나노 스케일 이산화티타늄(nano-TiO2 ) 산업과 의학에서 널리 사용되었습니다. 그러나 nano-TiO2의 안전성은 노출은 여전히 불분명합니다. 이 연구에서 우리는 간, 뇌 및 배아 독성과 nano-TiO2의 기본 메커니즘을 평가했습니다. 마우스 모델을 사용하여 결과는 복강내(i.p.) nano-TiO2 후 마우스의 심장, 뇌, 비장, 폐 및 신장에 티타늄이 분포되어 축적됨을 보여주었습니다. 노출량 의존적 방식으로. 심장, 비장, 신장의 장기/체중비는 유의하게 증가하였고 뇌와 폐의 체중비는 감소하였다. 고용량의 nano-TiO2 혈액 생화학 검사에서 나타난 바와 같이 간과 신장, 포도당 및 지질 대사의 기능을 크게 손상시켰습니다. 나노-TiO2 쥐의 간에서 미토콘드리아 손상과 간세포의 세포자멸사, 활성산소 생성, 보호 유전자 발현 장애를 일으켰다. 뇌에서 파열되고 갈라진 신경 세포와 염증 세포 침윤을 발견했습니다. 우리는 또한 구성적 산화질소 신타제(cNOS), 유도성 NOS(iNOS) 및 아세틸콜린에스테라제의 활성과 아산화질소 및 글루탐산의 수준이 nano-TiO2 후 뇌에서 변화되었음을 발견했습니다. 노출. 생체 외 마우스 배아 모델은 고용량의 nano-TiO2 후 발달 및 유전 독성을 나타냈습니다. . 나노-TiO2의 크기 입자는 독성에 영향을 미칠 수 있으며, 입자가 클수록 더 높은 독성을 생성합니다. 요약하면, nano-TiO2 i.p. 주사와 위관. 우리의 연구는 나노-TiO2의 위험 평가를 위한 데이터를 제공할 수 있습니다. 인체 건강에 대한 노출.
<섹션 데이터-제목="배경">
배경
나노 스케일 이산화티타늄(nano-TiO2 ) 식품 산업에서 널리 사용됩니다. 코팅 캔디, 보존 과일, 츄잉껌, 탄산 음료, 분말 음료(무가당 제형 또는 농축), 우유 및 유제품 및 기타 식품 범주의 생산에 사용되었습니다[1, 2]. 나노-TiO2의 농도 식품에서 0.5–9g/kg까지 도달하며[1, 3], nano-TiO2가 없다고 주장되는 많은 식품에는 nano-TiO2가 포함되어 있습니다[2]. 나노-TiO2 또한 생물 의학, 유기 오염 물질 처리, 재료 공학 및 화장품에 널리 사용되었습니다 [4,5,6]. 그러나 nano-TiO2의 안전성은 노출은 여전히 불분명합니다.
연구에 따르면 nano-TiO2 복강을 통한 투여 또는 흡입과 같은 여러 방법을 통해 체내에 들어간 후 여러 기관에서 농축 및 독성이 될 수 있습니다[7, 8]. 나노-TiO2 인간 림프모구양 세포 및 간암 세포와 같은 여러 유형의 세포에 독성이 있을 수 있습니다[9, 10]. 마우스 뇌의 신경교세포에서 급성 스트레스 반응을 유도하여 뉴런 손상 및 기능 장애를 유발할 수 있습니다[11]. nano-TiO2에 노출된 뉴런 세포주의 생존율 입자는 전형적인 시간 및 용량 의존적 방식으로 상당히 감소합니다[12].
연구에 따르면 이러한 나노 입자가 독성을 유발하는 몇 가지 메커니즘이 밝혀졌습니다. 나노-TiO2 입자는 분자 복합체의 구조와 세포막의 투과성을 변화시켜 유전적 독성을 유발할 수 있다[13,14,15]. 나노-TiO2 산화 스트레스를 유발할 수 있습니다. 산화 스트레스 동안 하이드록실 라디칼과 같은 활성 산소 종(ROS)이 생성되어 DNA 산화를 일으켜 8-OHG를 생성하여 DNA 복제의 오류 및 돌연변이를 유발합니다[16, 17]. 또한, ROS는 염증과 산화 스트레스와 염증 사이의 상호 피드포워드 상호작용을 유도하여 DNA 손상과 세포 사멸을 유발할 수 있습니다[18, 19]. 그러나 nano-TiO2의 독성에 대한 종합적이고 체계적인 데이터 제한적으로 남아 있습니다. 우리의 목표는 nano-TiO2의 효과와 기본 메커니즘을 밝히는 것이었습니다. 인체 건강에 대한 노출.
이 연구에서 우리는 nano-TiO2의 효과와 기본 메커니즘을 평가했습니다. 마우스 모델을 사용한 노출. 우리의 발견은 nano-TiO2 산화 환원 불균형 및 유전자 발현 장애를 일으켜 간, 신장, 비장, 심장, 폐 및 뇌와 같은 여러 기관에 농축되어 독성을 유발할 수 있습니다. 이것은 또한 배아 발달에 손상을 줄 수 있습니다. 우리의 연구는 nano-TiO2의 인체 건강에 대한 잠재적 위험을 평가하기 위한 데이터를 제공할 수 있습니다. 노출.
