뼈 조직 공학에서 골유도성을 향상시키기 위한 Bone Morphogenic Protein-2(rhBMP2)가 장착된 실크 피브로인 스캐폴드

방법

SF/BMP2 수용액 준비

처음에 SF는 누에고치인 Bombyx mori에서 분리되었습니다. , 수용액으로. 확립된 프로토콜을 약간 수정하여 따랐습니다[11]. 고치는 0.02M Na₂ 100mL에 삶았습니다. CO₃ 20분 동안 증류수로 완전히 헹구어 과잉 수용성 세리신과 왁스를 제거합니다. 추출된 피브로인을 9M 브롬화리튬 용액에 60°C에서 4시간 동안 용해시킨 후 4일 동안 물에 대해 추가로 투석하였다. 최종 농도는 건조 후 건조물의 무게를 측정하여 결정했으며 7% w로 밝혀졌습니다. /v . 이 용액은 1L의 25% 폴리에틸렌 글리콜(PEG, 10,000g mol ^-1 )에 대해 투석하여 다른 수준으로 농축한 후 사용되었습니다. ) 실온에서 용액. 희석된 SF 수용액은 증류수로 희석하여 제조하고, 모든 용액은 추가 처리까지 10°C에서 보관하였다. 재조합 인간 뼈 형태형성 단백질-2(rhBMP2)의 동결건조 분말을 PBS(pH 3.8)에 용해시켰다. 단백질 용액을 0.22μm 시린지 필터로 멸균하고 연속 교반하면서 각 피브로인 용액에 수용액으로 첨가하였다. BMP와 피브로인을 연결하기 위해 글루타르알데히드 매개 가교가 사용되었습니다. 요약하면, 10mL 반응 혼합물에 대해 6% 실크 피브로인 및 1% rhBMP2 각각 5mL를 그룹 활성화제로서 200μL 글루타르알데히드 및 ​​40μL, 12N HCl을 사용하여 가교결합시켰다. 이 절차를 통해 (i) rhBMP2가 없는 3% 실크 피브로인(SF), (ii) 0.5% rhBMP2(SF+rhBMP2)가 포함된 3% 실크 피브로인, (iii) rhBMP2가 포함된 12% 실크 피브로인이 준비되었습니다. (ii)에서와 같이 rhBMP2의 0.125%(4SF+rhBMP2). 이 용액은 스캐폴드 제작을 위한 전기방사 절차에 사용되었습니다.

전기방사에 의한 비계 제작

스캐폴드 제작을 위해 각 용액을 5.5kV DC 전원에 연결된 스테인리스 스틸 바늘(25G, ID 0.26mm, Sigma Aldrich)이 있는 5mL 유리 주사기에 로드했습니다. 섬유 준비를 위해 출구 유속은 0.4mL h ^-1 로 유지되었습니다. 주사기 펌프를 사용하여 전기방사된 섬유를 모세관 팁에서 15cm의 간격을 유지한 알루미늄 호일에 수집했습니다. 샘플은 각각 4시간 동안 수집되었습니다.

주사 전자 현미경

제조된 지지체의 형태학적 검사를 위해 Zeiss EVO40SEM을 이용하여 SEM을 수행하였다. 스캔 이미지를 추가로 처리하기 전에 샘플을 금으로 스퍼터 코팅했습니다. 섬유 직경의 결정은 이미지 프레임에 있는 10개의 무작위 섬유 직경을 평균화하여 수행됩니다.

비계의 기계적 특성

Instron 단일 컬럼 탁상용 전기기계 테스터(모델 3345, Instron, Canton, MA)를 사용하여 개발된 스캐폴드의 기계적 특성을 평가하기 위해 압축 실험을 수행했습니다. 더 긴 시간 동안 전기방사하여 얻은 직경 0.2mm의 섬유를 사용하여 25°C 및 50% 습도에서 응력-변형률 곡선에서 인장 강도와 파단 신율을 결정했습니다.

