Artesunate의 나노입자 전달은 미토콘드리아 매개 세포 사멸을 활성화하여 항종양 효율성을 향상시킵니다.

방법

자료

BSA는 Sigma-Aldrich Co.(미국 미주리주 세인트루이스)에서 구입했으며 Ats는 Guilin Pharmaceutical Corporation(중화인민공화국 구이린)에서 구입했습니다. SMMC-7721 세포와 Plc 세포는 중국과학원 생화학 및 세포생물학 연구소(중화인민공화국 상하이)에서 구입했습니다. 구매한 다른 모든 화학 물질은 분석 등급이었습니다. 다양한 공급업체에서 구입했습니다.

Ats 로딩 BSA NP의 준비 및 특성화

이전에 보고된 문헌[27]에 따르면 Ats-loaded BSA NP는 탈용매화 방법을 통해 준비되었습니다. 간단히 말해서, Ats가 로딩된 BSA NP는 유백색이 될 때까지 37°C에서 0.5mL의 BSA 용액에 일정량의 Ats를 함유하는 1.0mL의 무수 알코올을 빠르게 떨어뜨려 제조했습니다. 회전 증발에 의한 에탄올 제거와 함께 Ats-loaded BSA NPs가 배지에서 추가로 침전되었고, 그 다음 물 중 8% 글루타르알데히드(0.5μL/BSA의 mg)를 첨가하여 일정 기간 동안 현탁액을 교반하면서 입자 가교를 유도했습니다. 24시간 마지막으로, NP를 수집하고 탈이온수로 3회 세척하여 Brookhaven Zetasizer(Brookhaven Instruments Corporation, Holtsville, NY, USA)를 사용하여 유체역학적 직경, 다분산 지수(PDI), 제타 전위 및 형태를 포함한 물리적 특성을 추가로 분석했습니다. 및 투과 전자 현미경(JEM-1200EX; JEOL, Tokyo, Japan). BSA NP에서 Ats의 캡슐화 효율성 결정은 이전에 보고된 방법을 사용하여 추정되었습니다[27].

MTT 분석

두 종류의 종양 세포주, SMMC-7721 세포 및 Plc 세포를 20% 소태아혈청(FBS)과 별도로 배양하였다. 세포 성장 밀도는 l × l0 ⁶ 으로 조정되었습니다. 세포 수에 따라 세포/mL, 그 다음 세포 현탁액을 1 × 10 ⁵ 으로 희석했습니다. 세포/mL. 희석된 현탁액을 96웰 플레이트에 별도로 추가로 추가했습니다(웰당 100μL, 약 1 × 10 ⁴ 세포/웰) 5% CO₂ 조건에서 37°C에서 24시간 연속 배양 및 95% O₂ . 배지는 다양한 농도의 Ats를 특징으로 하는 유리 Ats 또는 Ats-로딩된 BSA NP가 있는 상태에서 무혈청 배지로 교체한 후 24시간 동안 배양했습니다. 총 50μL의 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐 테트라졸륨 브로마이드(MTT)(5mg/mL)를 각 웰에 첨가하고 배양 종료를 위해 4시간 동안 인큐베이션했습니다. 테트라졸륨 염료 MTT가 불용성 포르마잔으로 환원되면 96웰 플레이트를 1000rpm에서 5분 동안 원심분리하고 각 웰에서 상등액을 따라낸 다음 150μL의 디메틸 설폭사이드(DMSO)를 첨가합니다. 결정을 녹였습니다. 용액의 흡광도는 490nm에서 마이크로플레이트 판독기(Syneray-2; BioTek Instruments, Inc., Winooski, VT, USA)를 사용하여 측정되었습니다.

세포에서 BSA NP 그룹의 세포내 분포

대수기의 SMMC-7721 세포 및 Plc 세포를 선택하고 트립신 소화로 처리했습니다. 세포 농도를 l × 10 ⁶ 으로 조정했습니다. 세포/mL. 다음으로, 배양된 세포를 6-웰 세포 배양 플레이트에 부착하여 부착하고, 배양 배지를 제거한 후 로다민 B-표지된 BSA NP를 첨가하였다. 핵은 37°C에서 15분 동안 Hoechst(파란색)로 염색되었고 미토콘드리아는 Mitotracker Green FM으로 염색되었습니다. 세포 내 BSA NP의 위치는 공초점 레이저 스캐닝 현미경(FluoView FV10i; Olympus Corporation, Tokyo, Japan)을 사용하여 세포 내에서 추적되었습니다.