방법
화학물질 및 시약
마이크로 스케일 TiO2 (마이크로 TiO2 ) 및 5nm의 TiO2 아나타제 형태는 Sigma-Aldrich(중국 상하이)에서 구입했으며 10, 60, 90nm의 TiO2 (anatase)는 Run He Ltd.(Shanghai, China)에서 구입했습니다. 포름알데히드, 질산, 과산화수소 및 헤파린 나트륨은 시약 등급이며 Sigma-Aldrich(Shanghai, China)에서 구입했습니다. 인산 완충액(PBS), 페니실린 및 스트렙토마이신은 Gibco(San Diego, USA)에서 구입했습니다. Total RNA 추출 키트는 Takara(Dalian, China)에서 구입했습니다. 활성 산소 종 분석 키트는 Jianchen Ltd.(Nanjing, China)에서 구입했습니다. 재고 TiO2 Hank 용액의 현탁액(1%)을 121°C에서 30분 동안 멸균했습니다. 현탁액을 초음파 처리하고 사용 직전에 원하는 농도로 희석했습니다.
동물 및 모델
간 및 뇌 독성 연구를 위해 중국 의과대학 동물센터에서 ICR(각인 제어 영역) 마우스(22±3g, 절반은 수컷, 절반은 암컷)를 구입했습니다. 동물과 관련된 모든 실험 절차는 기관 윤리 위원회 Tianjin University of Science and Technology의 사전 승인을 받았으며 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 국제 지침에 따라 수행되었습니다. 마우스 배아 독성 연구를 위해 Beijing Weitong Lihua Ltd.(중국 베이징)에서 ICR 마우스(암컷 45마리, 20~35g, 수컷 15마리, 35~40g)를 구입했습니다. 모든 쥐는 건강하고 성적으로 성숙했습니다. 처리 5일 전에 마우스는 통풍이 잘되고 12시간 명암 주기, 20±2°C, 60±10% 상대 습도, 음식과 물에 대한 임의의 접근이 가능한 별도의 우리에서 사육되었습니다.
투약 요법 1은 일반 독성 및 뇌 독성 시험을 위해 설계되었습니다. 마우스를 무작위로 6개 그룹과 추가 대조군으로 나누었으며, 그룹당 10마리의 마우스를 사용했습니다. 나노 스케일 TiO2 (나노-TiO2 ) 현탁액을 14일 동안 하루에 한 번(복강 내(i.p.), 5, 10, 50, 100, 150 및 200mg/kg) 주사했습니다. 대조군의 마우스에 식염수를 주입하였다. 생쥐는 매일 관찰되었으며 연구 기간 동안 죽은 동물은 없었습니다. 15일째에 안와동에서 혈액 샘플을 채취했습니다. 모든 마우스의 체중을 개별적으로 측정하고 2% 페노바르비탈(60ml/kg, i.p.)로 마취한 다음, 경추 탈구를 통해 희생시켰다. 모든 조직 샘플을 수집하고(피질과 해마에서 분리된 뇌 조직) -80°C에서 보관했습니다. 각 심장, 간, 비장, 폐 및 신장을 두 부분으로 절단했습니다. 병리학적 검사를 위해 4°C의 포르말린(10%) 용액에 한 부분을 담가 두었습니다. 다른 부분은 티타늄 함량 측정을 위해 −20°C에 보관되었습니다.
투여 요법 2는 간 독성 시험을 위해 설계되었습니다. 마우스를 3개의 실험군과 1개의 대조군으로 나누었다. 나노-TiO2 (5, 10, 50 mg/kg)을 60일 동안 위관영양법을 통해 1일 1회 투여했습니다. 대조군의 마우스는 0.5% CMC(카르복시메틸 셀룰로오스)를 받았습니다. 생쥐는 매일 관찰되었으며 연구 기간 동안 죽은 동물은 없었습니다. 60일째에 2% 페노바르비탈(60ml/kg, ip)로 마우스를 마취시킨 후 경추 탈구를 통해 희생시킨 후 간을 즉시 채취하여 전자현미경을 이용한 검사, ROS 및 지질산화 측정을 위해 처리하였다. , 및 유전자 발현 분석.
표적 조직의 티타늄 함량 측정
0.1-0.5g의 냉동 조직 샘플을 절단하여 실온에서 해동한 다음 HNO3에서 소화했습니다. (0.5mL) 및 H2 O2 (0.5mL), 160°C에서 3% 질산으로 3mL로 희석한 후, 유도 결합 플라즈마 질량 분석기(ICP-MS)를 사용하여 용액 내 티타늄 농도를 측정했습니다. 그런 다음 표적 조직의 티타늄 함량을 계산했습니다.