부종 연구

팽윤율 측정을 위해 각 제형을 37℃에서 PBS(pH 7.4)에 용해시켰다. 미리 정해진 시간 간격으로 시료를 채취하고 전자 저울을 사용하여 건조 중량을 측정했습니다. 평형 중량에 도달할 때까지 시험을 계속하였다. 팽윤율은 다음과 같이 표현하였다:

여기서, W _오 =나노섬유 매트릭스의 초기 건조 중량 및 W _s =각 시점에서 팽윤된 나노섬유 매트릭스의 무게.

세포 배양

인간 중간엽 줄기 세포(hMSC)는 제작된 나노 지지체의 골유도 가능성을 평가하기 위해 본 연구에서 사용되었습니다. hMSC는 5% CO2에서 37°C에서 10% 우태아 혈청 및 1% 페니실린이 포함된 DMEM에서 배양 및 유지되었습니다. 90% 합류가 달성될 때까지 가습된 대기. 그런 다음 세포를 트립신 처리하고 원심분리하고 정량을 위해 배지에 재현탁했습니다.

지지체는 에탄올로 세척하고 자외선을 30분간 조사하여 멸균한 후 PBS(pH 7.4)로 세척하였다. DMEM 처리는 세포 파종 전에 스캐폴드에 제공됩니다. 20 μL의 세포 현탁액을 각 스캐폴드와 대조군으로 사용되는 플라스틱 필름에 적가했습니다. 스캐폴드는 가습된 대기(37°C, 5% CO₂ ) 30분 동안 그런 다음, 스캐폴드는 격일로 배지를 정기적으로 보충하면서 21일 동안 DMEM에서 배양되었습니다.

세포 접착 분석

스캐폴드와 세포의 접착력을 평가하기 위해 문헌의 방법에 따라 초기 파종 1, 3, 6시간 후에 약간의 수정을 가하여 접착되지 않은 세포의 수를 세었습니다[6]. 세포 배지를 수집하고 혈구계산기로 세포 계수를 수행하였다. 초기 파종 횟수와 미접착 세포 수의 차이를 접착 세포 수로 간주하였다. 결과는 다음 방정식에 따라 퍼센트 접착력으로 표현되었습니다.

세포독성 분석

나노섬유 매트릭스의 독성 효과를 측정하기 위해 MTT assay를 수행하였다. 각각의 시간 프레임 후, 구축물을 MTT 용액(1 mg mL ^-1 PBS(pH 7.4)에 1:10의 비율로 희석한 스톡 용액) 및 4시간 동안 배양했습니다. 생존 가능한 세포는 이 잠복기 동안 MTT를 포르마잔 염으로 전환합니다. DMSO를 첨가하여 포르마잔 염을 용해시키고 20분 동안 따로 보관하였다. 포르마잔염에서 유래하는 흡광도는 마이크로플레이트 리더를 이용하여 570 nm에서 흡광도 변화를 기록하여 정량적으로 측정하였다.

세포 증식 분석

Alamar blue(AB) 염료 환원 분석을 수행하여 스캐폴드 내 세포의 증식을 결정했습니다. 스캐폴드를 DMEM으로 희석된 염료에서 4시간 동안 인큐베이션하고 염료의 감소를 분광광도계로 측정했습니다. AB 감소율은 다음과 같이 계산되었습니다.

여기서, ελ ₁ =570 nm 및 ελ에서 알라마르 블루의 몰 흡광 계수 ₂ =산화(ε)에서 600 nm에서 알라마르 블루의 몰 흡광 계수 _소 ) 및 감소(ε _빨간색 ) 양식. Aλ ₁ 및 Aλ ₂ 테스트 웰의 흡광도를 나타냅니다.

A'λ ₁ =570 nm에서 음성 대조군 웰의 흡광도.

A'λ ₂ =600 nm에서 음성 대조군 웰의 흡광도.

ALP 분석

스캐폴드 내에서 배양된 hMSC에 의한 알칼리성 인산분해효소(ALP) 생산은 키트의 제조업체 프로토콜에 따라 측정되었습니다[12]. 간단히 말해서, 멸균 PBS(pH 7.4)를 스캐폴드의 세척 및 인큐베이션에 사용한 다음 1mL Tris 완충액(1M, pH 8.0)으로 균질화하고 얼음 위에서 3분 동안 초음파 처리했습니다. 그런 다음 25μL의 용해물을 30°C에서 5분 동안 1mL의 p-니트로페닐 포스페이트 용액(16mM)과 함께 인큐베이션했습니다. 분광광도계 측정은 ALP 존재하에서 p-니트로페놀의 생산을 모니터링하기 위해 405 nm에서 수행되었습니다.

