rhBMP-2 탑재 실크 피브로인 스캐폴드로 골조직 공학에서 골유도능 향상

초록

생물의료 응용에서 실크 피브로인(SF) 스캐폴드 제형에 대한 수요가 증가하고 있다. SF를 글루타르알데히드로 가교하고 골유도 재조합 인간 골형성단백질-2(rhBMP2)를 서로 다른 비율로 결합하였다: (i) 3% SF 단독(SF), (ii) 3% SF에 동량 rhBMP2(SF+BMP2), (iii) 12% SF에 3% rhBMP2(4SF+BMP2). 이 용액들을 전기방사 기반 나노스캐폴드 제작에 사용하여 rhBMP2가 포함된 SF 스캐폴드의 골유도 잠재력 증가를 평가하였다. 응력-변형률 관계에서 rhBMP2 첨가 시 섬유 기계적 강도 손실이 없었으며, SF 농도 증가에 따라 스캐폴드 기계적 강도가 향상되었다. rhBMP2 결합은 부종 연구에서 나타낸 바와 같이 스캐폴드 수분 보유 능력을 증가시켰다. hMSC 생존율은 결합 스캐폴드에서 더 높았으며, 스캐폴드는 손님 세포에 세포독성을 나타내지 않았다. 세포는 체외 및 체내 조건에서 결합 스캐폴드에서 더 높은 알칼리 포스파타제 활성을 보였으며, 이는 새로운 구조물의 골유도능 증가를 입증한다. 스캐폴드는 체내 골형성에도 효과적이었다.

배경

뼈의 재생 능력은 작은 골절을 스스로 복구할 수 있게 한다. 뼈가 형성되고 유합된 후 원래 모양과 형태로 재구성된다. 그러나 이 능력은 제한적이며, 동종 이식이나 자가 이식 치료가 필요하다[1]. 동종 이식은 별도 기증자로부터 뼈를 얻으므로 면역 반응을 일으킬 수 있다. 자가 이식은 환자 자신의 뼈를 사용해 면역 문제가 없지만, 이용 가능한 뼈 양이 제한적이다[2,3,4].

조직 공학은 동종/자가 이식의 면역학적 한계를 극복할 잠재적 기술로 인식된다. 조직 공학에서 인간 중간엽 줄기세포나 골육종 세포(MG63) 같은 특수 세포를 사전 제작된 스캐폴드 위에서 적합한 환경 하에 배양하고, 이 세포-스캐폴드 시스템을 이식편으로 사용한다[5,6].

스캐폴드는 세포 생존과 증식을 위한 고정점과 생화학적 틈새를 제공한다. 기계적 강도, 골유도, 생체흡수, 점진적 다공성, 생체적합성 등 여러 특성을 고려하여 골조직 공학(BTE)용 스캐폴드 재료를 선택한다. 골유도(뼈 형성 유도)는 BTE용 스캐폴드 재료의 필수 특성 중 하나이다[7]. 골유도 인자를 가진 스캐폴드는 혈관신생과 골생성이 결합된 뼈 조직 재생 과정을 모방하는 데 강력하며, 전구 세포 모집과 분화를 유도할 수 있다. 골형성단백질(BMP)은 뼈 형성을 유도하는 성장 인자 계열로, 탈회골 기질(DBM), 인산칼슘과 함께 BTE 응용으로 제안되어 왔다[8,9,10].

여러 그룹이 금속, 세라믹, 합성 폴리머 및 복합체, 실크 피브로인 등을 BTE 스캐폴드 제작 잠재 재료로 보고하였다. 실크 피브로인(SF)은 뛰어난 기계적 및 생체적합성 특성으로 조직 공학 응용 스캐폴드 제작에 적합한 재료로 보고되었다[5]. 현재까지 BMP와 SF 전기방사 나노스캐폴드의 연관 이점을 평가한 보고는 없다.

여기서 우리는 새로운 재조합 인간 골형성단백질-2(rhBMP2) 결합 SF 전기방사 나노섬유 스캐폴드 제작을 보고한다. 순수 SF 스캐폴드와 비교하여 rhBMP2 결합이 골유도에 미치는 영향을 규명하였다. 세포 생존율과 증식 특성도 측정하여 새롭고 더 나은 골조직 공학 응용을 위한 스캐폴드 효능을 입증하였다.