혈액 생화학 검사 및 장기/체중 비율 계산
혈청 샘플의 효소 수준은 자동 생화학 분석기(TBA-2000FR, Toshiba, Tokyo, Japan)로 분석되었습니다. 이 효소는 간과 신장의 기능과 관련된 바이오마커입니다.
장기/체중 비율은 장기와 신체의 무게를 기준으로 계산되었습니다. 체중은 마취 및 희생 전에 측정되었습니다. 마취되고 희생된 마우스로부터 분리된 후 기관의 무게를 측정했습니다.
병리학적 검사 및 투과전자현미경
헤마톡실린 염색 후 광학현미경으로 포르말린에 적신 간 또는 뇌조직의 병리학적 검사를 시행하였다. 투과전자현미경(TEM)의 경우, 간 조직을 에폭시 수지 EPON 812에 포매하고 글루타르알데히드 및 오스믹산 고정 후 <500μM의 얇은 절편으로 절단했습니다. 절편을 포화 아세트산 우라늄 용액(pH 3.5)과 구연산 납(pH 12)으로 1~2시간 동안 염색했습니다. TEM을 사용하여 염색된 섹션을 검사했습니다.
반응성 산소 종의 수준, 대사 효소의 활동 및 신경 전달 물질의 수준 결정
간 조직의 경우 과산화물 음이온(O2
–
) 수준은 XTT를 사용하여 결정되었습니다. 카탈라아제(CAT)의 활성은 공개된 절차에 따라 240nm에서 OD 값을 사용하여 결정되었습니다[20]. 지질 과산화 수준은 공개된 절차에 따라 말론디알데히드(MDA) 함량에 따라 결정되었습니다[21].
분리 후 뇌 조직을 미리 냉각된 1% 폴리비닐폴리피롤리돈 용액(pH 7.6 PBS 중 50mM)으로 균질화했습니다. 15,000rpm에서 20분 동안 원심분리한 후 상청액을 수집하고(Eppendorf 5418, Hamburg, Germany), 수퍼옥사이드 효소(SOD), CAT, 아스코르브산 과산화효소(APX) 및 글루타티온 과산화효소(GSHPx)의 활성에 대한 후속 분석에 사용했습니다. SOD 활성은 NBT(nitro-tetrazolium chloride blue test)를 사용하여 결정되었습니다. 카탈라아제 활성은 키트(CAT 분석 키트, A007-2, Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, China)를 사용하여 결정되었습니다. APX의 활성은 키트(APX assay kit, A123, Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, China)를 사용하여 측정하였다. GSHPx 활성은 키트(GSHPx 분석 키트, A005, Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, China)를 사용하여 결정되었습니다. 구성적 산화질소 합성효소(cNOS), 유도성 산화질소 합성효소(iNOS) 및 아세틸콜린에스테라아제(Ache)의 활성은 상용 키트(Ache assay kit, A024, Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, China)를 사용하여 결정되었습니다.
뇌 조직의 ROS 수준은 2', 7' 디클로로플루오레신 디아세테이트를 뇌 조직 균질액에 최종 농도 10μM로 첨가하고 37°C에서 30분 동안 배양하여 결정했습니다. 그런 다음 유세포 분석을 사용하여 조직을 분석했습니다.
상대적 mRNA 수준 결정
상용 키트(TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit, 9767, Takara, Dalian, China)를 사용하여 간 조직 샘플에서 총 RNA를 추출했습니다. 무작위 프라이머를 사용한 역전사를 사용하여 상보적 DNA를 합성했습니다. SOD, CAT, GSHPx, MT, HSP70, CYPA, P53, GST 및 TF의 상대적 mRNA 수준은 실시간 정량적 PCR(qPCR) 키트(One Step SYBR® PrimeScript™ RT-PCR 키트, PR066A, 다카라, 다롄, 중국). 모든 프라이머(표 1)는 Shanghai Sangon Ltd.에서 합성 및 구입했습니다.
체외 배아 독성 시험
자궁 경부 탈구 후 암컷 마우스에서 8.5일 배아의 배아를 분리한 다음, 3mL의 쥐로부터 즉시 원심분리된 혈청(ICS)을 포함하는 50.0mL Hank 용액, micro-TiO2에서 배양했습니다. , 또는 나노-TiO2 (0.0, 50.0, 100.0, 200.0μg/mL) 각 병에 3개의 배아가 48시간 동안 있습니다.
micro-TiO2의 효과를 확인하려면 또는 나노-TiO2 배아에 대한 노출 시간, 배아는 3mL 쥐의 ICS, micro-TiO2를 포함하는 50.0mL Hank 용액에서 배양되었습니다. , 또는 나노-TiO2 (200.0μg/mL) 각 병에 3개의 배아를 16, 26, 48시간 동안 넣은 다음 미리 데운 37°C Hank's 용액으로 48시간 동안 세척하고 3mL ICS가 포함된 50.0mL Hank's 용액에서 배양했습니다. 쥐.
