부팔린은 강심장, 항바이러스, 면역 조절, 특히 항종양 효과를 포함한 강력한 약리학적 효과를 나타내는 것으로 보고되었습니다. 이 연구의 목적은 FDA 승인 제약 부형제에 의해 제조된 부팔린 물질과 비교하여 부팔린이 로딩된 PEG화 리포좀의 특성화, 항종양 효능 및 약동학을 결정하는 것이었습니다. Bufalin-loaded PEGylated 리포솜과 bufalin-loaded 리포솜은 박막 증발법과 고압 균질화 방법의 조합에 의해 균일한 입자 크기로 재현 가능하게 제조되었습니다. 평균 입자 크기는 127.6 및 155.0nm였으며 평균 제타 전위는 2.24 및 - 18.5mV였으며 포획 효율은 각각 76.31 및 78.40%였습니다. 시험관 내 방출 프로파일은 bufalin-loaded PEGylated liposomes에서 bufalin의 방출이 bufalin-loaded liposomes에서보다 느린 것으로 나타났습니다. 블랭크 리포솜의 세포독성은 허용 가능한 범위 내에서 발견된 반면, 부팔린-로딩된 PEG화 리포솜은 부팔린 엔티티와 비교하여 U251 세포에 대해 향상된 세포독성을 보여주었습니다. 생체 내 약동학은 부팔린이 로드된 페길화된 리포솜이 쥐의 혈장에서 부팔린의 반감기를 연장하거나 제거할 수 있음을 나타냅니다. 결과는 bufalin-loaded PEGylated 리포솜이 용해도를 개선하고 혈장 내 약물 농도를 증가시켰음을 시사했습니다.
<섹션 데이터-제목="배경">
배경
매년 증가하는 암 환자의 인구가 2020년까지 절반으로 증가할 수 있다는 점에서 암 질환은 전 세계적으로 매우 중요합니다[1]. 신경교종 종양은 혈액뇌장벽(BBB)의 존재와 다제내성으로 임상적으로 효과적인 치료제가 없는 가장 생명을 위협하는 질환 중 하나이다[2]. Bufalin은 Venenum Bufonis에서 분리 및 확인되었습니다. , 두꺼비의 피부와 귀밑샘의 분비물인 Bufo bufo주둔군 칸토어 또는 Bufo melanostictus 슈나이더 [3]. 강심제, 항바이러스제, 면역 조절, 특히 항종양 효과를 포함한 강력한 약리학적 효과가 있는 것으로 보고되었습니다[4,5,6,7]. 그러나 용해도가 낮아 수용액에 분산되기 어려워 적용이 제한된다[8].
리포좀은 함수액에 대한 불량한 약물 용해도를 개선하고 생체 이용률을 향상시키며 치료 효율을 높이고 부작용을 감소시키는 새로운 약물 전달 시스템으로 간주되어 왔다[9]. 주로 부하된 에이전트가 BBB를 통과하여 뇌로 전달하는 데 도움이 될 수 있습니다[10]. 그러나, 리포솜 제형의 주요 단점 중 하나는 혈장 단백질이 리포솜의 인지질 막으로 흡수되어 이후에 단핵 식세포 시스템에 의해 리포솜에 대한 인식 및 흡수를 유발하기 때문에 혈액에서 빠르게 제거된다는 것입니다. 다행스럽게도 폴리에틸렌 글리콜(PEG)이 리포솜 표면에 변형되면 이러한 식균 작용이 느려질 수 있습니다. 따라서, bufalin-loaded PEGylated liposomes를 장기간 순환하는 liposomes로 연구하여 수용성을 높이고 약동학을 개선할 필요가 있다[11].
현재까지 부팔린의 약동학에 대한 연구는 아직 많은 관심을 받지 못하고 있다. 일부 보고서는 OS 투여당 수용액에서 유리 부팔린의 약동학에만 초점을 맞추고 있습니다. 본 연구에서 우리는 bufalin의 전달 시스템으로 PEGylated 리포좀을 개발하고 bufalin-loaded PEGylated 리포좀, bufalin-loaded 리포좀 및 bufalin 개체 간의 약동학적 차이를 쥐에 정맥 투여하여 수용액에서 비교했습니다.
방법
화학물질 및 시약
부팔린(순도 ≥ 98%)은 BaoJi Chenguang Technology Development Co., Ltd.(Baoji, Shaanxi, China)에서 구입했습니다. L-α-포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000](암모늄 염; DSPE-PEG2000 )은 Sigma Chemical Co., Ltd.(St. Louis, MO, USA)에서 구입했습니다(이 물질의 분자식은 추가 파일 1:그림 S1에 표시됨). 사용된 아세토니트릴은 분광 등급이었고 Honeywell(America)에서 구입했습니다. 클로로포름 및 알코올(분석 등급)은 Tianjin Kemiou Chemical Reagent Co., Ltd.(중국)에서 구입했습니다. 모든 화학 물질은 분석 또는 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 등급이었습니다. 그리고 Millipore 정수 시스템(Milford, MA, USA)을 사용하여 물을 탈이온화하고 0.22μm 멤브레인으로 여과했습니다.