미토콘드리아 막 잠재적 변화

JC-1은 미토콘드리아 막 전위의 변화를 결정하는 데 사용할 수 있습니다. 미토콘드리아 막 전위가 높을 때 JC-1은 세포막을 자유롭게 통과할 수 있었고 미토콘드리아 내에서 응집체를 형성하여 적색 형광(여기 파장, 525nm, 방출 파장, 590nm)을 나타냅니다. 미토콘드리아 막 전위가 감소하면 JC-1이 미토콘드리아 기질에서 세포 세포질로 이동하여 녹색 형광 단량체(여기 파장, 490nm, 방출 파장, 530nm)를 형성합니다. SMMC-7721 세포와 Plc 세포는 각각 l × l0 ⁶ 의 밀도에 도달하도록 공초점 접시에 접종했습니다. 12시간 동안 연속 배양을 위한 세포/mL. 다음으로, 배양 배지를 버리고 Ats 또는 Ats-로딩된 BSA NP의 분산액을 함유하는 무혈청 배양 배지를 접시에 첨가하였다. 9시간 후, 배지를 버리고 세포를 PBS로 2회 세척한 다음, 2μmol/L 농도의 JC-1 2mL를 첨가했습니다. 그런 다음 세포를 어두운 조건에서 37°C에서 30분 동안 인큐베이션했습니다. 레이저 스캐닝 공초점 현미경(FluoView FV10i, Olympus Corporation)을 사용하여 미토콘드리아 막의 영상 변화를 관찰했습니다.

ROS 생산 측정 및 소포체(ER) 염색

세포를 20% FBS와 함께 배양하고 세포 성장 밀도를 1 × 10 ⁶ 으로 조정했습니다. 세포 수에 의한 세포/mL; 그런 다음 세포 현탁액을 1 × 10 ⁵ 으로 희석했습니다. 세포/mL. 희석된 현탁액을 96웰 플레이트에 추가로 첨가했습니다(웰당 100μL, 약 1 × 10 ⁴ 세포/웰) 37°C, 5% CO₂에서 24시간 동안 연속 배양 및 95% O₂ . 두 번째로, 유리 Ats 및 Ats가 로딩된 BSA NP를 6, 12, 24시간 동안 세포와 함께 배양한 다음 약 30분 얼음처럼 차가운 PBS 버퍼를 사용하여 세포를 세 번 세척하여 내부화되지 않은 NP를 제거했습니다. 485nm에서 여기되고 530nm에서 방출되는 세포 내 DCF 형광 강도는 산화 스트레스의 정도를 조사하기 위해 마이크로플레이트 리더(Synergy-2; BioTek Instruments)를 사용하여 감지되었습니다. 테스트 그룹은 SMMC-7721 세포와 Plc 세포로 24시간 처리하고 ER-Tracker Blue-White DPX 프로브(Molecular Probes, Eugene, OR, USA)를 세포에 추가하여 30분 동안 배양했습니다. 로딩 용액을 버리고 PBS로 세포를 세척한 후 공초점 레이저 스캐닝 현미경으로 ER의 형태 변화를 관찰했습니다.