방법

SF/BMP2 수용액 제조

먼저 누에고치(Bombyx mori)에서 정립된 프로토콜에 따라 약간 수정하여 SF를 수용액으로 분리하였다[11]. 고치를 0.02 M Na₂CO₃ 100 mL에서 20분 끓이고 증류수로 철저히 헹구어 수용성 세리신과 왁스를 제거하였다. 추출된 피브로인을 60°C에서 4시간 9 M 리튬 브로마이드 용액에 용해하고 4일간 물에 대해 투석하였다. 최종 농도는 건조 후 건조 물질 무게로 결정되어 7% w/v로 나타났다. 이 용액을 25% 폴리에틸렌 글리콜(PEG, 10,000 g/mol) 용액 1 L에 대해 실온에서 투석하여 다양한 농도로 농축하였다. 희석 SF 수용액은 증류수로 희석하여 제조하였고, 모든 용액은 추가 처리까지 10°C에서 보관하였다. 동결건조된 재조합 인간 골형성단백질-2(rhBMP2) 분말을 PBS(pH 3.8)에 용해하였다. 단백질 용액을 0.22 µm 주사기 필터로 멸균하고 각 피브로인 용액에 지속적 교반하며 수용액으로 첨가하였다. 글루타르알데히드 매개 가교로 BMP를 피브로인과 결합시켰다. 간단히, 10 mL 반응 혼합물에 6% 실크 피브로인 5 mL와 1% rhBMP2 5 mL를 200 µL 글루타르알데히드와 40 µL 12 N HCl로 기 활성화제로 가교하였다. 이 절차로 세 용액 제조: (i) 3% 실크 피브로인 단독(SF), (ii) 3% 실크 피브로인에 0.5% rhBMP2(SF+rhBMP2), (iii) 12% 실크 피브로인에 (ii)와 같은 0.125% rhBMP2(4SF+rhBMP2). 이 용액들을 전기방사 공정으로 스캐폴드 제작에 사용하였다.

전기방사로 스캐폴드 제작

스캐폴드 제작을 위해 각 용액을 5 mL 유리 주사기에 스테인리스 스틸 니들(25G, ID 0.26 mm, Sigma Aldrich)로 장착하고 5.5 kV DC 전원에 연결하였다. 섬유 제작을 위해 주사기 펌프로 출구 유속 0.4 mL/h 유지하였고, 전기방사 섬유를 모세관 팁에서 15 cm 간격의 알루미늄 호일에 수집하였다. 각 4시간 동안 시료를 수집하였다.

주사 전자 현미경

제작된 스캐폴드 형태 검사를 위해 Zeiss EVO40SEM으로 SEM 수행. 시료를 금 스퍼터 코팅 후 스캔 이미지 추가 처리. 이미지 프레임 내 10개 무작위 섬유 직경 평균으로 섬유 직경 결정.

스캐폴드 기계적 특성

Instron 단일 컬럼 테이블탑 전자기계 테스터(model 3345, Instron, Canton, MA)로 개발된 스캐폴드 기계적 특성 평가 위해 압축 실험 수행. 전기방사 더 긴 지속으로 얻은 0.2 mm 직경 섬유를 사용하여 25°C, 50% 습도에서 응력-변형률 곡선으로부터 인장 강도와 파단 신도 결정.

부종 연구

부종 비율 측정을 위해 각 제형을 PBS(pH 7.4)에 37°C에서 용해하였다. 미리 정해진 시간 간격으로 시료를 꺼내 전자 저울로 건조 무게 측정. 평형 무게 도달까지 테스트 지속. 부종 비율은 다음과 같이 표현:

부종 비율(%) = (W_s - W_o)/W_o

여기서 W_o = 나노섬유 매트릭스 초기 건조 무게, W_s = 각 시점 부종 나노섬유 매트릭스 무게.

세포 배양

제작된 나노스캐폴드 골유도 잠재력 평가를 위해 인간 중간엽 줄기세포(hMSC) 사용. hMSC를 DMEM에 10% 태아 소 혈청, 1% 페니실린으로 37°C, 5% CO₂ 가습 분위기에서 90% 컨플루언스까지 배양 유지. 세포를 트립신화, 원심 분리, 배양액에 재현탁하여 정량화.