동물과 세포
이 연구는 국립 보건원의 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 지침의 권장 사항에 따라 엄격하게 수행되었습니다. 프로토콜은 제4군사대학(중국 산시성)의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았습니다(승인 2015-1013-R). 모든 수술은 나트륨 펜토바르비탈 마취하에 시행되었으며 고통을 최소화하기 위해 모든 노력을 기울였습니다. 처음에 무게가 250 ± 20g인 수컷 Sprague-Dawley 쥐를 제4군사 의과대학(중국 시안)에서 입수했습니다. SW620, PC-3, MDA-MB-231, A549, U251, U87 및 HepG2 세포주는 각각 Shanghai Cell Bank 또는 4군사대학의 실험동물센터에서 구입하여 10%( v /v ) 소 태아 혈청(FBS) 및 1% 항생제(100U/mL 페니실린 G 및 0.1mg/mL 스트렙토마이신). 세포는 5% CO2 대기에서 지수 성장 단계로 유지되었습니다. 37°C에서 상대 습도 90%
부팔린 로딩 리포솜 합성
고압 균질화를 사용하여 리포솜을 10mL의 배치 크기로 제조했습니다. 사용된 부팔린의 양은 모든 리포솜에서 동일했습니다. 간단히 말해서, bufalin-loaded common liposomes는 10:30:60의 몰비로 bufalin, 콜레스테롤 및 L-α-포스파티딜콜린의 조성으로 제조되었습니다. bufalin-loaded PEGylated liposomes는 bufalin, 콜레스테롤, L-α-phosphatidylcholine 및 DSPE-PEG2000의 조성으로 합성되었습니다. 각각 10:30:55:5의 몰비로.
상기 인지질 혼합물을 3mL 클로로포름에 완전히 분산시킨 후, 감압 조건에서 50°C에서 회전 증발기로 클로로포름을 완전히 휘발시켰다. 이어서, 잔류 용매(존재하는 경우)를 진공 데시케이터에 밤새 두어 건조시킨 다음, 제조된 건조 박막을 10mmol/mL 인지질로 10mL 50°C 예열된 탈이온수에서 vortex를 사용하여 15분 동안 재수화시켰다. 이렇게 형성된 혼합물을 고압 균질화로 추가 처리하였다. 균질화의 압력과 시간은 35°C에서 500bar로 최적화되었으며 프로세스는 10번 재활용되었습니다. 생성된 리포좀 현탁액을 폴리카보네이트 멤브레인(0.2-μm 기공 크기, Whatman, Maidstone, UK)을 사용하여 Lipex 압출기(ATS, Canada)로 두 번 즉시 압출하여 단일층 리포좀을 형성하였다. 블랭크 리포솜 현탁액도 부팔린 첨가 단계를 생략하여 앞서 설명한 것과 동일한 방법으로 제조되었습니다.
부팔린 로딩 리포솜의 특성화
입자 크기 및 제타 전위
입자 크기 및 제타 리포솜의 잠재력은 제타 전위 분석기(Delsa™ Nano, Beckman Coulter, California, USA). 크기 분포 및 제타를 결정하기 전에 모든 부팔린 리포솜을 인산완충식염수(PBS)로 적절한 농도로 희석했습니다. 잠재적 인. 측정은 전자동 모드에서 수행되었습니다.
고분해능 투과 전자 현미경
부팔린 리포솜은 고해상도 투과 전자 현미경(HR-TEM) 연구를 통해 추가로 특성화되었습니다. 300메시 구리 그리드에 지지된 부팔린 리포솜 현탁액은 1%(w /v ) 인텅스텐산. 형태의 직접 이미징은 TEM(Hitachi H-7650, Tokyo, Japan)을 사용하여 200kV 가속 전압에서 실행되었습니다.
