역미셀 합성을 통한 나노알기네이트:독소루비신 캡슐화 및 유방암 세포독성

방법

자료

알긴산나트륨, 염화칼슘 이수화물, 사이클로헥산(99.9%) 및 도데실아민(98%)은 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO)에서 구입했습니다. 독소루비신 염산염은 MedChem Express(Monmouth Junction, NJ)에서 구입했습니다. 이들 시약은 지시된 바와 같이 물에 알긴산나트륨 및 치료제를 용해시키면서 그대로 사용하였다. 모든 물은 Milli-Q 소스에서 제공한 18MΩ 여과수였습니다.

나노알긴산염의 제조

알긴산나트륨을 물에 15mg/mL로 유리 바이알에 용해하고 사용 전에 최소 30분 동안 교반 막대를 통해 혼합되도록 두었다. DOX는 나노캐리어에 통합되는 경우 이 수상에 용해되었습니다. 합성에 사용하기 전에 알기네이트 분말의 완전한 용해에 대해 알기네이트 용액을 확인하였다. 다가 양이온을 도입하지 않으면 수성 알지네이트 상은 몇 주 동안 균질하게 유지됩니다. 8 밀리리터의 사이클로헥산을 바이알에 피펫으로 넣었습니다. 실온에서 고체인 도데실아민은 고체의 일부가 액체 형태로 전환될 때까지 따뜻한 물에서 몇 분 동안 가열되었습니다. 그런 다음 80μL의 도데실아민을 사이클로헥산에 피펫으로 옮겼습니다. 교반 막대를 유리 바이알에 첨가한 다음, 혼합물을 125rpm에서 교반했습니다. 5분의 혼합 후, 유기상은 잘 혼합된 것으로 간주되어 수상을 첨가할 준비가 되었습니다. 20 마이크로리터의 수성 알기네이트 상을 시클로헥산/도데실아민 유기상에 첨가하였다. 교반 속도를 1200rpm으로 증가시켰습니다. 20분 동안 일정한 교반 하에 혼합이 발생했습니다. 그런 다음 30마이크로리터의 50mM 염화칼슘 용액을 혼합물에 첨가했습니다. 입자의 혼합/겔화 25분 후, 2mL의 물을 혼합물에 첨가하여 유기층 아래에 ​​수성 층을 생성했습니다. 나노입자는 수상으로 분리되었으며, 1mL 피펫을 사용하여 수성층을 제거했습니다.

NALG 정제

수층을 3200×g에서 10분 동안 100kDa 원심 필터 장치(Pall)에서 회전했습니다. 원심분리기에서 큰 응집체를 제거하고 투과액을 10kDa 단위(Millipore)로 옮겼습니다. 그런 다음 용액을 같은 속도로 5분 동안 회전시켜 작은 불순물을 걸러냈습니다. 잔류물을 세척하기 위해 물을 첨가하고 5분 동안 회전했습니다. 1mL의 최종 부피를 수집하고 이 제품에 대해 특성화를 수행했습니다.

NALG의 특성

나노입자의 여과된 용액을 동적 광산란 측정을 위해 큐벳(Malvern Instruments, DTS 1070 zeta cell)으로 옮겼다. 크기 분포는 Malvern Zetasizer ZSP(Malvern Instruments, UK)를 사용하여 결정되었습니다. 크기 측정은 173° 후방 산란 각도의 검출 방법과 함께 25°C에서 633nm 파장 레이저를 사용하여 수행되었습니다. 알긴산 나노입자에 대한 제타 전위 측정은 크기 측정 직후 동일한 큐벳에서 수행되었습니다. 크기 및 제타 전위에 대한 측정은 3회 수행되었으며, 제시된 결과는 3회 시도의 평균 ± 표준 편차를 나타냅니다. 투과전자현미경(TEM)을 사용하여 나노입자의 크기를 확인하고 형태를 조사했습니다. TEM 이미지는 4200eV에서 작동하는 Technai F-20 투과 전자 현미경을 사용하여 획득했습니다. TEM 그리드의 준비에는 10μL의 필터링 후 나노입자 용액을 formavar/탄소 기반 TEM 그리드(Ted Pella)의 구리 표면에 적가하는 과정이 포함되었습니다. 적절한 건조를 보장하기 위해 이미징 전에 젖은 TEM 그리드를 밤새 데시케이터에 덮었습니다.

