콘드로이틴 황산염-메토트렉세이트 나노겔의 항종양 연구

초록

자가 조립 나노겔(NG)은 메토트렉세이트(MTX)와 콘드로이틴 설페이트(CS)를 생체 접합하여 형성되었습니다. MTX-CS NG는 CS의 CD44 결합 특성으로 인해 MTX의 용해도를 크게 향상시키고 전달 효능을 향상시킬 수 있습니다. Vivo 실험에서는 MTX-CS NG가 MTX보다 독성이 덜한 것으로 나타났습니다. MTX-CS NG는 MTX의 부작용을 줄이면서 항종양 효과를 향상시킬 수 있습니다. CD44 결합 특성으로 인해 황산 콘드로이틴-약물 접합체는 난용성 약물 분자의 용해도를 개선하고 암세포와 종양 조직으로의 표적 전달을 개선하기 위한 유망하고 효율적인 플랫폼이 될 수 있습니다.

<섹션 데이터-제목="배경">

배경

Methotrexate(4-amino-10-methylfolic acid, MTX)는 항엽산 항대사물질 계열에 속하는 엽산 유사체입니다[1]. MTX는 1950년대부터 종양 치료에 사용된 최초의 약물[2]로 돌연변이 유발 및 기형 유발 항종양 약물로 효소 활성을 차단하고 DNA 합성을 방해하여 작용합니다[3]. 선행 연구에서는 표적 세포에 화학요법 약물을 전달하는 것만으로는 세포 사멸을 유도하기에 충분하지 않으며 고용량 MTX가 환자의 치료율과 예후를 유의하게 향상시킬 수 있음을 보여주었다[4]. MTX의 낮은 수용성, 낮은 투과성 및 짧은 반감기는 임상 적용을 제한합니다[5, 6]. MTX의 화학요법 효과는 낮은 종양 세포 흡수, 조직 생체 분포 및 심각한 부작용에 의해 크게 영향을 받습니다[7]. 그러나 MTX의 농도가 높을수록 MTX의 낮은 생체 이용률로 인해 부작용의 위험이 증가할 수 있습니다[8]. MTX의 생체이용률을 높이고 부작용을 줄이기 위한 새로운 약물 전달 시스템의 개발이 시급합니다.

나노기술은 약물 안정성 향상, 혈액 순환 확장, 부작용 감소, 약물 방출 조절 등 약물 전달 시스템에 장점이 있습니다[9,10,11,12,13,14,15]. 자가조립 기술은 약물 전달 분야에서 약물의 효능을 높이고 부작용을 낮추기 위해 널리 사용되어 왔다[16,17,18,19,20]. 우리 연구는 MTX의 용해도와 생체 분포를 개선하고 부작용을 줄이기 위해 MTX용 나노겔 약물 전달 시스템을 설계하는 것을 목표로 합니다. 콘드로이틴 설페이트(CS)는 산성 글리코사미노글리칸(GAG)으로 연골, 혈관벽, 피부, 힘줄 및 기타 결합 조직의 중요한 구성 요소입니다[21]. 콘드로이틴 설페이트 기반 나노겔은 이전에 연구되었습니다[22, 23]. 연구에 따르면 CD44는 CS 프로테오글리칸에 결합합니다[24,25,26]. CD44는 세포외 도메인이 있는 막관통 당단백질이며 세포-세포 및 세포-ECM 상호작용 매개에 연루되어 있으며 세포 이동에 역할을 합니다[27]. CD44는 정상 조직에서 낮은 발현 수준과 대조적으로 전이성 암에서 높게 발현된다[28]. CS 기반 나노입자는 종양 표적화 및 항종양 약물 전달에 대해 보고되었습니다[29, 30]. 여기에서 우리는 CS-CD44 상호작용을 통해 암세포에 MTX 약물 분자의 표적 전달을 향상시키기 위한 노력의 일환으로 새로운 유형의 자가 조립 CS-MTX 나노겔을 제작했습니다.