Maele-Fabry Van 점수[22]를 사용하여 배아 발달을 평가했습니다. 난황낭 직경, 배아 정수리-엉덩이 길이, 머리 길이 및 신체 단면 수를 해부 현미경으로 검사했습니다. 발달중인 배아의 기형률은 전뇌, 중뇌, 후뇌, 앞다리 싹, 뒷다리 싹, 청각 및 시각 시스템 및 심장의 형태학적 변화의 점수를 기반으로 평가되었습니다. 배아 10.5일째에 2마리의 ICR 마우스로부터 10개 이상의 배아가 대조군을 위해 분리되었습니다.
통계 분석
데이터는 SPSS 13(IBM, Illinois, USA)을 사용하여 분석되었습니다. 처리군과 대조군의 차이는 Dunnett의 t 테스트. 그룹 간의 차이는 ANOVA를 사용하여 분석되었습니다. 여러 샘플 중 두 개 간의 비교는 LSD 및 SNK 테스트를 사용하여 분석되었습니다. 범주형 데이터는 카이제곱 검정과 순위합 검정을 사용하여 분석되었습니다. 만약 P <0.05, 차이가 유의미한 것으로 간주되었습니다.
<섹션 데이터-제목="결과">
결과
나노스케일 이산화티타늄 노출 후 마우스의 티타늄 조직 분포
나노-TiO2로 마우스를 처리했습니다. (i.p., 5, 10, 50, 100, 150, 200mg/kg) 14일 동안 쥐의 기관에서 티타늄 함량을 측정했습니다. 결과는 나노-TiO2의 다른 복용량으로 처리된 쥐의 장기에 티타늄이 축적되었음을 보여주었습니다. (그림 1). 축적의 크기는 용량 의존적이었습니다(그림 1). 간은 티타늄이 가장 많이 농축된 기관이었고 그 다음으로 신장이었습니다. 티타늄의 축적 정도는 비장, 폐, 뇌, 심장에서 거의 같았다(Fig. 1). 결과는 nano-TiO2 GI 트랙을 통해 흡수되고 순환계를 통해 조직으로 분배될 수 있고 장기 간, 신장, 비장, 폐, 뇌 및 심장에 침착될 수 있습니다.
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nano-TiO2에 노출된 쥐의 장기에 티타늄이 축적되었습니다. . 마우스는 나노-TiO2로 처리되었습니다. 14일 동안 1일 1회 복강내 주사를 통해 지시된 대로 현탁액 또는 식염수 용액. * 대조군과 비교하여 P <0.05, # 대조군과 비교, P <0.01
마우스에서 나노스케일 이산화티타늄의 일반적인 독성
우리는 nano-TiO2의 다른 복용량으로 마우스를 치료했습니다. 14일 동안 다른 용량으로 처리한 마우스 그룹 간에 체중 증가에 차이가 없음을 발견했습니다(데이터는 표시되지 않음). 나노-TiO2의 낮은 복용량 (5 및 10 mg/kg)은 i.p. 14일 동안 노출됩니다(그림 2). 그러나 nano-TiO2의 고용량 (50, 100, 150, 200mg/kg)은 용량 의존적으로 마우스에서 간, 신장, 비장, 심장의 장기/체중 비율을 유의하게 증가시켰고 폐와 뇌의 비율을 감소시켰습니다(그림 2 ).
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nano-TiO2에 노출된 마우스의 장기/체중 비율 . 마우스는 나노-TiO2로 처리되었습니다. 14일 동안 1일 1회 복강내 주사를 통해 지시된 대로 현탁액 또는 식염수 용액. * 대조군과 비교하여 P <0.05; # 대조군과 비교하여 P <0.01
더 낮은 용량(5, 10, 50, 100mg/kg)의 nano-TiO2 혈액 생화학 지수를 변경하지 않았습니다(그림 3). 고용량의 nano-TiO2 (150~200mg/kg) 간 기능 바이오마커 상승된 알칼리성 포스파타제(ALP) 및 알라닌 아미노전이효소(ALT), 알부민(ALB), 류신 아미노펩티다제(LAP), 부티릴콜린에스테라제(PChe), 총 빌리루빈(TBIL) 및 총 단백질( TP) 수준(그림 3). 고용량은 신장 기능의 바이오마커인 혈청 요산(UA)과 혈액 요소 질소(BUN) 수치를 감소시켰습니다. 그들은 심근 손상의 지표인 혈청 아스파테이트 아미노트랜스퍼라제(AST), 크레아틴 키나제(CK), 젖산 탈수소효소(LDH) 및 알파 하이드록시부티레이트 탈수소효소(HBDH) 수준을 증가시켰습니다(그림 3).
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nano-TiO2에 노출된 쥐의 혈액 생화학 지수 . 마우스는 나노-TiO2로 처리되었습니다. 14일 동안 1일 1회 복강내 주사를 통해 지시된 대로 현탁액 또는 식염수 용액. * 대조군과 비교하여 P <0.05; # 대조군과 비교하여 P <0.01. 아 간 기능 바이오마커에 대한 생화학 지수. ㄴ 신장 기능 바이오마커에 대한 생화학 지수. ㄷ 심근 손상 바이오마커에 대한 생화학 지수
이러한 결과는 고용량의 TiO2 용량 의존적 방식으로 간, 신장, 심장 및 기타 기관에 심각한 손상을 일으킬 수 있습니다.