포획 효율성
부팔린 함량은 HPLC 방법으로 분석하였다. Shimadzu HPLC 시스템(Kyoto, Japan)에는 LC-20AT 펌프, SPO-M20A 다이오드 어레이 검출기, CTO-10AS VP 컬럼 오븐 및 SIL-10AF 자동 시료 주입기가 장착되어 있습니다. 모든 분리는 SinoChrom ODS-BP C18 컬럼(250mm x 4.6mm, 5μm, Yillite)(Yillite, Dalian, China)에서 수행되었습니다. 주입 부피는 20μL이고 컬럼 유출물은 296nm에서 모니터링되었습니다. ClassVP 소프트웨어를 사용하여 데이터를 수집하고 처리했습니다. 이동상은 아세토니트릴:구배 용리(50:50, v)와 함께 아세토니트릴:0.1% 인산이수소칼륨(pH 값을 3.8로 조정하기 위한 인산 사용)의 혼합물로 구성되었습니다. /v ). 크로마토그래피는 1.0mL/min의 유속으로 수행되었습니다. 포착 효율을 결정하기 위해 1.0mL 부팔린 리포솜 현탁액을 Sephadex G50 컬럼에 첨가하고 PBS로 용리했습니다. 유출물의 푸르스름한 부분을 수집하고 PBS를 첨가하여 최대 10.0mL(최종 부피)로 만들었습니다. 금액(W1 리포솜 현탁액에서 부팔린의 )은 HPLC 방법에 의해 결정되었다. PBS를 1.0mL의 부팔린 리포솜 현탁액의 다른 부분에 첨가하여 최종 부피가 최대 10.0mL가 되도록 하고 양(W2 )에 포함된 부팔린의 양은 같은 방법으로 측정하였다. 부팔린 리포솜에 포획된 부팔린의 백분율은 다음 공식으로 계산되었습니다.
Sephadex 크로마토그래피 방법으로 테스트한 포획 효율 및 zeta에 의해 결정된 입자 크기 0, 7, 15, 30, 90일에 4°C에서 보관한 후 안정성 프로필을 평가하기 위해 전위 분석기를 적용했습니다. 5개 시점에서 리포솜 누출 비율을 결정하기 위해 200μL의 리포솜 현탁액을 흡인했습니다. 즉시 Sephadex G50 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 200μL의 리포솜 현탁액의 유리 부팔린을 분리하고 HPLC 방법으로 유리 부팔린의 양을 측정하였다. 리포솜 누출 비율은 다음 공식으로 계산되었습니다.
리포솜에서 부팔린의 시험관 내 방출 거동은 일부 수정과 함께 이전에 설명한 대로 37°C에서 투석 백 기술을 사용하여 수행되었습니다. 10% 우태 혈청을 함유하는 PBS(pH =7.4)를 방출 배지로 사용했습니다. 4°C에서 PBS 완충액에 대해 4시간 동안 철저한 투석을 통해 유리 약물을 부팔린 리포솜에서 제거했습니다. 간단히 말해서, 1.0mL의 부팔린 리포솜 현탁액을 실온에서 부드러운 수평 진탕(120rpm/분)으로 투석 튜브(Spectrumlabs, USA; MWCO 30kDa)에 피펫으로 넣었습니다. 투석 튜브를 10% 우태 혈청을 함유하는 50mL PBS(pH =7.4)에 보관하고 온도를 37°C로 유지했습니다. 투석액을 배지에서 빼내고 다른 시간 동안 동일한 부피의 새로운 PBS로 교체했습니다. 시간 0, 0.5, 1, 2, 4, 6, 12, 24 및 48. 방출된 부팔린의 농도는 앞서 설명한 대로 HPLC에 의해 측정되었습니다.
세포독성
시험관 내 세포 독성 연구는 SW620, PC-3, MDA-MB-를 포함한 여러 종류의 종양 세포주에 대해 MTT(3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드) 분석을 사용하여 수행되었습니다. 231, A549, U251, U87 및 HepG2. 또한 U87 및 U251 세포를 선택하여 신경교종 종양 세포에 대한 부팔린-로딩된 리포솜 및 부팔린-로딩된 PEG화 리포좀의 세포독성 효과를 측정했습니다. U87 및 U251 세포를 각각 1.0 × 10
5
에서 96웰 미세역가 플레이트에 시딩했습니다. 세포/웰 및 부착 가능(37 °C, 5% CO2 ) 24시간 동안 배지를 흡인하고 0.1mL 새 배지로 교체했습니다. 버팔린 엔티티, 블랭크 리포솜, 블랭크 PEG화 리포솜, 부팔린-로딩된 리포솜 및 부팔린-로딩된 PEG화 리포솜을 완전한 배지로 희석하고 원하는 최종 농도를 달성하기 위해 0.1mL의 총 부피로 세포에 첨가했습니다. 대조군의 경우 테스트 용액을 추가하지 않았습니다. 블랭크 리포솜 및 블랭크 PEG화 리포솜을 평가하여 부팔린 리포솜 제조에 사용된 부형제의 독성을 시험하였다. 24시간 후, 37°C에서 4시간 동안 5mg/mL MTT를 포함하는 성장 배지에서 배양하여 세포 생존율을 평가했습니다. 배양 배지를 흡인한 후, 형성된 포르마잔 결정을 200μL의 유기 용매로 용해시켰다. 흡광도는 570nm의 파장에서 마이크로플레이트 리더로 측정되었습니다.