스캐폴드를 에탄올 세척과 30분 UV 조사로 멸균하고 PBS(pH 7.4)로 세척. 세포 파종 전 DMEM 처리. 20 µL 세포 현탁액을 각 스캐폴드와 대조용 플라스틱 필름에 방울wise 첨가. 스캐폴드를 가습 분위기(37°C, 5% CO₂)에서 30분 정지. 이후 21일간 DMEM 배양하며 격일로 배지 교체.

세포 부착 분석

세포의 스캐폴드 부착 능력 평가를 위해 문헌 방법에 따라 약간 수정하여 초기 파종 후 1, 3, 6시간에 미부착 세포 수 계수[6]. 세포 배양액 수집하고 혈구계산기로 세포 수 계수. 초기 파종 수와 미부착 세포 수 차이를 부착 세포 수로 간주. 결과는 다음 방정식으로 부착률(%) 표현:

% 부착 = (초기 파종 - 미부착 세포 수) / 초기 파종 × 100

세포독성 분석

나노섬유 매트릭스 독성 효과 측정을 위해 MTT 분석 수행. 각 시간대 후 구조물을 MTT 용액(1 mg/mL 스톡 용액을 PBS(pH 7.4)에 1:10 비율로 희석)에 배양 4시간. 생존 세포는 이 기간 동안 MTT를 포르마잔 염으로 전환. 포르마잔 염을 DMSO 첨가로 용해하고 20분 방치. 마이크로플레이트 리더로 570 nm 흡광도 변화 기록하여 포르마잔 염 유래 흡광도 정량 측정.

세포 증식 분석

알라마 블루(AB) 염료 환원 분석으로 스캐폴드 내 세포 증식 결정. 스캐폴드를 DMEM 희석 염료에 4시간 배양하고 분광광도법으로 염료 환원 측정. % AB 환원 계산:

% AB 환원 = [(ε_oxλ₂)(Aλ₁) - (ε_oxλ₁)(Aλ₂)/(ε_redλ₁)(A'λ₂) - (ε_redλ₂)(A'λ₁)] × 100

여기서 ελ₁ = 570 nm 알라마 블루 산화형(ε_ox) 몰 흡광 계수, ελ₂ = 600 nm 환원형(ε_red) 몰 흡광 계수. Aλ₁, Aλ₂는 테스트 웰 흡광도. A'λ₁ = 570 nm 음성 대조 웰 흡광도. A'λ₂ = 600 nm 음성 대조 웰 흡광도.

ALP 분석

스캐폴드 내 배양 hMSC의 알칼리 포스파타제(ALP) 생산을 제조사 프로토콜에 따라 키트[12]로 측정. 간단히, 멸균 PBS(pH 7.4)로 세척 및 배양 후 1 mL Tris 버퍼(1 M, pH 8.0)로 균질화하고 얼음 위에서 3분 초음파 처리. 용해액 25 µL를 1 mL p-니트로페닐 인산 용액(16 mM)과 30°C에서 5분 배양. 405 nm에서 분광광도 측정으로 ALP 존재 하 p-니트로페놀 생성 모니터링.

체내 ALP 활성

100-120 g 각각 9마리 수컷 무흉선 누드 랫을 취하고 복근을 양측 절개하여 주머니 생성. 누드 마우스 모델로 스캐폴드 골유도 잠재력 체내 입증. 세 유형 스캐폴드 각각(5 mm×5 mm) 잘라 근육 주머니에 별도 포장. 주머니를 비흡수성 봉합사로 닫음. 14일 후 복직근 절개로 임플란트 회수하여 PBS 보관. 근육 피판 절제, 설명 조직 획득하여 추출 버퍼로 균질화하여 알칼리 포스파타제 방출. 용액 50 µL 분취량으로 ALP 활성 측정.

통계 분석

모든 실험 3회 반복 수행, 데이터는 평균 ± 표준편차(SD) 형식으로 제시(언급 제외). Origin 6.0 통계 소프트웨어로 일원 분산 분석(ANOVA) 수행하여 불확실한 차이와 유의미한 차이 평가. P값 0.05 이하 시 연구 그룹 간 유의미한 차이 의미.