독소루비신은 고유 형광을 가지고 있어 독소루비신 알지네이트 나노입자(NALG-DOX)의 형광을 DOX의 표준 곡선과 비교하여 농도를 추정하는 데 사용할 수 있습니다. 470/550nm의 여기/방출 파장을 사용했습니다. NALG-DOX 용액으로부터 독소루비신의 방출은 최종 여과된 나노입자 용액을 pH 7.4의 인산염 완충 식염수(PBS) 또는 pH 5.5의 시트르산염 완충액으로 투석함으로써 결정되었습니다. NALG-DOX의 5개 배치로 구성된 두 세트는 이전에 설명한 대로 수성 알지네이트 상의 초기 DOX 농도가 1.25mg/mL로 준비되었습니다. 내부 부피가 100μL이고 분자량 컷오프가 2kDa인 18개의 Slide-A-Lyzer MINI 투석 장치(ThermoFisher)는 각 장치에 100μL의 NALG-DOX를 추가하여 준비했습니다. 각 기기를 완충액 20mL가 들어 있는 섬광 바이알에 넣었습니다. 각 완충제 함유 바이알에 교반 막대를 추가하고, 실험 기간 동안 모든 바이알을 교반 플레이트에 놓아 부드럽게 교반하였다. 바이알은 증발에 대한 완충액의 손실을 줄이고 빛으로부터 보호하기 위해 덮었습니다. 각 시점(1, 2, 4, 24, 48, 72 h)에서 3개의 장치를 제거하고 각 장치에서 100μL의 샘플을 제거하여 별도의 웰에 넣고 Tecan에서 형광 측정을 수행했습니다. 470/550 nm에서 Infinite M200 Pro 마이크로플레이트 리더(Tecan Trading AG). 형광 측정값은 표준 곡선의 측정값과 DOX가 완충액으로 손실되는 양과 농도를 결정하기 위해 실험 전에 취한 초기 분취량과 비교되었습니다.

세포 배양 및 투여

뮤린 유방암 세포, Bioware Ultra Green Cell Line 4T1 루시퍼라제/녹색 형광 단백질(4T1-luc2-GFP, 마우스 선암종) 및 리포터 4T1 세포는 PerkinElmer(매사추세츠주 월담)로부터 입수하지 못했습니다. 이 세포는 5% CO2에서 10% 소태아혈청(FBS) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 RPMI 1640 배지로 유지되었습니다. 37°C에서 작동하는 인큐베이터 4T1 세포를 96웰 흑색 벽의 투명한 바닥 플레이트에 4000개 세포/웰로 시딩했습니다. 웰에 파종한 지 24시간 후에 초기 배지를 흡인하고 약물/배지 제형을 도입했습니다.

형광 이미징

48시간에 배지를 흡인하고 세포를 PBS로 3회 세척하고 포르말린을 웰에 첨가했습니다. 실온 인큐베이션 30분 후, 세포를 다시 PBS로 3회 세척하고, 배지 밀리리터당 NucBlue 고정 세포 ReadyProbes 시약(ThermoFisher) 2방울을 웰에 첨가했습니다. 실온에서 1시간 배양한 후 세포를 PBS로 다시 3회 세척했습니다. 그런 다음 고정된 세포에 PBS 100μL를 추가하고 플레이트를 EVOS FL Auto Cell Imaging System(ThermoFisher)으로 옮겼습니다. × 20 대물렌즈를 사용하여 각 플레이트의 특정 웰 부분을 이미지화했습니다. 각 형광 채널의 이미지는 별도로 기록되었습니다. 4',6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)에 대한 파란색 이미지, DOX에 대한 빨간색 이미지(RFP 채널을 사용하여 고유 형광 캡처) 및 GFP에 대한 녹색 이미지. 4T1-luc2-GFP 세포는 녹색 형광 단백질을 발현하므로 세포가 녹색 채널에서 보이도록 추가 염색이 필요하지 않습니다. DOX 처리는 세포를 "얼룩"하고 적색 채널에서 시각화하기 위해 더 이상의 시약이 필요하지 않습니다. 이미지는 ImageJ에서 조정된 밝기/대비입니다.