HPLC 방법을 사용한 부팔린 리포솜의 생체내 약동학 연구
약동학 연구는 일반 리포솜 또는 장기 순환 리포솜에서 부팔린의 흡수, 분포, 대사 및 배설을 평가하고 부팔린의 생체 이용률의 차이를 HPLC 기술을 사용하여 알아보기 위해 수행되었습니다.
이 실험에서 체중 250 ± 20g인 젊고 건강한 성인 수컷 Sprague-Dawley 쥐를 제4군사 의과대학(중국 시안)에서 구입했습니다. 쥐는 규칙적인 12시간 명암 주기 동안 실온(24 ± 2 °C) 및 40-60% 상대 습도에서 환기가 잘 되는 우리에 수용되었습니다. 동물은 실험 전에 최소 3일 동안 순응했습니다. 동물 절차는 제4군 의과대학 동물윤리위원회 지침에 따라 수행되었습니다.
부팔린 로딩 리포좀, 부팔린 로딩 페길화 리포좀 및 에탄올에 의한 수성 현탁액 보조 가용화 중 부팔린을 이전에 설명한 대로 제조한 다음 각각 0.5mg/kg의 등가 용량으로 정맥내 투여했습니다. 가벼운 에테르 마취 하에 쥐의 안와와에서 혈액 샘플을 항응고제로 헤파린을 함유한 미세 분리 튜브로 수집했습니다. 투여한 다음 4°C에서 15분 동안 3500r/min으로 원심분리합니다. 분리된 혈장은 분석 전에 -20°C에서 냉동 보관되었습니다.
샘플 전처리
쥐의 혈액에서 부팔린과 내부표준물질을 추출하기 위해 간단한 액-액 추출법을 따랐다. 200μL에 10.0μg 상당의 내부표준용액(100μg/mL cinobufagin working stock 20μL)을 넣고 사이클로믹서에서 10초간 혼합한 후 에틸아세테이트:석유에테르 1:3.0mL로 추출한다. 1(v /v ) 및 혼합물. 혼합물을 5분 동안 볼텍싱한 다음, Sigma 3-16k(Frankfurt, Germany)에서 4000r/min으로 15분 동안 원심분리했습니다. 유기층 3.0mL의 분취량을 분리하고 질소 하에 증발 건조시킨 다음, 잔류물을 200μL 아세토니트릴에 재용해했습니다. 12,000r/min에서 15분간 원심분리한 후 분석을 위해 20마이크로리터의 상청액을 분석 컬럼에 주입했습니다.
약동학 분석
관찰된 최대 혈중 농도(C최대 ) 및 반감기(T1/2 )는 실험 데이터를 육안으로 검사하여 얻었다. 데이터는 약물 임상 평가를 위한 중국 약리 학회 수학적 약리학 전문 위원회에서 편집한 약물 및 통계(DAS 2.1.1)를 사용한 비구획 약동학 분석에 적용되었습니다. 데이터는 2구획 개방형 모델에 따라 분석되었습니다.
통계 분석
모든 결과는 평균 ± SD(n =3), GraphPad Prism 5 소프트웨어를 사용하여 일원 분산 분석(ANOVA)으로 제형 간의 차이를 비교했습니다. 피 <0.05는 모든 경우에 유의성을 나타냅니다.
<섹션 데이터-제목="결과">
결과
이화학적 특성
고압 균질화 기술과 결합된 필름 재수화는 bufalin-loaded 리포솜 및 bufalin-loaded PEGylated 리포솜의 제조에 사용되었습니다. 필름 재수화는 친유성 약물을 포획하기 위해 성숙하고 제어된 공정으로 리포솜을 합성하는 기존 방법 중 하나입니다. 또한 균일하고 안정적인 리포솜 현탁액을 달성하기 위해 균질화 주기가 핵심 역할을 합니다.
bufalin-loaded 리포솜과 bufalin-loaded PEGylated 리포솜의 형태는 그림 1과 같이 TEM으로 관찰한 것처럼 거의 구형 또는 타원형입니다. TEM 이미지에 따르면 bufalin-loaded 리포솜과 bufalin-loaded PEGylated의 평균 입자 크기는 리포솜은 둘 다 200nm 미만이었습니다. bufalin-loaded 리포솜과 bufalin-loaded PEGylated 리포솜의 평균 입자 크기는 zeta로 측정한 각각 127.6 ± 3.64nm 및 155.0 ± 8.46nm였습니다(그림 1c). 전위 분석기(Delsa™ Nano, Beckman Coulter, California, USA). 부팔린-로딩된 리포솜과 비교할 때, 부팔린-로딩된 PEG화 리포좀은 음의 표면 전하를 나타내어 우수한 안정성을 시사합니다(부팔린-로딩된 리포좀 2.24mV, 부팔린-로딩된 PEG화 리포좀 -18.05mV, 추가 파일 2:표 S1). 또한, zeta의 분포는 잠재력은 그림 1b에서 볼 수 있습니다. 그러나 HPLC에 의해 측정된 부팔린 로딩 리포솜 및 부팔린 로딩 PEG화 리포솜에서 부팔린의 포획 효율은 각각 76.31 ± 3.40% 및 78.40 ± 1.62%입니다.