방법

자료 및 샘플

황산 콘드로이틴은 Dalian Meilun Biotech Co., Ltd.(Dalian, Liaoning, China)에서 구입했습니다. 4-메틸모르폴린, 테트라히드로푸란 및 2-클로로-4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진은 Sun Chemical Technology (Shanghai, China) Co., Ltd.에서 구입하였고, 태아 소 혈청 (FBS)을 구입했습니다. HyClone(미국 유타주)에서. 다른 모든 화학 물질은 Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.(중국 상하이)에서 구입했습니다. 루이스 쥐는 Shanghai Sippr-BK Laboratory Animal Co., Ltd.(중국 상하이)에서 구입했습니다.

DMT-MM의 합성

4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)-4-메틸모르폴리늄 클로라이드(DMT-MM)는 수성 또는 양성자 용매에서 사용할 수 있는 카르복실산 활성화를 통한 탈수 축합 반응에 사용됩니다. 시스템. 25g의 2-클로로-4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진(CDMT)을 200ml의 테트라하이드로푸란(THF)에 용해했습니다. 그 다음, 18.79ml의 4-메틸모르폴린(NMM)을 교반 하에 CDMT 용액에 적가하였다. 완전한 반응을 위해서는 30분 동안 교반을 유지해야 합니다. 그런 다음, 여과된 생성물을 THF로 3회 세척하고 진공 하에 24시간 동안 건조시켰다. DMT-MM은 백색 분말로 얻었다(도식 1).

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DMT-MM의 합성 경로

MTX-CS 합성

MTX 결합 CS는 DMT-MM에 의해 활성화되었습니다. CS 활성화를 위해 CS(1.0g)를 20ml의 초순수에 용해하고 DMT-MM(0.769g)을 첨가하여 활성화했습니다. 반응은 상온에서 30분 동안 진행되었습니다. 그런 다음 활성화된 CS를 실온에서 24시간 동안 MTX와 추가로 반응시켰다. 용액을 4시간마다 물을 교체하면서 48시간 동안 투석하고 동결건조했습니다. MTX-CS는 노란색 분말로 획득되었습니다. 황색 분말은 푸리에 변환 적외선 분광법(ALPHA, BRUKER, USA)으로 검사하였다. FTIR 스펙트럼은 400~4000cm⁻¹ 에서 기록되었습니다. . ¹ H NMR을 사용하여 MTX가 CS에 접합되었는지 여부를 결정했습니다(도식 2).

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MTX-CS의 합성 경로

MTX-CS 나노겔의 세포독성

나노겔의 세포독성은 A549T와 Hela 종양세포 및 HUVEC(Human Umbilical Vein Endothelial Cell) 배양을 이용하여 분석하였다. A549T 및 Hela 세포를 96웰 플레이트에 5 × 10³ 밀도로 시딩했습니다. 1640에서 웰당 세포, 10% FBS로 보충되고 5% CO₂에서 24시간 동안 배양됨 37°C에서 A549T에 이어서 다양한 농도의 MTX-CS NG(0, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 400μM)로 처리하고, Hela에 다양한 농도의 MTX-CS로 처리했습니다. 추가 48시간 동안 CS NG(0, 5, 10, 30, 40, 60, 80, 100μM) MTX-CS NG의 농도는 각 샘플의 MTX 함량을 기준으로 했습니다. CS의 농도는 각 샘플의 MTX-CS NG의 함량을 기준으로 했습니다. HUVEC는 96웰 플레이트에 5×10³ 밀도로 시딩되었습니다. DMEM에서 웰당 세포, 10% FBS가 보충되고 5% CO₂에서 24시간 동안 배양됨 37°C에서 그런 다음 HUVEC에 다양한 농도의 MTX-CS NG(0, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 400μM)를 첨가했습니다. MTX-CS NG의 농도는 각 샘플의 MTX 함량을 기준으로 했습니다. CS의 농도는 각 샘플의 MTX-CS NG의 함량을 기준으로 했습니다. MTT 분석은 세포 활동의 측정입니다. 20마이크로리터의 CCK-8 완충액을 각 웰에 첨가하고 37°C, 5% CO₂에서 배양했습니다. 다시 4시간 동안 배지를 제거하고 200μL DMSO를 각 웰에 첨가했습니다. 흡광도는 MULTISKAN GO Microplate 판독기(Thermo Scientific, USA)에서 490nm(참고로 570nm)의 파장에서 측정되었습니다.

