마약 재활용

SARS-CoV-2 주요 프로테아제 억제

신약 개발은 비용과 시간이 많이 소요되는 과정입니다. 오늘날 세계가 대유행에 직면해 있기 때문에 바이러스 확산을 막는 약물을 신속하게 식별할 필요가 있습니다. 약물 용도 변경은 인간에게 안전한 것으로 알려진 약물이 새로운 질병을 치료하는 데 사용될 수 있는지 확인함으로써 이 긴 과정에 대한 매력적인 대안을 제공합니다.

이러한 재배치된 약물을 개별적으로 사용하면 결국 상당한 임상적 이점을 얻지 못할 수 있지만, 1990년대 HIV의 경우와 같이 바이러스 복제 및 증식에 중요한 여러 단백질을 표적으로 하는 약물의 신중한 조합은 매우 효과적일 수 있습니다. 시급한 질문은 어떤 조합이 더 효과적일까요?

여기에서 우리는 SARS-CoV-2 프로테아제 활성 부위의 구조를 이해하려고 시도하며, 이를 마이크로몰 억제제와 복합된 기존 SARS-CoV 프로테아제 구조와 비교하여 우수한 억제제를 만드는 데 필요한 주요 상호 작용을 더 잘 이해할 수 있습니다. SARS-CoV-2 프로테아제의 경우.

그런 다음 FDA 승인 약물 라이브러리를 사용하여 가상 스크리닝 실험을 수행하여 이들 중 일부가 프로테아제에 결합할 것으로 예상되는지 확인했습니다. SARS-CoV-2 프로테아제에 결합할 것으로 예측되어 복합 요법에 사용될 수 있는 방법을 조사했습니다.

SARS-CoV–2 단백질

아픈 환자의 SARS-CoV-2 게놈은 신속하게 분리되고 시퀀싱되어 가능한 단백질 표적의 서열을 제공했습니다. 이 단백질은 SARS-CoV 단백질과 높은 서열 유사성을 공유하며 초기 연구 그룹은 상동성 모델을 구축하기 시작했습니다. 이제 우리는 이러한 실험적으로 파생된(X선 및 Cryo-EM) 구조가 점점 더 많이 사용되는 것을 보고 있습니다.

코로나바이러스 중에서 가장 잘 규명된 약물 표적 중 하나는 주요 프로테아제인 Mpro(3CL 프로테아제라고도 함)입니다. ¹ 파파인 유사 프로테아제와 함께 이 효소는 바이러스 RNA에서 번역되는 다단백질을 처리하는 데 필수적입니다. ² 이는 큰 다단백질 1ab의 11개 절단 부위에서 아미노산 골격을 절단합니다(그림 1).

이 효소의 활성을 억제하면 바이러스 복제가 차단됩니다. 유사한 절단 특이성을 가진 인간 프로테아제가 알려져 있지 않기 때문에 이 표적에 대한 억제제는 독성이 있고 부작용을 일으킬 가능성이 훨씬 적습니다.

약물 용도 변경을 위한 구조 기반 약물 설계:주요 프로테아제

이 주요 프로테아제는 동종이량체이며(그림 2) 각 소단위는 His41/Cys145 촉매 쌍을 포함합니다.

SARS-CoV-2는 SARS-CoV 프로테아제와 96.1%의 동일성과 99%의 유사성을 공유합니다. (그림 3) 활성 부위의 아미노산 차이는 단 하나뿐입니다. SARS-CoV-2의 46번 잔기는 SARS-CoV의 알라닌 대신 세린입니다.

SARS-CoV Mpro에는 PDB에서 사용 가능한 리간드와 복합된 구조가 많이 있으며 마이크로 몰 결합 친화도를 갖는 리간드는 모두 공유 리간드입니다.

주요 프로테아제의 활성 부위는 코로나바이러스 중에서 고도로 보존되어 있으며 일반적으로 4개의 부위(S1', S1, S2 및 S4)로 구성됩니다. ³ (그림 4).