유세포분석에 의한 세포 종양 및 세포자멸사 평가

우리의 이전 연구의 프로토콜[28]에 따르면 Annexin V-fluorescein isothiocyanate (FITC)/propidium iodide (PI) 염색 분석은 유리 Ats 및 Ats가 로딩된 BSA NP에 의해 유도된 세포 종양 및 세포 사멸을 평가하는 데 사용되었습니다. 세포를 typsin으로 용해하고 1 × 10 ⁶ 농도로 6웰 플레이트에 접종했습니다. 연속 배양 24시간 동안 세포/mL. 다음으로, 배양 배지를 제거하고 유리 Ats 및 Ats-로딩된 BSA NP를 함유하는 무혈청 배지를 웰에 첨가하였다. 처리 후, 세포를 수집하고 PI 및 FITC로 표지된 Annexin V(AV-FITC)를 함유하는 Nicoletti 완충액(Beijing 4A Biotech Co., Ltd., Beijing, People's Republic of China)에 현탁시켰다. 공초점 레이저 주사현미경으로 세포의 형태적 변화를 관찰하였다. Ats-loaded NP에 의해 유도된 세포 사멸 및 종양 발생 비율을 확인하기 위해 초기 세포사멸(Q4), 종양(Q2), 괴사(Q1) 및 살아있는 세포(Q3)의 백분율을 유세포 분석으로 정량화했습니다.

세포의 세포사멸 관련 단백질 및 시토크롬 C의 웨스턴 블롯 분석

유리 Ats 또는 Ats-로딩된 NP가 SMMC-7721 세포와 함께 24시간 동안 배양되었을 때 상대 단백질의 수준을 결정하기 위해 웨스턴 블롯 분석을 수행했습니다. 세포는 프로테아제 억제제 칵테일 및 포스파타제 억제제(Roche, Basel, Switzerland)를 포함하는 얼음처럼 차가운 방사성면역침전 분석(RIPA) 완충액으로 용해되었습니다. 단백질 농도는 변형된 BSA 분석 키트(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)를 사용하여 결정하고 10% 소듐 도데실 설페이트(SDS)-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE)에 로딩하기 전에 정규화했습니다. 표적 단백질의 수준을 촬영하고 UVP 겔 분석 시스템(iBox Scientia 600; UVP, LLC., Upland, CA, USA)을 사용하여 분석했습니다.

결과

Ats-Loaded BSA NP 및 세포 생존 연구의 특성

그림 1a, b에서 Ats가 로딩된 BSA NP는 구형을 나타내며 0.016에서 더 낮은 PDI로 균일하게 분산되어 있음을 알 수 있습니다. Ats 부하 BSA NP의 평균 입자 크기는 약 99.9 ± 2.3nm이고 제타 전위는 음수이며 약 -25.6 ± 4.3mV로 평가되었습니다. 방출 프로필은 그림 1c와 같이 매끄럽고 지속 방출을 보여주었습니다. 시험관 내 배지에서 유리 Ats의 빠른 방출과 비교하여 BSA NP의 코어에 갇힌 Ats는 BSA의 지속적인 분해로 인해 NP 내부에서 배지로 천천히 확산되고 매끄럽고 지속 방출 패턴을 보였다. 자유 Ats의 85% 이상이 처음 6시간 이내에 완전히 방출된 반면, 48시간 동안 NP에서 미디어로 방출된 약물의 총 누적량은 78.9%였습니다. 이는 나노입자가 길고 부드러운 패턴으로 생체 물질의 분해를 통해 약물의 방출을 제어할 수 있음을 나타내므로 제거 반감기를 연장하고 유효 혈액 농도를 개선하며 투여 빈도를 감소시킬 수 있습니다.

Ats 부하 BSA NP의 특성. 아 Ats 로딩 BSA NP의 TEM 이미지. ㄴ 얻은 Ats 부하 BSA NP의 동적 광산란(DLS) 분석. ㄷ 48시간 동안 37°C에서 pH 7.4인 인산염 완충 식염수에서 Ats가 로딩된 BSA NP의 시험관 내 방출 프로필. SMMC-7721 세포의 생존력(d ) 및 PLC 셀(e ) 24시간 동안 다양한 양의 무료 Ats 및 Ats 로드 BSA NP로 배양한 후 데이터는 평균 ± SD(n =3). ^# 피 <0.05 대 해당 무료 Ats