Nano-TiO의 간 독성2 쥐에서
우리는 nano-TiO2의 간 독성을 추가로 평가했습니다. . 광학 현미경을 사용하여 우리는 저용량(14일 동안 i.p., 5mg/kg) nano-TiO2에 노출된 마우스의 간에서 유의한 변화가 없음을 발견했습니다. (그림 4a, b). 우리는 현저한 혈관 폐쇄 및 확장(그림 4c, 50mg/kg), 호염기구의 증가(그림 4d, 100mg/kg), 간의 부분 허혈(그림 4e, 150mg/kg) 및 폐색을 관찰했습니다. nano-TiO2에 노출된 쥐의 중심 정맥(그림 4f, 200mg/kg) (i.p.).
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nano-TiO2로 처리된 마우스의 간 조직학 nano-TiO2에 노출 . 마우스는 나노-TiO2로 처리되었습니다. 14일 동안 1일 1회 복강내 주사를 통해 지시된 대로 현탁액 또는 식염수 용액. 아 제어. ㄴ TiO2 , 5mg/kg. ㄷ TiO2 , 50mg/kg. d TiO2 , 100mg/kg. 이 TiO2 , 150mg/kg. 에 TiO2 , 200mg/kg
그러나 TEM을 사용하여 우리는 간세포에서 미토콘드리아의 약간의 부기와 간 조직에 응축된 염색질 및 세포 사멸 세포의 존재를 낮은 용량의 nano-TiO2에 노출된 마우스에서 발견했습니다. (60일 동안 위관 영양, 5mg/kg)(그림 5a, b). 우리는 nano-TiO2를 관찰했습니다. 10 mg/kg nano-TiO2로 처리된 마우스 간 세포의 간세포 미토콘드리아, 부종 미토콘드리아 및 미토콘드리아 액포 (60일 동안 위관 영양 공급, 그림 5c). 우리는 50mg/kg nano-TiO2로 처리된 마우스의 간 세포에서 핵소체 붕괴, 분산된 염색질, 명백한 세포자멸사 및/또는 세포사멸체를 추가로 관찰했습니다. (60일 동안 위관 영양 공급, 그림 5d). 결과는 nano-TiO2 세포하 및 세포 수준에서 간 세포의 병리학적 손상을 유발할 수 있습니다.
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nano-TiO2에 노출된 쥐의 간세포의 초미세 구조 . 마우스는 나노-TiO2로 처리되었습니다. 60일 동안 하루에 한 번 위관영양법을 통해 표시된 대로. 대조군의 마우스는 0.5% CMC(카르복시메틸 셀룰로오스)를 받았습니다. 아 제어(×8000). ㄴ TiO2 (5 mg/kg) (×8000). ㄷ TiO2 (10mg/kg) (×10,000). 화살표는 미토콘드리아와 미토콘드리아의 액포를 나타냅니다. d TiO2 (50mg/kg) (× 10,000)
5mg/kg nano-TiO2로 마우스 치료 60일 동안 O
2−
와 같은 ROS 수준을 변경하지 않았습니다. , H2 O2 , 산화질소(NO) 및 MDA(그림 6) 또는 간 조직에서 SOD, CAT, GSHPx, MT, GST, HSP70, P53 및 TF 유전자의 mRNA 수준(그림 7). 10 또는 50mg/kg nano-TiO2로 마우스 치료 60일 동안 O
2−
수준이 크게 증가했습니다. , H2 O2 , NO 및 MDA(그림 6), SOD, CAT, MT, GST, HSP70, P53, TF 및 GSHPx 유전자의 mRNA 수준 감소 및 마우스 간에서 CYP1A 유전자의 mRNA 수준 증가( 그림 7). 결과는 nano-TiO2 -노출된 쥐의 간에서 유발된 산화 스트레스 및 보호 유전자 발현의 변화.
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nano-TiO2에 노출된 쥐의 간에서 ROS 생성 속도 및 지질 과산화 수준 . 마우스는 나노-TiO2로 처리되었습니다. 60일 동안 하루에 한 번 위관영양법을 통해 표시된 대로. 대조군의 마우스는 0.5% CMC(카르복시메틸 셀룰로오스)를 받았습니다. * 대조군과 비교하여 P <0.05, 총 단백질로 정규화
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nano-TiO2에 노출된 쥐의 간에서 유전자의 상대적 발현 수준 . 마우스는 나노-TiO2로 처리되었습니다. 60일 동안 하루에 한 번 위관영양법을 통해 표시된 대로. 대조군의 마우스는 0.5% CMC(카르복시메틸 셀룰로오스)를 받았습니다. * 대조군과 비교하여 P <0.05; # 대조군과 비교하여 P <0.01, β-액틴으로 정규화
마우스에서 나노스케일 이산화티타늄의 뇌 독성
우리는 nano-TiO2의 뇌 독성을 추가로 평가했습니다. . 우리는 먼저 nano-TiO2에 노출된 쥐의 뇌/체중 비율을 조사했습니다. (i.p. 14일 동안). 저용량(5, 10, 50mg/kg)은 뇌/체중의 비율을 변화시키지 않았으며, 고용량(100, 150, 200mg/kg)은 용량 의존성에서 뇌/체중의 비율을 유의하게 감소시켰습니다. 방식(그림 2). 뇌 조직의 Ti 농도는 용량 의존적으로 유의하게 증가하였다(Fig. 1).