리간드가 각각 0.038μM 및 0.053μM의 Ki 값을 갖는 PDB 구조 2ZU4 및 2GX4의 경우, S1' 부위에 있는 시스테인 145의 티올은 공유 결합으로 억제제와 접촉합니다. 이는 낮은 친화도를 가진 다른 억제제와 비교할 때 높은 친화력에 중요한 것 같습니다.

이러한 모든 리간드가 이 프로테아제와 상호 작용하는 방식에 대한 주의 깊은 조사는 도킹 결과를 분석할 때 모니터링할 주요 상호 작용에 대한 정보를 제공할 수 있습니다.

가상 스크리닝

2월에 출시된 공유 결합된 펩티드 유사 억제제 N3(6LU7) ⁴ 와 결합된 복합체에서 SARS-COV-2 프로테아제 이량체의 고해상도 결정 구조 활용 , 이 구조를 사용하여 가상 스크리닝 실험을 수행했습니다. 공결정화된 억제제 N3는 확장된 형태로 기질-결합 포켓에 결합합니다. (그림 5)

우리는 2,684개의 화합물이 포함된 FDA 승인 약물을 포함하는 라이브러리로 시작했습니다. 분자량이 800kDa 미만인 화합물을 유지하고 CCDC에서 GOLD로 도킹을 수행했습니다. 나중에 CHARMM 및 GBMV 암시적 용매를 사용하여 Binding Free Energies를 계산했습니다. 각 포즈에 대해 먼저 잔류물 유연성을 위해 직경 14Å의 구체를 사용하여 제자리 리간드 최소화를 수행하고 결합 자유 에너지를 계산할 때 리간드 엔트로피를 추정했습니다. 도킹된 화합물의 대부분은 알려진 HCV 및 HIV 프로테아제 약물입니다. (그림 6)

많은 화합물이 4개의 하위 부위인 S1, S'1, S2, S4에서 접촉하고 일부는 HIS 41 및 CYS 145, 특히 HIV 프로테아제 억제제와 접촉합니다.

최고 점수를 받은 화합물은 플라보노이드인 트록세루틴입니다.

5위 화합물인 디피리다몰(그림 7)은 최근 출판 전 논문에서 응고 기능 장애가 있는 COVID-19 환자에 대한 디피리다몰의 치료 효과에 대해 언급되었으며 100nM의 EC50에서 HCoV-19 복제를 억제하는 것으로 나타났습니다 시험관 내.

그림 7 :메인 프로테아제에서 디피리다몰의 3D 렌더링 및 2D 상호작용 맵. 촉매 잔류물과의 상호작용이 존재하며 앞서 SARS-CoV 억제제에 대해 언급한 잔류물 중 일부와 상호작용합니다.

최근 출판 전에서는 여러 HIV 프로테아제 억제제에 대한 세포 분석 결과를 보고했습니다. .”

우리는 사전 인쇄에서 표를 보고하고 있습니다(표 1). 이들은 IC50이 아니라 EC50이므로 이 분자가 프로테아제에 얼마나 잘 결합하는지 알 수 없습니다. 그러나 이는 모든 화합물이 SARS-CoV-2의 복제를 억제하고 일부는 다른 것보다 더 활성임을 보여줍니다.

Ritonavir와 Lopinavir는 SARS-CoV 프로테아제를 표적으로 하는 다른 화합물에서 이전에 볼 수 있었던 많은 잔기와 상호작용합니다(그림 8 및 9). 이 두 분자의 조합에 대해 여러 임상 시험이 진행 중이지만 불행히도 SARS-CoV-2에 대한 Ritonavir 또는 Lopinavir에 대해 사용할 수 있는 IC50 데이터는 없습니다.

그림 8 :Ritonavir에 대한 최고 점수 포즈:및 Ritonavir가 2개의 촉매 잔기인 CYS145 및 HIS41뿐 아니라 SARS-CoV의 알려진 다른 억제제에서 볼 수 있는 GLU166, PRO168 및 GLN189와도 상호작용함을 보여주는 2D 상호작용 도표.