살아있는/죽은 세포 생존력 분석

NALG, DOX 및 NALG-DOX와 공동 배양 후 4T1 세포의 생존력에 대한 정성적 평가는 LIVE/DEAD 세포 생존력 분석(ThermoFisher)을 사용하여 평가되었습니다. 약물 함유 배지 도입 후 72시간에 배지를 흡인하고 세포를 PBS로 3회 세척하였다. LIVE/DEAD 분석은 배지 밀리리터당 NucBlue Live Reagent 및 NucGreen Dead Reagent(ThermoFisher)의 각 점적기에서 두 방울을 추가하여 수행되었습니다. 인큐베이션 30분 후 PBS로 3회 더 세척하고 포르말린을 웰에 첨가하여 세포를 고정했습니다. 포르말린에 이어 PBS로 세 번 더 세척하고 최종 100μL 양의 PBS를 각 웰에 첨가했습니다. 명시된 대로 유사한 이미징이 수행되었지만 손상된 세포막이 녹색 시약이 세포에 들어갈 수 있게 하여 녹색 채널은 이제 죽은 세포의 존재를 나타냅니다.

살아있는/죽은 세포 생존 분석

NALG, DOX 및 NALG-DOX와 공동 배양 후 4T1 세포의 생존력에 대한 정량적 평가는 Alamar Blue 세포 생존력 분석(ThermoFisher)을 사용하여 평가되었습니다. 약물 함유 배지 도입 후 72시간에 배지를 흡인했습니다. Alamar Blue 분석은 100μL의 새 배지가 있는 각 웰에 10μL의 Alamar Blue 시약을 추가하여 수행하고 37°C에서 1시간 동안 배양했습니다. 1시간 후, Tecan Infinite M200 Pro 마이크로플레이트 판독기(Tecan Trading AG)를 사용하여 각 웰에 대한 세포 생존력을 측정했습니다. 여기/방출 파장은 560/590으로 설정되었고, 소프트웨어에 의해 플레이트에 대한 최적 이득 설정이 결정되었으며, 플레이트의 각 웰에 대한 형광 강도를 판독하기 위해 하단 판독 프로토콜이 사용되었습니다. % 세포 생존율은 다음 방정식을 통해 형광 강도 판독값에서 결정할 수 있습니다.

결과 및 토론

역 미셀 에멀젼 공정

이 작업에서 나노알긴산염 약물 담체인 NALG는 그림 1과 같이 역 미셀 에멀젼 공정을 통해 제조되었습니다. 수성 알지네이트를 시클로헥산/도데실아민 오일 상에 첨가하여 역 미셀을 형성합니다. 그 다음, 알기네이트는 염화칼슘(CaCl₂ ) 해결책. 역 미셀 내에서 알지네이트의 가교를 허용하도록 시간이 경과한 후, 물을 첨가하여 NALG를 추출하였다. 마지막으로 원심 필터는 잠재적인 오염 물질을 제거하고 나노 입자의 크기 분포를 좁히는 데 도움이 되었습니다. 최종 생성물은 투명한 콜로이드 수용액이었다.