결과

스캐폴드 형태

SEM 이미지(그림 1)에서 제작된 스캐폴드 미세하게 방사된 나노섬유 구조 확인. SF와 SF+BMP2 스캐폴드 섬유 평균 직경은 모든 농도에서 100-900 nm 범위로 유사하게 나타났으며, 직경은 전기방사 시간에 의존함[13]. SF 나노섬유는 균일한 반면 BMP2 결합으로 섬유 직경 불균일해짐. 스캐폴드 기공 크기는 제작된 스캐폴드에서 균질하게 나타나며 피브로인 농도와 무관. SF 농도는 기공 크기에 유의미한 영향 없음[11].

제작된 스캐폴드 SEM 마이크로그래프. a SF. b SF+rhBMP2. c 4SF+rhBMP2

스캐폴드 기계적 특성

나노섬유 스캐폴드 응력-변형률 곡선 그림 2에 표시. BMP 첨가가 SF 스캐폴드 기계적 특성을 변화시키지 않으나, 제조 재료(SF) 농도 증가에 따라 매트릭스 인장 특성 향상. 이는 가교 중 섬유 간 결합 형성 때문일 수 있음. 저농도 SF 섬유는 고농도 대비 기계적 강도 낮음.

전기방사 나노섬유 응력-변형률 관계. (a) SF, (b) SF+rhBMP2, (c) 4SF+rhBMP2 스캐폴드 간 비교

부종 연구

스캐폴드 부종 비율 시간 함수 그림 3에 표시. 스캐폴드는 초기에 균일하게 부풀어 약 380분 후 평형 도달. rhBMP2 결합 섬유가 SF 단독 스캐폴드보다 더 많은 물 흡수, BMP2 결합으로 친수성 포켓 증가 시사. SF 섬유 ~70% 평형, BMP2 함유 섬유 ~81% 수분 평형.

제작된 스캐폴드 부종 특성. SF+rhBMP2와 4SF+rhBMP2 수정 후 SF 스캐폴드 부종 특성 변화 관찰

세포 부착 분석

세포 성장과 분화 유도에 스캐폴드 부착 필요. 본 연구에서 hMSC가 스캐폴드에 잘 부착됨 관찰. 4SF-BMP2, SF-BMP2, SF 스캐폴드에 대한 hMSC 부착 그림 4에 표시.

세 점 시간점에 대한 백분율 부착 대 시간 히스토그램. (a) SF, (b) SF+rhBMP2, (c) 4SF+rhBMP2 스캐폴드 부착 수준 변화

혼합 스캐폴드에서 부착 능력 저하 우려가 있었으나 관찰 결과로 배제됨. BMP2 혼합이 스캐폴드 부착 능력 감소시키지 않음. 그림 3에서 기공 크기 증가(SF 농도 감소)에 따라 세포 부착 증가 이해됨. 세 제형 간 ANOVA로 3시간과 6시간 유의미한 차이 구분. 그러나 1시간에는 유의미한 차이 없음.

세포독성 분석 및 세포 증식 분석

rhBMP2 결합 스캐폴드에서 세포 생존율 유의미하게 증가, 제작된 스캐폴드는 대상 세포에 세포독성 효과 없음(그림 4), 세포 모든 스캐폴드에서 비교적 잘 증식(그림 5). 생존율은 일수 증가 추세 보이며, SF+BMP2 스캐폴드가 각 시점에서 최소 독성 보임. ANOVA로 세 제형 세포 생존율 값 유의미한 차이 확인.

네 시점에 대한 세포 생존율 분석 히스토그램. MTT 분석으로 수행, 결과를 대조군 상대 백분율로 제시

그림 6에서 세포 증식 확인. 모든 세 스캐폴드 제조에서 세포 잘 증식, 매 시점 SF+BMP2 최적. SF+BMP2 스캐폴드 큰 기공이 세포 성장에 최대 공간 제공. 그룹 간 차이 유의미성 ANOVA로 확립.

네 시점에서 SF, SF+BMP2, 4SF+BMP2에 대한 알라마 블루 염료 환원 백분율로 세포 증식 표현

ALP 분석

ALP 활성은 세포 주변 환경 골유도 특성 표준 마커[13]. 실험에서 SF+BMP2 구조물이 SF 단독 구조물 대비 더 높은 ALP 활성 보임(그림 7). SF 나노구조 스캐폴드 단독으로도 골유도 가능하나, 그림 7과 ANOVA에서 SF+BMP2 스캐폴드가 최적임 입증. ALP 농도는 실험 시간 경과에 따라 증가하였으며, 더 높은 SF 농도 구조물은 낮은 SF 농도 구조물 대비 낮은 ALP 활성 보임.