또한 nano-TiO2에 노출된 쥐의 뇌에서 조직학적 변화를 조사했습니다. (i.p. 14일 동안) 헤마톡실린 염색을 사용합니다. 우리는 nano-TiO2의 낮은 복용량을 관찰했습니다. (50 mg/kg)은 복강내 주사 후 마우스의 뇌 조직 조직을 변화시키지 않았습니다. 14일 동안 노출됩니다(그림 8a, b). 100mg/kg의 nano-TiO2로 마우스 치료 그 결과 뇌 조직의 신경 세포가 파열되고 금이 갔습니다(그림 8c). 150mg/kg의 nano-TiO2로 마우스 치료 그 결과 뇌 조직의 염증 세포가 침습되었습니다(그림 8d). 결과는 nano-TiO2 뇌 조직에 형태학적 손상을 일으켜 염증 반응을 일으킬 수 있습니다.
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nano-TiO2에 노출된 쥐의 뇌 조직의 병리학적 변화 . 마우스는 나노-TiO2로 처리되었습니다. 14일 동안 1일 1회 복강내 주사를 통해 지시된 대로 현탁액 또는 식염수 용액. 아 제어. ㄴ 50mg/kg ㄷ 150mg/kg d 200mg/kg
nano-TiO2의 효과를 확인했습니다. nano-TiO2에 노출된 쥐의 뇌 조직에서 산화 환원 상태 및 신호 분자 (i.p. 14일 동안). 저용량(5mg/kg) nano-TiO2 O
2−
를 변경하지 않았습니다. , H2 O2 및 MDA 수준은 항산화 효소 APX, CAT, GSHPx 및 SOD의 활성 또는 비효소 항산화제 ASA/DASA 및 GSH/GSSG의 수준을 변경하지 않았습니다. 또한 뇌 조직에서 산화질소 합성효소(NOS) 활성과 NO 수준을 변화시키지 않았습니다(그림 9 및 10). 더 많은 양의 nano-TiO2 O
2−
증가 , H2 O2 , MDA 수준은 항산화 효소 APX, CAT, GSHPx 및 SOD의 활성을 감소시켰고, 비효소적 항산화제 ASA/DASA 및 GSH/GSSG의 수준을 감소시켰고, NO 수준과 NOS의 활성을 증가시켰으며, 뇌 조직의 AchE 및 혈당(GLU) 수준(그림 9 및 10). 이러한 결과는 nano-TiO2 i.p. 후 마우스의 뇌에 손상을 줄 수 있습니다. 노출.
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nano-TiO2에 노출된 쥐의 뇌 ASA/DASA 및 GSH/GSSG 비율 . 마우스는 나노-TiO2로 처리되었습니다. 14일 동안 1일 1회 복강내 주사로 지시된 현탁액 또는 식염수
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nano-TiO2에 노출된 쥐의 뇌에서 ROS, 항산화 효소, NO 신호, 글루타메이트 및 AchE 활성의 변화 . 마우스는 나노-TiO2로 처리되었습니다. 14일 동안 1일 1회 복강내 주사를 통해 지시된 대로 현탁액 또는 식염수 용액. 아니 =10, * 대조군과 비교, P <0.05; # 대조군과 비교하여 P <0.01. 아 nano-TiO2에 노출된 쥐의 뇌에서 ROS(O2-, H2O2, MDA)의 변화. ㄴ nano-TiO2에 노출된 쥐의 뇌에서 항산화 효소(SOD, CAT, APX, GSHPx)의 변화. ㄷ nano-TiO2에 노출된 쥐의 뇌에서 NO 신호 구성 요소(cNOS, iNOS 및 NO)의 변화. d nano-TiO2에 노출된 쥐의 뇌에서 글루타메이트 함량 및 AchE 활성의 변화
나노-TiO의 독성 효과2 Ex Vivo 마우스 배아에서
nano-TiO2의 발달 독성 평가 , 우리는 먼저 생체 내 배아와 생체 외 배아의 성장과 발달을 비교했습니다. 결과는 생체 외 배아의 성장 및 발달이 생체 내 배아의 성장 및 발달과 유사함을 보여주었다(데이터는 표시되지 않음). 따라서 우리는 생체 외 배아를 사용하여 nano-TiO2의 독성 효과를 연구했습니다. 배아에.
micro-TiO2의 다양한 용량(최종 농도 0.0, 50.0, 100.0, 200.0μg/mL)과 노출 시간의 영향을 조사했습니다. /나노-TiO2 배아의 VXY 직경, 정수리-엉덩이 길이, 머리 길이 및 신체 단면의 수를 조사하여 배아의 성장 및 발달뿐만 아니라 조직 및 기관의 형태에 대해 조사합니다. 결과는 micro-TiO2 어떤 용량에서도 이러한 지표를 변경하지 않았습니다(표 2).