<그림>
bufalin-loaded 리포솜과 bufalin-loaded PEGylated 리포솜의 물리화학적 특성. 아 거의 구형 또는 타원형 모양의 bufalin-loaded 리포솜 및 bufalin-loaded PEGylated 리포솜의 TEM 이미지. ㄴ 동적 광산란에 의해 측정된 부팔린 로딩 리포솜 및 부팔린 로딩 PEG화 리포솜의 전형적인 입자 크기 및 분포. ㄷ 일반적인 표면 제타 bufalin-loaded 리포솜 및 bufalin-loaded PEGylated 리포솜의 잠재력
체외 안정성 시험
bufalin-loaded 리포솜 및 bufalin-loaded PEGylated 리포솜의 안정성 프로필은 표 1에 나와 있습니다. 또한 리포솜 누출 비율도 계산되었습니다. 부팔린이 장착된 리포좀의 경우 결과는 0, 7, 15, 30, 90일에 4°C에서 각각 0.0, 16.7, 25.2, 27.9, 30.6%였습니다. 부팔린이 장착된 PEG화 리포좀의 경우 결과는 각각 0이었습니다. , 5.0, 8.8, 14.5, 18.0%(4°C에서 0, 7, 15, 30, 90일째)
체외 출시 프로필
부팔린 로딩 리포좀 또는 부팔린 로딩 페길화 리포좀으로부터의 부팔린 방출 프로파일은 그림 2에 요약되어 있습니다. 실험 데이터에서 동일한 용해 배지에서 부팔린은 부팔린에 이어 제한 없이 신속하게 10% 송아지 태아 혈청을 포함하는 PBS로 확산될 수 있습니다. -로딩된 리포솜 및 마지막으로 부팔린이 로드된 PEG화된 리포솜.
<그림>
용해 매질 인산염 완충액, pH 7.4에서 부팔린 로딩된 일반 리포솜 및 부팔린 로딩된 PEG화 리포솜에서 부팔린의 시험관 내 방출. 데이터는 평균 ± SD, n입니다. =3
세포독성
bufalin 개체에 의해 영향을 받는 여러 종류의 종양 세포주의 세포 생존율은 MTT 분석으로 테스트할 때 그림 3a에 표시되며 최대 억제 농도의 절반(IC50 )는 추가 파일 2:표 S2에서도 계산됩니다. Bufalin은 용량 의존적 방식으로 여러 종양 세포의 성장 억제를 유발한 반면 IC50의 결과는 부팔린은 U251과 U87 신경교종 암 세포에 각각 다른 테스트된 암세포보다 더 민감하다는 것을 밝혔습니다. bufalin 개체, bufalin-loaded 리포솜 및 bufalin-loaded PEGylated 리포솜과 함께 적용될 때 MTT 분석에 의해 수행된 U251의 세포 생존율은 그림 3b에 나와 있습니다. 12시간 동안 배양했을 때 bufalin 개체, bufalin-loaded 리포솜 및 bufalin-loaded PEGylated 리포솜의 세포 생존율은 다르게 나타났지만 빈 리포솜과 빈 PEGylated 리포솜의 세포 생존율은 변하지 않았습니다. 기술한 바와 같이, 동일한 농도 수준에서 bufalin-loaded PEGylated liposome 그룹에서 U251의 세포 생존율은 bufalin-loaded liposome 그룹의 세포 생존율보다 항상 낮았습니다. 한편, 버팔린 개체가 세포 생존에 미치는 영향은 최소였습니다.
<사진>
종양 세포에 대한 블랭크 리포솜, 블랭크 PEG화 리포솜, 부팔린 엔티티, 부팔린 로딩 리포솜 및 부팔린 로딩 페길화 리포솜의 시험관내 세포독성. 아 다양한 농도의 부팔린 물질에서 여러 종류의 종양 세포주의 세포 생존율. ㄴ 다양한 농도의 블랭크 리포솜, 블랭크 PEG화 리포솜, 부팔린 엔티티, 부팔린 로딩 리포솜 및 부팔린 로딩 페길화 리포솜에서 U251 세포의 세포 생존율
생체내 약동학 연구
방법 검증
교정 곡선은 내부 표준 피크 면적 비율(y ) 대 농도(x , μg/mL) 7가지 다른 농도에서 표준 용액의 부팔린. 회귀 방정식은 y였습니다. =0.4238 x + 0.2429(선형 범위 0.05–10.0μg/mL) 및 상관 계수(R)
2
)는 0.9965였다. 검출 한계(LOD) 값은 0.01μg/mL였으며, 이는 신호 대 잡음비가 3(S/N)인 주입된 샘플의 양으로 계산되었습니다. =3).