NALG 및 NALG-DOX의 형성을 위한 제형화 과정. 아 역 미셀 합성 과정의 개략도. 수성 알지네이트 사슬은 유기 수조(상단)에서 가교되고 수상으로 추출되고(좌측 하단), 정제를 위해 여과됩니다(우측 하단). ㄴ Ca ²⁺ 의 분자 상호작용 형성된 NALG로 이어지는 가교. ㄷ 왼쪽에서 오른쪽으로 다양한 지점에서의 합성 사진, CaCl₂ 전 유제 추가, CaCl₂ 후 에멀젼 첨가 및 물 첨가시 분리

역 미셀 에멀젼 시스템의 구성 요소는 실험 데이터와 과거 문헌을 기반으로 결정되었습니다. 시스템의 자유도를 좁히기 위해 우리는 유기상으로 사이클로헥산을 선택했습니다. 이 공정의 최적화에서, 우리는 교반하는 동안 소량의 수상을 도입할 때 유기 혼합물의 탁도 증가로 표시되는 나노규모 알지네이트 입자 형성 능력에 대해 계면활성제 어레이를 테스트했습니다. Dodecylamine은 적합한 후보였으며 앞으로 사용할 계면 활성제로 선택되었습니다. 여기에 제시된 실험에서 물은 수상으로 선택되었습니다.

NALG의 특성

그림 2a, b에는 NALG 및 NALG-DOX에 대한 나노입자 유체역학적 크기의 분포가 나와 있습니다. 비어 있거나 치료적으로 로드된 나노입자는 90nm를 중심으로 유사한 피크를 보였습니다. NALG 및 NALG-DOX의 입자 직경은 각각 92.2 ± 4.2nm 및 82.8 ± 3.6nm였습니다. 입자에 대한 다분산 지수(PDI)는 0.320 ± 0.063 및 0.204 ± 0.044였고, ζ-전위는 - 15.0 ± 0.8 mV 및 7.2>± 4였다. <그림>

a의 동적 광산란 분포 NALG 및 b NALG-DOX는 알긴산 나노입자의 단분산 분포를 보여줍니다. c의 투과 전자 현미경 이미지 NALG 및 d NALG-DOX는 입자의 구형 형태를 보여줍니다. 눈금 막대는 큰 그림에서 50nm, 삽입에서 20nm를 나타냅니다.

입자의 크기는 DOX를 알기네이트 매트릭스에 혼입할 때 일정했습니다. ζ 전위는 빈 NALG에 대해 음성이었고, 이는 칼슘으로 연결된 다른 알지네이트 나노입자와 일치했습니다[39]. 독소루비신이 로딩된 입자는 양의 ζ 전위를 가졌다. 이것은 부분적으로 입자 표면에 양전하를 띤 칼슘 이온이 과도하기 때문일 수 있으며, 이는 나노입자에 양전하를 부여하는 데 도움이 될 수 있습니다. 또한 DOX 분자에 존재하는 1차 아민은 알지네이트의 유리 카르복실산 그룹과 정전기적으로 상호작용하여 입자 표면에서 이용 가능한 음전하를 감소시킬 수 있습니다.

그림 2c, d는 칼슘 가교 NALG 및 NALG-DOX의 투과 전자 현미경 이미지를 보여줍니다. 두 가지 유형의 나노 입자는 구형 형태를 나타냅니다. 나노 입자의 일반적인 분포는 크기가 DLS 분포와 유사한 것으로 나타났습니다. 최종 NALG-DOX 용액의 농도는 독소루비신 분자의 고유 형광을 사용하여 평가되었습니다. 여과된 NALG-DOX 생성물의 부피를 PBS로 채워진 섬광 바이알에 넣은 투석 장치의 3중 세트로 나누고 DOX가 NALG-DOX로부터 여러 번 방출되도록 하였다. 초기에 NALG-DOX 용액의 DOX 농도는 ~ 4 μg/mL였으며, 이는 NALG-DOX에 대한 캡슐화 효율 또는 NALG-DOX의 DOX 대 제형에 추가된 초기 DOX의 비율이 ~ %임을 나타냅니다. 이 캡슐화 효율은 유사한 입자[57]에 비해 낮은 것으로 간주되지만, 이는 수상에 존재하는 초기 DOX 때문일 수 있습니다. 초기 수성 상에 존재하는 DOX의 양을 낮추어 제형을 반복하지 않았으며 초기 제형에서 DOX의 양을 낮추면 효율성이 향상될 수 있다고 가정했습니다. 캡슐화되지 않은 DOX는 합성이 끝날 때 3kDa 필터 세척을 통과할 가능성이 높습니다. 독소루비신의 가용성과 상대적으로 저렴한 비용으로 인해 우리는 많은 양의 남은 DOX가 캡슐화되지 않은 상태로 통과할 가능성이 있다는 것을 알고 DOX로 제형을 "포화"하기로 결정했습니다. 캡슐화 효율성을 높이면 향후 작업에서 이 입자 플랫폼을 개선할 수 있습니다.