다양한 크기의 nano-TiO2용 , 50.0μg/mL TiO2로 5–10 nm, 60 nm, 90 nm 배아 처리 배아 VXY 직경, 크라운-엉덩이 길이, 머리 길이 및 신체 섹션 수에 영향을 미치지 않았습니다(표 2). 더 높은 용량(100.0 및 200.0μg/mL)은 VXY 직경, 정수리-엉덩이 길이, 머리 길이 및 신체 섹션 수를 감소시키고 기형 비율을 증가시켰습니다(표 2). 동일한 선량에 대해 서로 다른 크기의 nano-TiO2로 처리한 그룹 간에 명백한 차이가 없었습니다. , 50.0 또는 100μg/mL. 200μg/mL nano-TiO2로 배아 치료 nano-TiO2의 크기가 증가함에 따라 마우스 배아의 VXY 직경, 정수리-엉덩이 길이, 머리 길이 및 신체 섹션 수가 크게 감소했습니다.2 입자(표 2).
micro-TiO2로 생쥐 배아 치료 16시간, 24시간 및 48시간 동안 (200.0μg/mL) VXY 직경, 정수리-엉덩이 길이, 머리 길이 및 신체 단면 수에는 변화가 없었습니다(표 3). nano-TiO2로 생쥐 배아 치료 16시간 동안 (5–10 nm 및 60 nm, 90 nm, 200.0 μg/mL) 또한 VXY 직경, 크라운-엉덩이 길이, 머리 길이 및 신체 부분의 수를 변경하지 않았습니다(표 3). 그러나 nano-TiO2로 생쥐 배아를 처리 (5–10 nm 및 60 nm, 90 nm, 200.0 μg/mL) 24시간 및 48시간 동안 VXY 직경, 정수리-엉덩이 길이, 머리 길이, 신체 단면 수를 감소시키고 기형 비율을 증가시켰습니다(표 3). 동일한 노출 시간 동안 다양한 크기의 nano-TiO2 그룹 간에 VXY 직경, 정수리-엉덩이 길이, 머리 길이, 신체 단면 수 또는 기형 비율에 차이가 없었습니다. 입자(표 3).
In summary, these results indicate that nano-TiO2 had toxic effects on the growth and development of mouse embryos in dose-dependent and time-dependent manners. The sizes of the nano-TiO2 particles may affect toxicity with a trend of increasing toxicity associated with larger nano-TiO2 particles.
Discussion
Nano-TiO2 has been widely used in industry and medicine. However, the safety of nano-TiO2 exposure remains unclear. In the present study, we investigated the potential toxicity of nano-TiO2 , using mice models. We find that nano-TiO2 accumulates in the heart, liver, kidney, spleen, lung, and brain of mice after exposure (i.p. injection) in a dose-dependent manner. High doses of nano-TiO2 significantly increase the organ/body weight ratios of the liver, kidney, spleen, and heart, and decrease those of the lung and brain in a dose-dependent manner. Moreover, high doses of nano-TiO2 significantly increase the levels of ALT, ALP, LAP, PChE, TP, ALB, and TBIL, which are indices for liver function. They decrease the levels of UA and BUN, which are renal function indicators. Further, high doses significantly increase the activities of CK, LDH, AST, and HBDH, and significantly increase the levels of GLU, trigylceride, total cholesterol, and high-density lipoprotein. Low doses of nano-TiO2 do not change these biochemical parameters. Our data support that nano-TiO2 may be toxic and may affect the liver, kidney, heart, GLU, and lipid metabolism at high doses in a dose-dependent manner.
In the present study, we investigated the mechanism of liver toxicity of nano-TiO2 . We find that high doses of nano-TiO2 may cause swelling of hepatocytes with obvious vacuoles in cells, and nuclear condensation in hepatocytes, and apoptosis and necrosis of hepatocytes in liver tissues. This is consistent with previous studies [7, 23, 24]. After the treatment of mice with high doses of nano-TiO2 , we find that the levels of CAT, GSHPx, and SOD are significantly decreased, and there is nano-TiO2 in the mitochondria of hepatocytes, revealed by TEM. This is consistent with previous studies [7, 25,26,27,28] suggesting that nano-TiO2 generates excess ROS and reduces the antioxidant capacity of the cells through damaging the mitochondria. This is further supported by observation that nano-TiO2 can significantly decrease the mRNA levels of SOD, CAT, GSHPx, MT and HSP70, CYP1A1, p53, GST, and TF genes in the mouse liver. SOD, CAT, GSH PX, and MT are involved in liver cell detoxification, CYP1A1 is involved in toxic-substance metabolism and defense against invasion from harmful substances, and HSP70 and p53 are involved in repairing liver cell DNA damage [10, 29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39]. These findings support that the mechanisms for nano-TiO2 liver toxicity are damaging mitochondria, generating ROS, and causing expression disorders of protective genes.