동물 및 실험 디자인

생체 내 MTX-CS NG의 독성을 분석하기 위해 18번째 수컷 Sprague-Dawley 쥐를 Zhejiang Academy of Medical Sciences(Hangzhou, Zhejiang, China)의 실험 동물 센터에서 구입했습니다. 그 쥐들은 물과 음식에 자유롭게 접근할 수 있는 12시간의 밝은 주기, 12시간의 어두운 주기로 수용되었습니다. 8주 200 ± 10 g의 쥐를 무작위로 세 그룹으로 나누었습니다. 대조군(동일한 양의 식염수 주입), MTX 그룹(1.25μmol kg 주입⁻¹ 일⁻¹ ) 및 MTX-CS NG 그룹(25mg kg⁻¹ 주사) 일⁻¹ MTX-CS NG). MTX-CS NG 그룹의 MTX 용량은 MTX 그룹의 자유 용량과 동일했습니다(1.25μmol kg^-1 일⁻¹ ). 다른 날에는 각각 복강내 주사로 약물을 투여하였다. 치료 2주 후(총 7회 주사) 추가 연구를 위해 모든 쥐를 참수로 죽였습니다.

조직학적 연구

참수 후 모든 쥐의 비장을 신속하게 해부하고 인산완충식염수(PBS)로 두 번 세척하고 4%(w /v ) 파라포름알데히드(pH =7.4)(Sigma-Aldrich, MO, USA)에서 24시간 동안 그런 다음 표준 절차를 사용하여 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색을 위해 조직을 준비하고 고품질 광학 현미경으로 얻었습니다.

결과 및 토론

MTX-CS 합성

MTX가 CS에 결합되었는지 확인하기 위해 FTIR과 ¹ 을 사용했습니다. MTX, CS 및 MTX-CS 생체접합체 샘플을 분석하기 위한 H NMR. 그림 1은 CS(그림 1a), MTX(그림 1b) 및 MTX-CS 생체접합체(그림 1c)의 FTIR 스펙트럼을 보여줍니다. 그림 1b에서 볼 수 있듯이 MTX는 3355, 2951, 1646, 1600, 1540, 1493, 1403, 1207cm에서 특징적인 투과율을 보였습니다. . FTIR은 1600 및 1540cm에서 피크⁻¹ MTX(그림 1b) 및 MTX-CS 생체접합체(그림 1c)의 FTIR 스펙트럼에서 찾을 수 있는 파라-벤젠의 스트레칭에 할당할 수 있습니다. FTIR 결과는 MTX가 CS에 성공적으로 접합되었음을 나타냅니다.

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아 CS의 FTIR 스펙트럼. ㄴ MTX의 FTIR 스펙트럼. ㄷ MTX-CS의 FTIR 스펙트럼

그림 2는 ¹ 을 보여줍니다. CS, MTX 및 MTX-CS 생체접합체의 H NMR 스펙트럼. 6.93에서 피크(2H, d, J =10.1Hz) 및 7.84(2H, d, J =10.1 Hz)는 MTX의 벤조일 그룹에 할당될 수 있습니다. 4.90(2H, s)에서의 피크는 2,4-디아미노-6-프테리디닐 그룹 옆의 메틸렌에 할당될 수 있고, 8.69(1H, s)에서의 피크는 2,4-디아미노-에 할당될 수 있습니다. 그림 2b와 같이 MTX의 6-pteridinyl 그룹이 암시합니다. ¹ CS-MTX의 H NMR(그림 2c)은 CS(이당류 부분 δ _H 신호는 3.20과 5.40 사이였으며, 5.39는 아노머 탄소로 지정됨) MTX에 성공적으로 부착되었습니다(벤조일 그룹의 화학적 이동은 8.00 및 6.88이고 메틸 그룹은 3.20에 있음). NMR은 또한 MTX가 CS에 접합되었음을 증명했습니다.