MTT를 사용하여 SMMC-7721 세포와 Plc 세포에서 자유 Ats 및 Ats-loaded BSA NP의 억제 효과를 서로 다른 시간 간격으로 조사했습니다. 결과(그림 1d, e)는 약물 농도가 증가함에 따라 유리 Ats의 세포 독성이 증가하고 Ats-loaded BSA NPs가 점진적으로 향상된 세포 독성을 나타냄을 보여주었습니다. 이것은 Ats와 Ats가 로딩된 BSA NPs가 종양 세포의 성장을 억제하고 억제율이 Ats의 용량에 의존한다는 것을 증명했습니다. 유리 Ats와 비교하여 Ats가 로드된 BSA NP는 두 세포 모두에서 더 높은 세포 독성과 더 높은 민감성을 보여주었으며 더 큰 세포 억제를 초래했습니다. 그림 1d, e에서 볼 수 있듯이 Ats가 로드된 BSA NP로 두 세포를 모두 처리하면 유리 Ats와 비교할 때 24시간에 세포 생존율이 크게 감소했습니다. Ats-loaded BSA NP로 처리된 SMMC-7721 세포 및 Plc 세포에 대한 50% 최대 억제 농도(IC50) 값은 24시간에서 각각 50.1 및 44.9μg/mL였으며, 이는 69.2 및 74.9에서 얻은 값과 비교됩니다. 유리 Ats로 처리된 세포에서 24시간에 μg/mL 이것은 Ats가 BSA NP에 로드되었을 때 NP에 의해 매개되는 세포 내 위치를 변경하고 궁극적으로 더 많은 세포를 죽일 수 있음을 나타냅니다.

BSA NP의 체외 세포 흡수

두 가지 유형의 종양 세포에서 BSA NP의 세포 내 분포와 위치는 그림 2와 같이 공초점 레이저 스캐닝 현미경으로 관찰되었습니다. 로다민 B로 표지된 NP를 3시간 동안 세포와 공동 배양한 후, 적색 형광이 명확하게 보였습니다. 세포질에서; 시간이 지남에 따라 대부분의 BSA NP는 세포 내로 내재화되고 세포질로 확산되어 향상된 시간 의존적 적색 형광을 나타냅니다. 또한 세포질에 위치한 BSA NP가 미토콘드리아와 같은 위치에 있다는 것이 관찰되었는데, 이는 황색 형광의 출현에 의해 명백해졌으며, 이는 로다민 B로 표지된 NP의 고유한 적색 형광과 미토콘드리아 지표 MitoTracker® 녹색 FM이 병합되었습니다. 이것은 내재화된 BSA NP가 미토콘드리아 내에 구체적으로 축적될 수 있음을 증명하여 BSA NP를 매개로 Ats가 미토콘드리아로 전달될 가능성을 강조합니다.

다른 종양 세포와 함께 배양한 후 BSA NP의 시험관 내 세포 분포. SMMC-7721 세포의 형광 이미지(a ) 및 PLC 셀(b ). 축척 막대 , 100μm

미토콘드리아 막 전위 분석

Ats가 로딩된 BSA NP가 미토콘드리아에서 Ats가 전달된 후 미토콘드리아 기능을 방해하는지 여부를 명확히 하기 위해 미토콘드리아 막 전위의 변화가 결정되었습니다. 그림 3은 JC-1 염색 후 유리 At로 처리된 종양 세포의 미토콘드리아 대부분이 강한 적색 형광과 약한 녹색 형광 강도를 나타냄을 보여줍니다. 이는 JC-1의 대부분이 응집된 상태로 존재하여 미토콘드리아 막의 완전성과 더 높은 잠재력을 강화함을 시사한다. 반대로 JC-1이 Ats가 로딩된 BSA NPs 처리된 세포를 염색했을 때, 두 종양 세포의 미토콘드리아는 더 강한 녹색 형광을 나타내어 미토콘드리아 막이 심각하게 손상되었고 그 잠재력이 현저히 감소되었음을 나타냅니다. 종합하면, Ats가 BSA NP를 매개로 미토콘드리아로 성공적으로 전달되어 미토콘드리아 막 탈분극이 발생함을 입증했습니다.