In the present study, we investigated the mechanism of brain neurotoxicity of nano-TiO2 . We find that high doses of nano-TiO2 can produce lipid peroxidation and decrease antioxidant capacity, including SOD, CAT, APX, and GSHPx activities, resulting in oxidative stress, which may damage unsaturated fatty acids and brain tissue [24, 26, 37, 40]. We observed rupture and cracking in nerve cells and the infiltration of inflammatory cells in the brain. We further found that the activities of cNOS and iNOS are increased, and NO is excessively released. Glutamic acid levels and AChe activity are decreased in the brain. This is consistent with the effect of Fe2 O3 nanoparticles on olfactory bulb cells [40] and the effect of nano-TiO2 on mouse hippocampal neurons [31, 41]. Glutamate is the most abundant amino acid in excitatory neurotransmitters of the nervous system. It is critical for the brain’s development and function [42]. Acetylcholinesterase is a key enzyme for levels of acetylcholine, which is critical for the function of the peripheral and central nervous systems. Nitric oxide regulates many central nervous functions, such as synaptic plasticity, the sleep–wake cycle, and hormone secretion [43]. Therefore, nano-TiO2 may cause oxidative stress and may disrupt orders of neurochemical metabolism in brain tissue and therefore have neurotoxicity in the central nervous system.
We find that the micro-TiO2 and low doses of nano-TiO2 (5–10 nm and 60 nm and 90 nm) do not exhibit toxicity on ex vivo mouse embryos, while high doses of nano-TiO2 (100–200.0 μg/ml) exhibit toxicity on ex vivo mouse embryos, as revealed by evaluation of morphology of exposed embryos. Whole embryo culture is a useful tool to assess the developmental toxicity of chemicals [44, 45]. Previous studies show that exposure of 14-day pregnant mice to a single dose of nano-TiO2 in the nasal cavity increase the sensitivity of inflammatory response in F1 generation [46, 47]. Nano-TiO2 does not affect white pregnant Kunming mice but inhibits growth, increases the rate of stillbirth, and exhibits developmental toxicity [48]. These studies indicate the presence of the developmental and genetic toxicity of nano-TiO2 . This is further supported by studies that show cleavage and oxidative damage of DNA by nano-TiO2 , for example, in Zebra fish [16, 49, 50]. Additionally, another shows an increase in the sister chromatid exchange rates in Chinese hamster ovary cells [51]. Nano-TiO2 may also prevent chromosome formation during metaphase in the ovary when TiO2 concentration is high [51]. These studies consistently show that exposure to high doses of nano-TiO2 is linked with developmental and genetic toxicity. Furthermore, our data indicated that the size of nano-TiO2 particles may affect its toxicity, with the trend of increasing toxicity being associated with larger nano-TiO2 particles (Table 2).
In the current study, we found that titanium accumulates in a dose-dependent manner in the heart, liver, kidney, spleen, lung, and brain of mice after i.p. injection of nano-TiO2 . This is consistent with published reports that absorption and distribution of nano-TiO2 is dependent on blood circulation. Nanoparticles can be absorbed in mesenchymal cells through being ingested by airway epithelial cells; they can then penetrate into the blood or lymph, thus gradually being distributed to the whole body [52, 53]. It is worth noting that nano-TiO2 in the abdomen cavity can be absorbed and transported to the brain by the circulatory system, and nano-TiO2 can enter directly into the central nervous system without crossing the blood–brain barrier. This is consistent with previous studies [41, 54]. Nanoparticles can also be absorbed by the terminal nerve cell in the respiratory tract and then be transferred to the ganglion through the axon, eventually entering central nervous cells [8, 55]. Nano-TiO2 can be absorbed in the nasal cavity through the olfactory epithelium, and then be transported to other parts of the brain, such as the hippocampus, through the olfactory nerve [41, 54]. Therefore, the brain may be directly exposed to nano-TiO2 . Damage in the brain may be caused directly or indirectly by nano-TiO2 .
Conclusions
Ingested nano-TiO2 can be distributed to and accumulated in the heart, brain, spleen, lung, and kidney. It exhibits toxicity and causes disorders of the GLU and lipid metabolism. Nano-TiO2 causes liver and brain toxicity mainly through increasing oxidative stress, decreasing antioxidant levels, and changing the expression of the protective genes in the liver. In addition, nano-TiO2 has adverse effects on the growth and development of mouse embryos and the morphology of the tissues and organs. The size of nano-TiO2 particles may affect their toxicity, with a trend of increasing toxicity being associated with larger nano-TiO2 particles. These toxic effects are dose-dependent. Our study may provide data for the assessment of the risk of nano-TiO2 exposure on human health.