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¹ CS, MTX 및 CS-MTX의 H NMR 스펙트럼. 아 ¹ CS의 H NMR 스펙트럼; CS는 D₂에서 해산되었습니다. 오. b ¹ MTX의 H NMR 스펙트럼; MTX를 디메틸 설폭사이드-d6에 용해시켰다. ㄷ ¹ CS-MTX의 H NMR 스펙트럼; CS-MTX는 D₂에서 해산되었습니다. 오

CS에 결합된 MTX의 양을 계산하기 위해 샘플을 초순수에 녹이고 실온에서 48시간 동안 흔듭니다. MTX의 양은 309nm에서 UV-vis 분광광도계를 사용하여 결정되었습니다. MTX의 양은 UV-vis 분광법으로 측정하였다. 마지막으로, MTX-CS NG에 대한 메토트렉세이트의 계산된 양은 13.65%였습니다. CS의 친수성 측쇄의 외부 층에 의해 소수성 MTX 분자의 캡슐화에 의해 형성된 나노겔(그림 3a). 나노겔은 동적 광산란(DLS), 원자력 현미경(AFM) 및 투과 전자 현미경(TEM)으로 특징지어졌습니다. 표시된 대로 DLS 데이터는 100-400nm 범위에서 모든 나노겔의 크기를 측정했습니다(그림 3b). 나노 입자의 입자 크기는 주로 약 200nm입니다. 나노겔의 AFM 이미지는 나노입자가 약 200nm의 유사한 크기와 형태로 잘 분포되어 있음을 확인하였다(그림 3c). TEM 이미지는 또한 나노겔의 크기가 200-240nm 범위의 크기를 갖는 나노구체임을 보여주었습니다. 나노 입자의 입자 크기는 주로 약 200nm입니다(그림 3d, e).

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MTX-CS NG의 개략도. MTX-CS NG의 동적 광산란(DLS), 원자력 현미경(AFM) 및 투과 전자 현미경(TEM) 특성화. 아 MTX-CS NG의 개략도. ㄴ 대표적인 실험에서 DLS로 측정한 MTX-CS NG의 크기. ㄷ MTX-CS NG의 AFM 이미지. d , e MTX-CS NG의 TEM 이미지

CS에 결합된 MTX의 양을 계산하기 위해 샘플을 초순수에 녹이고 실온에서 48시간 동안 흔듭니다. MTX의 양은 313nm에서 UV-vis 분광광도계를 사용하여 결정되었습니다.

MTX의 양은 UV-vis 분광법으로 측정하였다. 먼저, 유리 메토트렉세이트 UV 흡수의 표준 곡선을 설정했습니다(그림 4). 흡광도와 유리 MTX 농도 사이의 관계는 다음과 같습니다.

$$ A\kern0.5em =\kern0.5em 0.0518\mathrm{C}\kern0.5em +\kern0.5em 0.0019\ \left({R}^2\kern0.5em =\kern0.5em 0.9998\right) $$ <그림>

메토트렉세이트 UV 흡수의 표준 곡선

그런 다음 28.8mg의 MTX-CS를 1000ml의 초순수에 녹이고 UV 흡수율은 0.2055입니다. 마지막으로, MTX-CS NG에 대한 계산된 메토트렉세이트 양은 13.65%였습니다.