SMMC-7721 세포 및 Plc 세포와 함께 유리 Ats 및 Ats-로딩된 BSA NP의 배양 후 미토콘드리아 막 전위의 영상 변화. 축척 막대 , 100μm

ER의 ROS 생산 측정 및 염색

많은 수의 ROS가 생성되면 미토콘드리아 내막에서 인지질 과산화가 일어날 수 있고, 미토콘드리아 막 전위의 감소도 유도하여 시토크롬 C의 빠른 방출을 유발할 수 있음이 널리 확인되었습니다. 우리는 DCFH-를 사용했습니다. DA는 ROS의 변화를 감지하는 형광 프로브입니다. DCFH-DA는 세포막을 통해 세포 내로 자유롭게 통과하였고 에스테라제 가수분해에 의해 DCFH로 형질전환되었다. 생성된 DCFH는 세포막을 통과할 수 없으며 세포에 쉽게 로딩될 수 있습니다. 세포내 ROS는 비형광성 DCFH를 녹색 형광색을 갖는 DCF로 산화시켰다. 따라서 DCF 형광 검출은 세포 내 ROS의 수준을 나타낼 수 있습니다.

두 세포에 유리 Ats와 Ats가 로딩된 BSA NP를 일정 시간 처리했을 때 세포 내 ROS의 양도 증가하여 시간 의존적 관계를 보였다. 유리 Ats와 비교하여, Ats가 로딩된 BSA NP로 처리된 SMMC-7721 세포 및 Plc 세포에서 ROS 생성이 상당히 향상되었습니다. 그림 4a는 처리된 SMMC-7721 세포 및 Plc 세포와 비교할 때 48시간 동안 Ats가 로딩된 BSA NP에 노출된 SMMC-7721 세포 및 Plc 세포의 ROS 수준이 각각 1.53배 및 1.28배 증가했음을 보여줍니다. 무료 Ats와 함께. 이것은 NP가 세포 내 ROS 생성을 가속화한다는 아이디어를 뒷받침합니다. 대조군 및 유리 Ats와 비교하여 Ats가 로딩된 BSA NP로 처리한 후 ER 특이적 염료인 ER-Tracker Blue-White DPX의 형광 염색 강도가 크게 증가하여 ER 스트레스도 유발되었음을 시사합니다. ROS 수준의 상응하는 증가와 함께 Ats 로딩 NP 처리 세포에서. 이 발견은 Ats가 BSA NP에 의해 매개되는 미토콘드리아에 특이적으로 위치한다는 것을 강조했습니다. 이것은 세포 내 산소가 없는 라디칼의 수준을 크게 증가시켜 ER 스트레스의 유도를 유발하고 미토콘드리아 경로를 활성화하여 카스파제 의존적 세포 사멸을 유도합니다.

서로 다른 시간에 유리 Ats 및 Ats-loaded BSA NP로 처리된 세포에서 ROS 생성의 정량화(a ). ER-Tracker Blue-White DPX 프로브를 사용한 ER 염색(b ). 축척 막대 , 100μm 데이터는 평균 ± SD(n =3). ⁺ 피 <0.05 대 12시간의 대조군, *P <0.05 대 대조군 24시간, ^# 피 <0.05 대 대조군 대비 24시간

세포 사멸 및 괴사의 평가

세포는 Annexin V-FITC/PI 염색 분석에 의해 처리되었습니다. 살아있는 세포는 Annexin V-FITC/PI에 결합하지 않아 형광이 나타나지 않았다. Apoptotic 세포는 PI에 결합하지 않았지만 Annexin V-FITC로 염색하여 녹색 형광을 생성했습니다. 반면 oncotic cell의 경우 세포막이 어느 정도 손상되어 세포핵이 확장되어 조각조각 쪼개져 녹색과 적색 형광을 동시에 보였다. 도 5a에 나타난 바와 같이 대조군과 비교하여 유리 Ats 및 Ats-로딩된 NP가 세포와 함께 24시간 동안 배양되었을 때 세포에서 강한 녹색 및 적색 형광이 관찰되었으며, 이는 자유 Ats 및 Ats-로딩된 BSA NP가 유도된 종양 세포 종양 및 아폽토시스. 특히 Ats-loaded BSA NPs 처리 후 Annexin V-FITC와 PI에서 얻은 염색 형광 강도가 크게 증가하여 Ats-loaded NPs 처리 세포에서 종양 및 세포 사멸 정도가 유의하게 향상되었음을 시사합니다. /P> <그림>