특이성, 정확성 및 복구
내인성 물질에 의한 간섭 정도는 처리된 블랭크 혈장 샘플에서 파생된 크로마토그램을 검사하여 평가했습니다. 추가 파일 3:그림 S2는 블랭크 혈장, 부팔린이 첨가된 블랭크 혈장, 부팔린 및 레시부포게닌이 첨가된 블랭크 혈장(내부 표준), 부팔린 물질의 정맥내 투여 후 30분에 레시부포게닌이 첨가된 혈장 샘플, 부팔린 로딩 리포솜의 정맥내 투여 30분 후 레시부포게닌, 부팔린 로딩 PEG화 리포솜의 정맥내 투여 후 30분에 레시부포게닌으로 스파이크된 혈장 샘플. 부팔린과 레시부포게닌은 각각 약 7.191분과 10.131분에서 용출되었습니다. bufalin 또는 내부 표준의 머무름 시간에서 간섭 및 리포솜 막 물질의 피크는 발견되지 않았습니다. 정밀도 및 복구 테스트 결과는 표 2에 나와 있습니다.
약동학
부팔린이 장착된 리포좀, 부팔린이 장착된 PEG화 리포좀의 혈중 농도-시간 프로필 및 수성 현탁액에서 부팔린 물질과의 비교가 그림 4에 나와 있습니다. 평균 약동학적 매개변수는 표 3에 나와 있습니다. 결과는 다음과 같습니다. 이들 매개변수의 대부분에서 상당한 차이가 있으며 C최대 bufalin-loaded 리포솜의 bufalin-loaded 리포솜은 bufalin 개체보다 적었고, bufalin-loaded PEGylated 리포솜은 가장 적었습니다. 또한 T1/2z 부팔린이 장착된 PEG화 리포좀 대 부팔린 물질 및 부팔린 장착 리포좀 대 부팔린 물질의 비율은 약 2.15배(87.84분/40.52분)(P <0.01) 및 1.34배(54.40분/40.52분)(P <0.05), 각각. AUC(0–t ) bufalin-loaded PEGylated liposomes 대 bufalin 개체 및 bufalin-loaded liposomes 대 bufalin 개체의 비율은 약 5.49배(139,157.83ng/(mL min)/25,334.27 ng/(mL min))였습니다(P <0.01) 및 2.28배(57,751.88 ng/(mL 분)/25,334.27 ng/(mL 분))(P <0.01), 각각. 부팔린 물질은 혈류에서 빠르게 제거되고 리포솜 제제는 혈장 내 약물 농도를 증가시키고 제거를 견딘다는 것이 밝혀졌습니다. 또한, PEG의 변형은 이러한 효과를 촉진할 수 있습니다.
<그림>
쥐의 혈장 내 부팔린 농도-시간 곡선
토론
본 연구에서는 최적의 크기 범위와 낮은 다분산도를 가지며 큰 배치 크기에서 쉽게 재현할 수 있는 균질화-필름 재수화 방법을 통해 bufalin-loaded 리포솜과 bufalin-loaded PEGylated 리포솜을 성공적으로 준비했습니다. 이 연구에서는 리포솜 제형이 부팔린의 용해도를 크게 향상시키는 것으로 나타났습니다.