세 가지 스캐폴드 제작 전략 간 ALP 활성 표현, 다양한 시점. (a) SF (b) SF+rhBMP2 (c) 4SF+rhBMP2 스캐폴드

체내 ALP 활성

그림 8은 (a) SF, (b) SF+rhBMP2, (c) 4SF+rhBMP2에 대한 설명체 ALP 활성 묘사. 예상대로 rhBMP2 함유 처리 설명체에서 더 높은 ALP 활성 유도, rhBMP2 없는 스캐폴드 처리 쥐에서 낮은 ALP 활성.

치료 후 획득한 설명체 체내 ALP 활성. 누드 마우스 모델로 스캐폴드 골유도 잠재력 체내 입증

논의

스캐폴드 기반 조직 공학은 재생의학에서 잠재력 입증, 체외 공학 세포-스캐폴드 구조물을 골조직으로 변환하는 도구로 인상적 진전 목격[14,15,16].

구조 미세구조와 물리적 특성(기공 크기, 인장 강도 등) 최적 기계적 특성과 생체적합성은 세포 정착과 조직화 잠재적 특징[17]. 제시된 작업은 골조직 공학용 스캐폴드 제작과 특성화를 기술하며, 제안된 재료의 유익한 특성 조합 활용. SF가 적절히 강하고 생체적합한 플랫폼 제공하는 동안 내장 rhBMP2가 새로운 골세포 형성 유도. SF는 골아세포 증식[18]과 인대, 힘줄, 연골, 뼈, 간, 피부, 기관지, 각막, 신경, 고막, 방광 등 조직 재생을 포함한 다양한 제형으로 여러 그룹에서 광범위하게 연구[19,20].

우리는 수용액 SF와 SF+rBMP2를 연구에 사용. 수용액은 유기 용매 대비 SF 용액 제조에 선호됨, 유기 용액에서 SF 분해 불리[18]. 전기방사 SF 섬유는 이전 보고에서 균질 구조와 균일 직경, 상호연결되고 교차 연결된 기공으로 높은 다공성 메쉬 보고, 우리 연구와 근접 일치[21,22]. 우리 스캐폴드와 이전 보고[21] 모두에서 비드 유사 구조 형성 관찰 안됨. 순수 SF 섬유 직경은 블렌드 증가에 따라 감소 보고[11,21]했으나 우리는 혼합으로 직경 손실 관찰 안됨. 그러나 블렌드 섬유에서 균일성 방해됨, rBMP2가 SF 섬유에 불균일 결합 가능성.

충분한 기계적 강도는 조직 스캐폴드 필수 특성. 순수 SF 혼합이 우리 실험에서 나노섬유 유연성 증가시켰으며, 이전 보고도 SF를 다른 재료와 혼합해 기계적 특성 개선 유사 추세 보고[21,23]. 따라서 제작된 스캐폴드는 조직 공학 응용 필수 기계적 강도와 유연성 보유.

조직 공학 스캐폴드는 세포 부착 가능, 세포 증식과 골유도 촉진, 최소 세포독성으로 더 나은 수용성 가져야. SF 스캐폴드 비세포독성 및 세포 증식 활성 이전 보고 입증[21,24], 우리 연구 이전 결과와 근접 일치.

골유도 특성으로 rhBMP2가 여러 그룹에서 골조직 공학에 활용[25,26,27]. 이 연구들에서 BMP2 함유 스캐폴드 배양 세포가 더 높은 ALP 활성 보유, 골유도 바이오마커. BMP2 결합 효과는 배양 시간 진행에 따라 더 잘 대비됨. Kim 등은 BMP2 결합 다공성 미세구체 활용해 유사 골유도 향상 관찰[25].

결론

우리는 rhBMP2 함유 SF 기반 섬유 스캐폴드 성공적 제작. 이 스캐폴드들은 균질하고 적절한 기계적 특성과 생체적합성 보유. 추가 rhBMP2 결합이 제작된 스캐폴드 골유도 잠재력 부여. 스캐폴드 추가 체내 응용 평가 결과 골조직 공학 응용에 적합함 확인.

약어

ALP:

알칼리 포스파타제

BTE:

골조직 공학

hMSCs:

인간 중간엽 줄기세포

rhBMP2:

재조합 인간 골형성단백질-2

SF:

실크 피브로인