Annexin V-FITC/PI 염색 분석(a ). 축척 막대 , 100μm 유리 Ats 및 Ats-loaded BSA NP로 배양 24시간 후 세포 사멸 및 종양의 유세포 분석기 분석(b )

초기 세포자멸사(Q4), 종양성(Q2), 괴사성(Q1) 및 살아있는 세포(Q3)의 백분율은 그림 5b에 나와 있습니다. 이 발견은 세포에 유리 Ats를 처리했을 때 종양 발생률이 점차적으로 24.4%와 4.6%로 증가했으며 세포자멸률은 SMMC-7721 세포와 Plc 세포에서 각각 4.9%와 7.1%로 유지되었음을 보여줍니다. oncosis와 apoptosis의 발생은 세포 사멸로 이어진다. 반대로, Ats-loaded BSA NP는 세포 사멸 및 종양의 비율을 유의하게 개선했습니다. 세포 사멸 비율은 SMMC-7721 세포에서 10.9%, Plc 세포에서 11.5%로 유의하게 증가했습니다. 종양 비율은 SMMC-7721 세포에서 29.0%, Plc 세포에서 21.6%로 증가했습니다. 이것은 BSA NP를 매개로 한 Ats의 미토콘드리아 전달이 종양 및 세포 사멸 효과를 향상시켜 종양 세포의 사멸을 가속화한다는 것을 나타냅니다. Ats-loaded BSA NPs는 세포사멸 신호 전달 과정을 촉발하고 세포 사멸의 미토콘드리아 매개 캐스케이드 반응을 촉진했습니다.

서부 얼룩 분석

유리 Ats 및 Ats-loaded NP에 의해 유도된 세포 사멸에 대한 세포 사멸의 의존성을 조사하기 위해 세포 사멸 단백질의 발현을 검출하기 위해 웨스턴 블롯 분석을 수행했습니다. Ats가 로딩된 NPs 처리된 SMMC-7721 세포에서 Bax 단백질의 세포 내 발현 수준이 유의하게 증가하는 것으로 나타났습니다(그림 6). 이 발견은 BSA NP의 도움으로 Ats가 미토콘드리아에 축적되어 미토콘드리아 기능 장애를 유발함을 시사했습니다. 세포질의 Bax 단량체 단백질이 미토콘드리아 외막으로 옮겨지고 올리고머화되어 미토콘드리아 외막에 단백질 채널이 형성되어 막 투과성을 더욱 증가시킵니다. 세포질 내 시토크롬 C의 발현도 특히 유의하게 증가하였고, caspase-3 및 caspase-9의 발현도 증가하는 경향을 보이는 것으로 나타났다. 따라서 미토콘드리아의 높은 막 투과성으로 인해 시토크롬 C가 세포질로 빠르게 방출되어 세포 사멸 신호 단백질(caspases)을 활성화하고 세포 사멸의 연쇄 반응을 촉진합니다. 대조적으로, 유리 Ats는 세포 사멸 관련 단백질과 시토크롬 C의 발현에 큰 차이가 없었으며, 이는 유리 Ats가 미토콘드리아 매개 세포 세포 사멸을 촉발하지 않았고 주로 종양에 의존하여 세포 사멸을 초래했음을 시사합니다. BSA NP는 미토콘드리아에서 약물의 축적을 강화하고 미토콘드리아 매개 세포자멸사 효과를 활성화하여 우리의 웨스턴 블롯 분석에서 볼 수 있듯이 상당한 세포자멸사를 유도하고 1차 세포사멸 관련 단백질의 발현을 증가시킵니다.

SMMC-7721 세포에서 절단된 caspase-3, caspase-9, Bax 및 시토크롬 C의 발현 수준에 대한 웨스턴 블롯 분석. *피 대조군의 Bax 단백질 발현에 비해 <0.05; ^# 피 대조군의 절단된 카스파제-3 발현에 비해 <0.05; ⁺ 피 대조군의 카스파제-9 단백질 발현에 비해 <0.05; ^x 피 대조군의 시토크롬 C 단백질 발현에 비해 <0.05. 데이터는 평균 ± SD(n =3)