pH 5.5 및 7.4에서 NALG-DOX의 방출 곡선은 그림 3에서 확인할 수 있습니다. NALG-DOX는 처음 4시간 동안 DOX 탑재량의 약 70%를 유지하고 90%는 24시간까지 입자를 떠납니다. , pH 7.4에서. 이 방출 패턴은 고분자 재료에 일반적이며[57, 58] PBS 저장소에 노출될 때 처음 24시간 동안 제어 방출을 보여줍니다. 5.5의 더 낮은 pH에서 나노입자가 후기 엔도솜에서 세포 흡수 동안 볼 수 있는 pH와 더 유사하여 DOX가 더 빠른 속도로 방출됩니다. 이것은 혈액의 일반적인 순환에서는 더 느린 방출이 필요하지만 산성 종양 미세 환경에서는 더 빠른 방출이 선호되기 때문에 바람직한 행동입니다.

나노입자 용액에서 독소루비신의 방출은 PBS, pH 7.4에서 처음 24시간 동안 제어 방출을 나타냅니다. 독소루비신의 더 빠른 방출은 pH 5.5에서 발생합니다. 각 점은 n의 평균 ± 표준편차를 나타냅니다. =3 측정

DOX의 세포 흡수

48시간에 4T1 마우스 유방암 세포에 의한 NALG-DOX의 흡수는 그림 4a, b에 나와 있습니다. 각 행은 별도의 색상 채널을 나타내고 맨 아래 행은 모든 색상 채널의 합성 이미지를 나타냅니다. 왼쪽 컬럼에는 고농도의 DOX 또는 NALG-DOX가 사용되어 대부분의 세포를 제거하기에 충분합니다. 중간 열은 NALG-DOX에서 DOX의 경우 0.31μg/mL, DOX의 경우 0.28μg/mL의 농도를 보여주며, 이는 일부 세포 사멸 가능성을 보여주고 오른쪽 열은 처리되지 않은 세포를 보여줍니다. 중앙 이미지의 세포는 세포의 핵(파란색) 주위에 독소루비신(빨간색)과 겹치는 것을 보여줍니다. DOX의 존재로 인해 두 패널 및 b의 처음 두 열에서 감소된 세포 수가 처리되지 않은 웰에 비해 세포 증식을 억제합니다. 독소루비신은 핵 DNA에 삽입되어 기능하고[12], 독소루비신과 핵의 공동 국재화는 흡수 시 이 메커니즘을 통해 기능하고 있음을 나타낼 수 있습니다. 도 4b에서, 캡슐화된 독소루비신은 핵 영역의 주변에서 구별된다. 오른쪽 열은 빨간색 채널에서 감지된 유의미한 신호가 없는 처리되지 않은 세포를 보여줍니다. 유리 DOX는 강력하지만 표적 독성을 일으키고 생체 내 순환 시간을 줄였습니다. 캡슐화는 증가된 순환 시간 동안 더 안정적인 방출을 허용하여 NALG-DOX를 생체 내에서 잠재적으로 더 좋게 만들고 향후 작업에서 탐색할 수 있습니다.