Bufalin-loaded PEGylated 리포솜은 양의 표면 전하를 갖는 bufalin-loaded 리포솜보다 더 큰 절대값을 갖는 음의 표면 전하를 나타냈습니다. 제타 전위는 주로 표면 특성에 의해 결정됩니다. 수정되지 않은 bufalin-loaded 리포솜은 중성이었고 그 전위는 일반적으로 ± 5 mV 이내였습니다. 그러나 DSPE는 중성 조건에서 충전되지 않지만 준비 과정이 완전히 중성이 될 수 없으므로 DSPE는 음으로 충전됩니다. 한편, 제타 거대분자 PEG의 전위는 중성 음전위에 가까운 수 밀리볼트에 대해 약 음입니다. 따라서 DSPE-PEG2000의 표면 수정 후 부팔린이 로딩된 리포솜에서 제타 bufalin-loaded PEGylated liposomes의 가능성은 음성입니다. 이러한 발견은 DSPE-PEG2000의 표면 변형이 리포솜의 표면 전위를 변화시켜 안정성을 높였습니다. 시험관내 안정성 테스트를 통해 확인되었습니다. Li et al. [12]는 항-CD40 mAb를 부팔린으로 포장된 PEG화된 리포솜의 표면에 결합하는 리포솜 공동 전달 시스템을 사용했습니다. 리포솜은 부팔린, 콜레스테롤, EPC, DSPE-PEG2000의 조성으로 합성되었습니다. 및 DSPE-PEG2000 - Mal의 몰비는 각각 20:55:5:5:15입니다. 그 다음 항-CD40 모노클로날 항체는 부팔린 리포솜-고정 항-CD40의 제조를 위한 말레이미드-티올 반응을 통해 리포솜에 접합되었다. 안정성 프로파일과 관련하여 명확하고 명확한 데이터 설명 없이 음의 표면 전하는 우수한 안정성을 시사한다는 것만 언급됩니다.
Li et al. [13] Lipoid E-80® 1.25% 및 콜레스테롤 0.06%로 구성된 부파디에놀리드 로딩 리포솜(BU-lipo)을 준비했습니다. bufalin, cinobufagin 및 resibufogenin의 포획 효율은 각각 86.5, 90.0 및 92.1%였습니다. 인지질의 안정성을 고려하여 BU-lipo 제형은 pH 6.5를 선택했습니다. pH, PSD, zeta와 같은 BU-lipo의 특성 잠재성과 포획 효율은 2–8°C에서 최소 3개월 동안 변하지 않았습니다. 그러나 보관 조건을 엄격하게 관리해야 했습니다. 중성 pH에서 보다 안정적인 제제를 연구하여 운송 및 보관 비용을 절감해야 하며, 이는 향후 임상 적용을 위해 고려해야 합니다.
이전 연구의 준비 공식에 따라 우리는 bufalin-loaded 리포솜에 대한 실험을 복제했습니다. 그러나 리포솜의 안정성은 생산 요구를 충족시킬 수 없었습니다.
본 연구에서는 부팔린, 콜레스테롤, L-α-포스파티딜콜린 및 DSPE-PEG2000의 조성으로 bufalin-loaded PEGylated liposomes를 합성했습니다. 각각 10:30:55:5의 몰비로. 특히 폴리카보네이트 멤브레인을 사용하여 Lipex 압출기로 압출하기 전에 이렇게 형성된 혼합물을 고압 균질화로 추가 처리했습니다.
4°C의 중성 pH에서 3개월 동안 보관하면 두 리포솜의 입자 크기가 약간 증가하고 포획 효율이 전반적으로 완만하게 감소하여 임상 적용에 사용하기 편리합니다. TEM 사진은 두꺼운 3차원 구름과 같은 구조가 부팔린이 로딩된 리포솜의 표면을 덮고 있음을 보여주었으며, 이는 DSPE-PEG2000 양친매성 선형 폴리머 구조로 인해 입체 안정화 역할을 합니다.
시험관 내 방출 연구는 bufalin-loaded 리포솜과 bufalin-loaded PEGylated liposomes에서 bufalin의 방출이 동일한 용해 매체에서 지연되는 반면, bufalin 개체는 제한 없이 PBS로 신속하게 확산되는 것으로 나타났습니다. DSPE-PEG2000의 표면 수정 altered the barrier properties of the aqueous boundary layer and the permeability of the membrane, resulting in a low release velocity of bufalin from liposomes.
Regarding cytotoxicity study, bufalin caused an obvious inhibition of growth in multiple tumor cells in a dose-dependent manner, while the results of IC50 indicated that bufalin was more sensitive to U251 and U87 glioma cancer cells than the other kinds of cancer cells, respectively. Moreover, we found that the blank liposome and blank PEGylated liposome were not toxic to cells, revealing the safety of excipients to some degree, whereas the bufalin-loaded liposomes and bufalin-loaded PEGylated liposomes showed concentration-dependent toxicity to U251 glioma cells. In addition, bufalin-loaded PEGylated liposomes showed slightly weaker cytotoxicities compared with bufalin-loaded liposomes and free bufalin. It is assumed that free bufalin was slowly released from bufalin-loaded PEGylated liposomes during incubation. And the release rate of bufalin was slower in bufalin-loaded PEGylated liposomes than bufalin-loaded liposomes. All the results might suggest that after internalization in the cells, free bufalin could be released from bufalin-loaded PEGylated liposomes and induce the apoptosis of U251 glioma cells.
