.
For reverse transfection experiments, the same amounts of reactants were used, but the transfection complex was added to a suspension of U2OS cells, and the suspension was then added to the wells.
Live cell imaging was performed usin g a Zeiss LSM 800 Airyscan with an inverted Axio Observer Z1 stand connect to a PeCon compact incubator. Imaging was performed in an humidified environment at 37 °C, with 5% CO2 흐름. High resolution imaging was performed using a Zeiss Plan-Apochromat 63x/1.4NA DIC M27 oil objective with Cargille Immersion Oil Type 37 (n =1.51) suited for use at 37 °C. All images were taken using the system optimised pixel size both in-plane (typically 34 nm) and for stacks in the vertical axis (typically 180 nm).
To minimise imaging bias, imaging was performed in a standardised manner where each pillar array was raster scanned and cells expressing both LifeActGFP and Vinculin RFP were imaged. The high resolution images were then processed using a Zeiss algorithm for reconstruction of AiryScan images and exported as CZI-files for further manual and automatised image processing.
For all cells, cell shape was based on the expression LifeActGFP fusion protein and expression of TagRFP-vinculin was used to identify FAs. Segmentation of images was performed using a script written in Python 3 [72] using CZIfile [73] (version 2017.09.12) for reading the microscopy images in Zeiss-format. The python packages Scipy [74] and Scikit-image [75] were used for multi-dimensional image processing and image segmentation respectively.
To reduce the influence from fluorescence cross-talk from pillars (due to Oxazine 170 perchlorate, Rhodamine 800 or Coumarin 102), the pillar/surface channel was used as a background and subtracted from the TagRFP-vinculin imaging channel. A median filter (size:10 pixels) was applied to remove noise from the TagRFP-vinculin channel, followed by classification of the image into regions based on their intensity value using a Multi-Otsu approach. Multi-Otsu thresholding with three classes was applied. The first class was typically the background, the second class constituted the cytosolic vinculin, whereas vinculin rich areas in FAs appeared brighter and could be classified into a third class. The quality of the image segmentation was briefly assessed by comparison to manual segmentation.
Area of cells and vinculin rich regions were described by counting pixel numbers and from this the actual area was found by correcting for the pixel size. Shape geometries were described by fitting each region with an ellipse with the same second-moment as the segmented region. In order to describe the cell area geometry, three measures were used:(1) Aspect ratio defined as the ratio of the ellipse major axis to the minor axis. (2) Circularity given as,
$$\begin{aligned} C =\frac{4\pi *\text{Area}}{\text{Perimeter}^2}, \end{aligned}$$ (1)and roundness given as,
$$\begin{aligned} R =\frac{4*\text{Area}}{\pi *\text{MajorAxis}^2}. \end{aligned}$$ (2)Segmented vinculin areas with a fitted ellipse that were too round (aspect ratio \(\le 1.5\)) or too elongated (aspect ratio \(\ge 8.5\)) were rejected. In addition, vinculin areas smaller than 0.05 μm 2 were filtered out. In order to find the distance between each vinculin area and the cell edge, the shortest euclidean distance between each centroid (the centre of the fitted ellipse for each vinculin area) and the cell edge was calculated.
Statistical comparisons of distributions were performed by using the non-parametric two-tailed Mann-Whitney test neither assuming normal distribution nor equal standard deviation. 피 -values \(\ge {0.05}\) were considered to represent a non-significant (ns) difference between the two populations. Significant values were denoted with * for p in 0.01 to 0.05, ** for p in 0.001 to 0.01, *** for p in 0.0001 to 0.001 and lastly **** for p \(\le {0.0001}\).
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium
Electron Beam Lithography
Extracellular Matrix
Ethylenediaminetetraacetic Acid
Focal Adhesion
Fetal Bovine Serum
Green Fluorescent Protein
Hexamethyldisilazane
Nanopillar
Red Fluorescent Protein
Scanning Electron Microscopy
나노물질
초록 나노 크기의 산화주석은 간단하고 비용 효율적인 침전 기술로 제작되었으며 x-선 분말 회절(XRD), 푸리에 변환 적외선(FT-IR) 분광법, 고해상도 투과 전자(HR-TEM) 현미경을 수행하여 분석되었습니다. , 에너지 분산 X선(EDX) 및 UV-Vis 분광법. XRD 결과는 주석 산화물 입자가 전형적인 사방정계 구조를 가지며 어닐링으로 개선된 결정성을 나타냄을 보여주었다. 250°C에서 하소하면 주로 사방정계 SnO가 생성되어 SnO2로 변환됩니다. 500 및 750°C의 더 높은 온도에서 HRTEM 및 FESEM 이미지
초록 파킨슨병(PD)은 중뇌에서 도파민성 뉴런의 점진적인 소실을 특징으로 하며, 줄기 세포 이식 방법은 치료를 위한 유망한 전략을 제공합니다. 이러한 연구에서 생체 내 이식된 세포의 생물학적 행동을 추적하는 것은 줄기 세포 기능에 대한 기본 이해와 임상 효과 평가에 필수적입니다. 본 연구에서 우리는 열분해 방법과 2단계 개질을 통해 폴리아크릴산(PAA)과 메톡시폴리에틸렌글리콜아민(PEG)으로 코팅된 새로운 초소형 초상자성 산화철 나노입자를 개발했습니다. USPIO-PAA/PEG NP는 TEM 및 FTIR에서 볼 수 있듯이 10.0