생체내 ALP 활동

무게가 각각 100-120g인 수컷 흉선이 없는 누드 랫트 9마리를 잡고 복근에서 양측으로 절개하여 주머니를 만들었습니다. 누드 마우스 모델을 사용하여 생체 내 스캐폴드의 골유도 가능성을 입증했습니다. 3가지 유형의 스캐폴드(5mm × 5mm) 각각 중 하나를 절단하여 근육 주머니에 별도로 포장했습니다. 그런 다음 파우치를 비흡수성 봉합사로 닫았습니다. 수술 14일 후, 복직근을 절제하여 임플란트를 회수하고 PBS에 보관하였다. 근육 피판을 절제하고, 알칼리성 포스파타제를 방출하기 위해 추출 완충액에서 균질화한 외식편 조직을 얻었다. ALP 활성 측정을 위해 50 μL의 용액 분취액을 사용했습니다.

통계 분석

모든 실험은 삼중으로 수행되었으며, 제시된 데이터는 언급되지 않는 한 샘플의 평균 ± 표준 편차(SD)로 형식이 지정되었습니다. 불확실한 차이와 유의한 차이를 평가하기 위해 통계 소프트웨어 Origin 6.0을 사용하여 일원 분산 분석(ANOVA)을 수행했습니다. 피 0.05 이하의 값은 연구 그룹 간의 유의한 차이를 나타냅니다.

결과

비계의 형태

제작된 스캐폴드의 SEM 이미지(그림 1)는 미세하게 회전된 나노섬유 구조를 나타냈다. SF 및 SF+BMP2 스캐폴드에서 섬유의 평균 직경은 모든 농도에서 100~900nm 범위로 유사한 것으로 보입니다. 나노섬유는 균일한 것으로 밝혀졌고, BMP2 접합은 섬유 직경의 불균일성을 초래하였다. 스캐폴드의 기공 크기는 제작된 스캐폴드에서 균질한 것으로 보이며 피브로인 농도와 무관한 것으로 밝혀졌습니다. SF의 농도는 기공 크기에 큰 영향을 미치지 않습니다[11].

준비된 스캐폴드의 SEM 현미경 사진. 아 SF. ㄴ SF+rhBMP2. ㄷ 4SF+rhBMP2

비계의 기계적 특성

나노섬유 지지체의 응력-변형률 곡선은 그림 2에 나와 있습니다. BMP의 첨가는 SF 지지체의 기계적 특성을 변경하지 않는 것으로 관찰되었지만, 제작 재료(SF)의 농도가 증가함에 따라 매트릭스의 인장 특성이 개선되는 것으로 관찰되었습니다. . 가교 중 섬유간 결합이 형성되기 때문일 수 있습니다. 따라서 낮은 농도의 SF 섬유는 높은 섬유에 비해 더 나은 기계적 강도를 나타내지 않았습니다.

전기방사 나노섬유의 응력-변형률 관계. 스트레스-스트레인 관계는 (a) SF, (b) SF+rhBMP2, (c) 4SF+rhBMP2 스캐폴드 사이에서 비교되었습니다.

부종 연구

스캐폴드에 대한 시간의 함수로서의 팽윤 비율은 그림 3에 나타내었다. 스캐폴드는 초기에 균일하게 시간이 지남에 따라 잘 팽창했고 약 380분 내에 평형에 도달했다. rhBMP2 연결 섬유는 SF 단독 스캐폴드와 비교하여 더 많은 물을 흡수하여 BMP2 결합으로 인한 친수성 포켓의 증가를 시사합니다. SF 섬유는 ~ 70%에서 평형을 이루는 반면 BMP2 함유 섬유는 ~ 81% 물에서 평형을 이룹니다.