그림 9 :로피나비르의 베스트 득점 자세:및 로피나비르가 2개의 촉매 잔기인 CYS145 및 HIS41과 상호작용하지만, SARS-CoV의 알려진 다른 억제제에서 볼 수 있는 GLU166, PRO168 및 GLN189와도 상호작용함을 보여주는 2D 상호작용 다이어그램입니다.

Nelfinavir(그림 10)는 우리 계산에서 예상되는 결합 친화도가 높으며 최근 사전 인쇄에서 COVID19에 대해 특성화되었습니다. "Nelfinavir는 Vero E6 세포에서 SARS-CoV-2에 대해 활성입니다."

두 번째 사전 인쇄는 Atazanavir가 SARS-CoV-2 감염 세포에서 활성임을 보여줍니다. "Atazanavir는 SARS-CoV-2 복제 및 전염증성 사이토카인 생성을 억제합니다."

SARS-CoV-2에 대한 새로운 억제제를 포함하는 PDB 구조 6W63은 이 작업을 시작한 후 발표되었습니다(그림 11). SARS-CoV-2 Mpro에 대한 이 화합물의 결합 친화도에 대한 공개된 정보는 없습니다. 결합 부위의 측쇄는 6LU7의 경우와 거의 동일한 방향에 있습니다. 우리는 화합물을 도킹하고 이전과 같이 MMGBSA 접근 방식으로 다시 점수를 매겼고 매우 유사한 결과를 찾았습니다.

그림 11 :PDB 구조 6W63:억제제 X77과 복합체의 SARS-CoV-2 주요 프로테아제.

관점

SARS-CoV-2 프로테아제의 결합 부위는 매우 커서 4개의 하위 부위를 포함하며 적당한 결합 친화도로 다양한 리간드를 수용할 수 있습니다. 여기에 설명된 대로 가상 스크리닝은 가능한 억제제를 식별하는 데 유용한 도구이며 가능한 억제제가 프로테아제와 상호 작용할 수 있는 방법에 대한 구조적 설명을 제공할 수 있었습니다.

그러나 이러한 모든 가설은 더 강력한 모델을 구축하기 위해 IC50 측정과 같은 실험적 증거에 의한 확인이 필요합니다.

여기서 우리는 공유 도킹을 수행하지 않았지만 SARS-CoV 프로테아제에 대한 가장 활성 화합물이 공유적이기 때문에 이것은 강력한 억제제의 요구 사항일 수 있습니다. 공유결합 억제제는 또한 가역적 억제제와 비교하여 강한 표적 친화력 및 환자의 연장된 작용 수명과 같은 이점을 나타냅니다.

약물이 환자에서 활성을 나타내기 위해서는 약동학과 같은 다른 약리학적 측면을 고려해야 합니다. 인간에게 승인된 투여 후 목표 혈장 및 폐 농도를 달성하기 위한 이들 약물의 능력을 평가하는 것이 필요할 것입니다.

다른 구조 기반 설계 연구에 대해 언급하는 것은 이 작업의 범위에 있지 않습니다. 이는 현재 전염병에 시기 적절하지 않기 때문입니다. 우리의 목적은 COVID19에 대한 잠재적 후보 약물에 대해 쉽게 사용할 수 있는 치료법을 평가하는 것이었습니다.

이 작업의 가상 스크리닝에 GOLD를 사용할 수 있도록 허락해 주신 Cambridge Crystallographic Data Center(CCDC)에 감사드립니다. GOLD는 가상 스크리닝, 리드 최적화 및 활성 분자의 올바른 결합 모드 식별에서 성공을 입증했습니다. GOLD에 대한 인터페이스는 Discovery Studio 내에서 사용할 수 있습니다.

온라인 파이프라인 파일럿 교육 SARS-CoV-2에 대한 새로운 통찰력을 제안하는 모델링 및 시뮬레이션