MTX-CS 나노겔의 세포독성

MTX-CS NG, 유리 MTX 및 CS와 혼합된 MTX의 시험관내 항종양 활성을 A549T 및 Hela 종양 세포 배양물을 모두 사용하여 분석했습니다. MTT 분석(그림 5)에서 볼 수 있듯이 MTX-CS NG는 두 암세포의 생존율을 크게 감소시킬 수 있는 반면 유리 MTX는 고농도에서 효과를 나타내지 않았습니다. 고농도의 CS와 혼합된 MTX는 암세포의 성장을 촉진합니다. Hela의 생존율은 10μM 약물 농도에서 유리 MTX의 경우 73.81%에서 MTX-CS NG의 경우 60.16%(세포 생존율의 13.65% 감소)로 감소했습니다(그림 5a). 마찬가지로, A549T 세포 생존율은 50μM 약물 농도에서 유리 MTX의 경우 80.23%에서 MTX-CS NG의 경우 46.04%(세포 생존율의 34.09% 감소)로 감소했습니다(그림 5b). 히알루론산과 같은 다당류는 CD44 수용체에 특이적으로 결합하기 때문에 암 치료를 위한 약물 접합체 또는 나노입자의 표적 부분으로 사용된다[31]. 황산 콘드로이틴은 또한 CD44 수용체에 대한 리간드로 작용할 수 있습니다[25, 27]. 이는 CS가 암세포에 의한 MTX-CS NG의 흡수를 촉진하고 MTX의 약물 효능을 향상시킬 수 있음을 의미합니다. 또한 나노 입자는 약물의 안정성을 향상시키고 약물의 방출을 제어할 수 있습니다[32, 33]. 모든 결과는 MTX-CS NG의 항종양 활성이 CS와 혼합된 MTX 뿐만 아니라 유리 MTX보다 우수함을 입증했습니다. MTX 약물 분자의 세포 내 전달 효율이 증가함에 따라 동일한 농도의 유리 MTX와 비교할 때 MTX-CS NG의 표적화 선택성도 향상되었습니다. 이러한 결과는 MTX-CS NG가 유리 MTX보다 항종양 효과가 더 우수함을 보여줍니다.

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아 48시간 내 무료 MTX, 무료 MTX 및 CS, MTX-CS NG가 있는 경우 A549 T의 세포 생존 가능성. ㄴ 48시간 내에 무료 MTX, 무료 MTX 및 CS, MTX-CS NG가 있는 경우 Hela의 세포 생존 가능성. ㄷ 48시간 내에 무료 MTX, CS 및 MTX-CS NG가 있는 HUVEC의 세포 생존 가능성

MTX-CS NG, free MTX, CS의 부작용은 HUVEC 배양을 이용하여 분석하였다. MTT 분석(그림 5c)에서 볼 수 있듯이 MTX-CS NG는 부작용을 크게 줄일 수 있는 반면 유리 MTX는 HUVEC의 생존력을 크게 줄일 수 있습니다. HUVEC의 생존율은 10μM 약물 농도에서 유리 MTX의 경우 63.6%에서 MTX-CS NG의 경우 73.5%(세포 생존율의 9.9% 증가)로 증가했습니다(그림 5c). 400μM에서 HUVEC의 세포 생존율은 여전히 69.95%였습니다. 결과는 MTX-CS NG가 정상 세포에 대한 부작용을 줄일 수 있음을 나타냅니다.

동물 및 실험 디자인

암 환자 치료에 사용되는 MTX의 주요 2차 독성 부작용 중 하나는 장 점막염으로 체중이 급격히 감소한다[34]. 그런 다음 수컷 Sprague-Dawley 쥐에서 화학 요법으로 인한 체중 감소에 대한 MTX-CS NG의 보호 효과를 테스트했습니다. 생리 식염수, 유리 MTX 및 MTX-CS NG를 주사한 후 14일 동안 생존 및 체중을 모니터링했습니다. 세 그룹 모두에서 사망은 발견되지 않았습니다. 모든 MTX 그룹의 체중에서 급격한 감소가 관찰되었습니다(1.25μmol kg⁻¹ 일⁻¹ 14일 동안), 쥐가 화학 요법 증후군과 화학 요법으로 인한 손상을 경험하여 질병과 체중 감소를 경험했음을 분명히 나타내는 반면 MTX-CS NG로 치료한 쥐의 체중(4.25mg kg⁻¹ 일⁻¹ 14일 동안)가 약간 증가했습니다(그림 6). 결과는 MTX-CS NG가 부작용을 일으키지 않았음을 보여줍니다. 이러한 발견은 CD44-CS 상호작용을 통해 종양 조직으로의 MTX의 표적 전달을 지지하고 MTX 약물의 세포독성을 감소시킨다.