독소루비신(DOX)으로 처리된 고정 4T1-luc2-GFP 유방암 세포 이미지의 형광 현미경 검사법(a ) 및 NALG-DOX(b ) 48시간 노출 후. 눈금 막대는 100μm를 나타냅니다. 청색 핵 염색:DAPI; 녹색(형질감염된 세포주):GFP; 빨간색(고유 분자 형광):DOX

NALG-DOX의 세포독성

세포 사멸 가능성에 대한 기본 테스트로, 처리되지 않은 4T1 세포와 NALG-DOX로 처리된 세포를 LIVE/DEAD 세포 분석(ThermoFisher)으로 염색하고 72시간 노출 후 고정했습니다. 처리되지 않은 웰, NALG로 처리된 웰, 0.078μg/mL DOX로 처리된 웰 및 0.20μg/mL NALG-DOX로 처리된 웰의 예시 이미지가 각각 그림 5a–d에 나와 있습니다. 그림 5c, d에 표시된 녹색 중첩은 해당 웰에서 DOX 및 NALG-DOX 처리가 해당 웰에 있는 많은 세포의 사멸로 이어진다는 것을 나타냅니다. 세포는 치료제의 존재로 인해 도 5a, b에 도시된 미처리 및 빈 나노입자 처리 웰에서와 동일한 방식으로 증식할 수 없었다. NALG 및 NALG-DOX에서 투여에 사용된 나노입자의 희석은 동일했습니다.

LIVE/DEAD 형광 분석은 처리되지 않은 4T1 세포(a ) 및 NALG로 처리된 세포(b ). 녹색 채널 신호 강도(죽은 세포 염색)는 0.078μg/mL DOX로 처리된 많은 양의 세포에서 강합니다(c ) 및 0.20μg/mL NALG-DOX(d ), 세포 사멸을 나타냅니다. 눈금 막대는 100μm를 나타냅니다. 농도는 자유형 또는 입자형 DOX의 양을 나타냅니다. (b에서 NALG 투여 ) NALG-DOX에서와 동일한 입자 밀도에서

Alamar Blue(ThermoFisher) 분석을 통해 NALG, 유리 DOX 및 NALG-DOX에 72시간 노출 후 4T1-luc2-GFP 세포의 세포 생존력에 대한 정량적 평가가 그림 6에 나와 있습니다. 그림 6a에서 유리 독소루비신 -처리된 세포는 NALG-DOX 처리된 세포(동일한 농도의 DOX에 대해)보다 전체 농도 범위에 걸쳐 더 적은 생존 세포를 나타냈다. 이것은 IC₅₀에 의해 추가로 표시됩니다. 유리 DOX 및 NALG-DOX에 대해 각각 0.093μg/mL 및 0.45μg/mL인 50% 억제 효과를 나타내는 데 필요한 값 또는 농도입니다. 유리 DOX 값은 Du et al.에 의해 4T1 세포에 대해 72시간에서 발견된 값과 유사합니다. [60]. IC₅₀ 값은 Eliaz et al. B16F10 흑색종 세포에 대해 72시간에 DOX 및 리포솜 캡슐화된 DOX 사용 [61].

NALG-DOX 및 DOX에 72시간 노출 후 4T1-luc2-GFP 세포의 세포 생존율(a ) 및 NALG(b ) 다양한 농도에서. 데이터 포인트와 오차 막대는 n에서 평균 ± 표준편차를 나타냅니다. =3개의 우물. 농도는 (a ). b에서 , NALG 웰은 NALG-DOX와 동일한 입자 농도에서 시작하여 투여되었으며, 이는 약물 담체 단독으로 인한 세포 사멸이 거의 또는 전혀 없음을 나타냅니다.

NALG-DOX가 유리 약물과 유사한 효과를 나타내려면 더 높은 농도의 독소루비신이 필요합니다. 캡슐화된 치료제가 효과 부위로 전달되는 데 더 방해가 되기 때문에 이것은 예상되어야 합니다. 캡슐화된 독소루비신은 여전히 ​​세포 억제 효과를 보여 약물이 여전히 치료적으로 활성이거나 나노입자 자체가 세포에 독성이 있음을 의미합니다. 이를 테스트하기 위해 NALG-DOX와 유사한 방식으로 NALG 생존력을 평가했습니다. NALG는 그림 6b와 같이 모든 농도에서 최소한의 독성을 나타내어 약효가 있음을 나타냅니다.