제작된 스캐폴드의 팽윤성. SF+rhBMP2 및 4SF+rhBMP2로 변형 후 SF 지지체의 팽창 특성 변화 관찰

세포 접착 분석

스캐폴드에 대한 세포의 부착은 세포의 성장 및 분화 유도에 필요합니다. 이 연구에서 우리는 hMSC가 스캐폴드에 잘 부착되는 것을 관찰하였고, hMSC가 4SF-BMP2, SF-BMP2 및 SF 스캐폴드에 부착되었음을 그림 4에 나타내었다.

3개의 시점에 대한 시간에 대한 접착력 백분율을 나타내는 히스토그램. (a) SF, (b) SF+rhBMP2, (c) 4SF+rhBMP2 지지체의 접착력 변화

관찰된 결과에서 배제된 혼합 지지체의 접착력 손실 우려가 있었다. BMP2와의 혼합은 스캐폴드의 접착력을 감소시키지 않습니다. Fig. 3에서 알 수 있는 바와 같이 pore size가 증가함에 따라(SF 농도 감소) scaffold에 대한 세포의 부착력이 증가함을 잘 알 수 있었다. 세 가지 공식 중 ANOVA는 3시간과 6시간의 변화를 크게 구별합니다. 그러나 1시간째에는 유의한 차이가 관찰되지 않았다.

세포독성 분석 및 세포 증식 분석

rhBMP2가 결합된 스캐폴드에서 세포 생존율이 유의하게 증가하였고, 구축된 스캐폴드는 해당 게스트 세포에 어떠한 세포독성 효과도 일으키지 않았으며(그림 4), 모든 스캐폴드에서 비교적 세포가 잘 증식하였다(그림 5). 일수에 따라 생존력이 증가하는 경향을 보였고, SF+BMP2 스캐폴드는 각 시점에서 가장 적은 독성을 나타냈다. ANOVA는 우려되는 세 가지 제형의 세포 생존율 값 사이에 상당한 차이를 나타냈습니다.

4개의 시점에 대한 히스토그램으로 표시되는 세포 생존력 분석. 세포 생존율 분석은 MTT 분석으로 수행되었으며 결과는 대조군에 대한 백분율로 표시됩니다.

도 6에서 세포 증식을 조사할 수 있다. 세포는 각 시점마다 SF+BMP2에서 최고로 3가지 스캐폴드 준비 모두에서 잘 증식했습니다. SF + BMP2 스캐폴드의 더 큰 기공은 세포 성장을 위한 최대 공간을 제공했습니다. 그룹 간의 차이의 중요성은 ANOVA에서 잘 확립되었습니다.

SF, SF+BMP2 및 4SF+BMP2에 대한 4가지 시점에서 alamar blue 염료 감소의 백분율로 표시한 세포 증식

ALP 분석

ALP 활성은 세포 주변 환경의 골유도 특성의 표준 마커입니다[13]. 우리의 실험에서 우리는 SF 단독 구성체와 비교하여 SF+BMP2 구성체에서 더 높은 ALP 활성을 관찰했습니다(그림 7). SF 나노구조 스캐폴드는 단독으로도 골유도를 나타낼 수 있었지만, 그림 7과 ANOVA에서 알 수 있듯이, SF+BMP2 스캐폴드는 해당 스캐폴드 중에서 가장 좋은 것으로 판명되었습니다. ALP 농도는 실험 시간이 경과함에 따라 증가하였고, SF 농도가 높은 구조물은 SF 농도가 낮은 구조물에 비해 낮은 ALP 활성을 나타냈다.

서로 다른 시점에서 세 가지 다른 스캐폴드 제작 전략 간의 ALP 활동 표현. (a) SF (b) SF+rhBMP2 (c) 4SF+rhBMP2 스캐폴드

생체내 ALP 활동

도 8은 (a) SF, (b) SF+rhBMP2, 및 (c) 4SF+rhBMP2에 대한 외식편의 ALP 활성을 도시한다. 예상대로, rhBMP2를 함유한 처리의 외식편은 더 높은 ALP 활성을 유도한 반면 rhBMP2가 없는 스캐폴드 처리된 마우스는 더 낮은 ALP 활성을 생성했습니다.

처리 후 얻은 외식편의 생체 내 ALP 활성. 누드 마우스 모델은 생체 내 스캐폴드의 골유도 가능성을 입증하기 위해 활용되었습니다.