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쥐 체중에 대한 MTX 및 MTX-CS NG의 효과. 첫 번째 주사일을 0일로 간주했습니다. 식염수, MTX(1.25μmol kg⁻¹ 일⁻¹ ) 및 MTX-CS NG(4.25mg kg⁻¹ 일⁻¹ )은 해당 그룹에 각각 복강 내 주사로 다른 날을 주었다. 결과는 평균 ± SEM으로 표시되고 t를 사용하여 분석됩니다. 테스트. *피 <0.05일과 0일차 비교

MTX-CS NG의 생체 내 독성을 추가로 조사하기 위해 쥐의 비장에 대한 조직학적 분석을 수행하여 MTX-CS NG가 조직 손상을 유발했는지 여부를 확인했습니다(그림 7). 대조군의 단면은 백색 속질(모양)과 적색 속질(RP)로 구성된 정상 비장의 구조를 보여주었고 섬유소주(T)는 비장 속으로 확장되어 있었다. 백색 펄프는 동맥 주위 림프관과 비장 여포를 포함하고 변연부로 둘러싸여 있는 반면, 적색 펄프는 비장 척수로 구성되고 비장 정현파에 의해 분리됩니다(그림 7a 및 7b). MTX 처리군은 백색펄프(블랙박스)와 RP 모두 심각한 협착을 보였다. 헤모시데린 침전물은 MTX 처리군에서도 발견될 수 있습니다(그림 7c 및 7d). MTX-CS NG 처리군은 헤모시데린 침착물이 발견되지 않고 백색 펄프(모양)와 RP 모두의 경미한 협착을 보였다. 백색 펄프와 적색 펄프 모두 MTX 그룹에 비해 약간의 협착을 보였다(그림 7e 및 7f). 위의 결과는 MTX-CS NG가 정상 조직에 거의 부작용이 없음을 나타냅니다[35, 36].

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쥐의 비장에 대한 MTX 및 MTX-CS NG의 독성 효과. 7회 복강 내 주사 후 14일 치료 후 마우스에서 절제된 H&E 염색 비장. 아 , b 통제 그룹의 섹션. ㄷ , d MTX 처리군. 이 , f MTX-CS NG 처리군

결론

요약하면, 우리는 고효율 항종양 약물 전달을 위해 자가 조립된 나노겔을 성공적으로 제작했습니다. MTX-CS가 결합된 나노겔은 크기가 약 200nm로 우수한 안정성과 용해도를 나타냈습니다. MTX-CS NG는 MTX보다 더 강력하고 더 구체적인 세포독성을 보였다. 생체 내 실험에서 MTX-CS NG가 MTX보다 독성이 덜한 것으로 나타났습니다. MTX-CS NG는 MTX의 부작용을 줄이면서 항종양 효과를 향상시킬 수 있습니다. CD44 결합 특성으로 인해 황산 콘드로이틴-약물 접합체는 난용성 약물 분자의 용해도를 개선하고 암세포와 종양 조직에 대한 활성 및 선택적 표적 전달을 개선하기 위한 유망하고 효율적인 플랫폼이 될 수 있습니다.

약어

¹ H NMR:: 1H 핵자기공명
AFM:: 원자력 현미경
CDMT:: 2-클로로-4, 6-디메톡시-1, 3, 5-트리아진
CS:: 황산콘드로이틴
DLS:: 동적 광산란
DMT-MM:: 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)-4-메틸모르폴리늄 클로라이드
FTIR:: 푸리에 변환 적외선
MTT:: 3-(4,5-디메틸-2-티아졸릴)-2,5-디페닐-2-H-테트라졸륨 브로마이드
MTX:: 메토트렉세이트
MTX-CS NG:: 메토트렉세이트-콘드로이틴 설페이트 나노겔
NG:: 나노겔
NMM:: 4-메틸모르폴린
TEM:: 투과전자현미경
THF:: 테트라히드로푸란
자외선 가시광선:: 자외선 가시 분광법

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나노물질