The pharmacokinetic study found that significant differences of pharmacokinetic parameters among bufalin-loaded PEGylated liposomes, bufalin-loaded liposomes, and free bufalin entity did exist. After intravenous administration, free bufalin entity was swiftly cleared in the bloodstream with the highest peak concentration, whereas liposome preparation did obviously increase the drug concentration in plasma and withstood the clearance. Moreover, the surface modification of PEG could facilitate this effect. These results had provided us some information for understanding the properties of bufalin on pharmacokinetics and pharmacodynamics.
As common primary intracranial tumors, 70% of glioma tumors were malignant, including astrocytoma and glioblastoma. The micro environment of the network of glioma was composed of tumor cells, immune cells and various cytokines secreted by them, which was complex and made glioma cells intracranial metastatic easily [2]. Therefore, operations are difficult to perform, and the incomplete surgery excision commonly resulted in the poor prognosis. To these patients, radiotherapy and chemotherapy play key roles in their treatments. Nowadays, the applications of three-dimensional conformal radiation therapy and intensity-modulated radiation therapy technology can not only increase precision, dosage and efficacy, but also reduce damage in cancer therapy, so as to improve their living quality. However, the accurate radiotherapy has great risk because of the particularity of brain tissues and brain functions. Hence, medication of chemotherapeutics is relatively instrumental in glioma cancer treatment, whereas most malignant and highly aggressive glioma tumors have high relapse rates due to BBB and drug resistance [14].
Consequently, selecting a highly sensitive drug to brain glioma and making it penetrate the BBB are becoming emerging scientific subjects to resolve.
In recent years, the researches concerning bufalin have been studied in various aspects, including pharmacology, pharmacodynamics, and pharmaceutics [12, 15,16,17,18,19,20]. Fortunately, some studies found that bufalin had a broad antitumor spectrum. It was sensitive to several kinds of tumor cell lines, including lung cancer, liver cancer, melanoma, and glioma cancer. However, low solubility, heavy toxicity, and short half-life led to a narrow therapeutic index by intravenous administration and easy decomposition by oral administration, which restricted clinical application of bufalin [6]. In addition, bufalin had been reported to be hydrophobic and could only dissolve in some suspending agent or auxiliary solvent including ethanol and tween 80, which might result in some toxic effects [21].
Nevertheless, as a new drug delivery system, the liposomal formulation was considered to be a low-toxic technology with considerable potential for encapsulating lipophilic drugs [12, 22]. Some studies showed that liposome could be easier to enter tumor focus by the process of phagocytosis. Meanwhile, the vascular endothelial cell gaps in the tumor lesion was enlarged, which enhanced this process (enhanced permeability and retention effect, EPR effect) [23, 24]. Moreover, the liposome could sustain releasing antitumor agents so as to extend action time, improve drug efficacy, and decrease adverse reaction [25]. Thus, liposome formulation has a wide prospect to encapsulate antitumor agents [9].
In the previous experiments, we found that the combination chemoimmunotherapy of anti-CD40 plus bufalin by liposomal carriers could enhance anticancer therapeutic efficacy while reducing systemic toxicity, due to the confined biodistribution and prolonged release of cargo [12]. In the present study, we found that bufalin entity has a broad spectrum of anticancer activity. It could inhibit the proliferation of several kinds of tumor cells, such as lung, liver, breast, and glioma cancer cells. As an active traditional Chinese monomer, bufalin is a promising anticancer drug. It was expected to be applied to further clinical study. However, anti-CD40 mAbs has not been approved as a pharmaceutical excipient by the FDA. The toxicity and side effect of anti-CD40 mAbs is still unclear to this day.
Nevertheless, the shortcomings of conventional liposome were obvious in the meantime. Lack of membrane stability, easy oxidation of phospholipid materials, and opsonification of plasma proteins limited its application [26, 27]. By surface-modifying DSPE-PEG2000 on bufalin-loaded liposomes, bufalin-loaded PEGylated liposomes extended its blood circulation, prolonged half-life, and expanded the therapeutic window for glioma.
Therefore, we adjusted the formulation of bufalin-loaded PEGylated liposomes. On this basis, we evaluated the physicochemical properties and comprehensive characterizations both in vitro and in vivo. We characterized pharmacokinetic properties of bufalin-loaded PEGylated liposomes and compared this type of liposome with raw bufalin and non-PEGylated liposomes. Our results revealed the unknown PK properties of this type of liposomes, which will be useful to recommend dosage in a further clinical study.
Our subjects lack some tissue distribution experiments in animals, so it is not known how the liposome formulation altered the distribution of bufalin in the body. Further studies with more experiments are needed.
Conclusions
The present study demonstrated that the solubility, antitumor efficacy, and pharmacokinetics of bufalin-loaded PEGylated liposomes are improved compared with those of bufalin entity. The results suggested that PEGylated liposomal bufalin has the potential to be a good drug delivery system for glioma cancer.
