디페닐-N-(트리클로로아세틸)-아미도포스페이트 디페닐-N-(트리클로로아세틸)-아미도포스페이트에 대한 C60 풀러렌 효과, 인실리코 DNA와의 상호작용 및 체외 인간 백혈병 세포주에 대한 세포독성 활성

초록

카르바실아미도포스페이트의 새로운 대표자인 디페닐-N-(트리클로로아세틸)-아미도포스페이트(HL)는 인산기 근처에 2개의 페녹시 치환체를 포함하고 있으며, 원소 분석과 IR 및 NMR 분광법으로 확인하고 세포독성제 자체로 테스트했습니다. C₆₀과의 조합 풀러렌.

분자 시뮬레이션 결과에 따르면 C₆₀ 풀러렌과 HL은 DNA와 상호작용하고 HL 페닐 그룹과 C₆₀의 상호작용을 쌓아 안정화된 단단한 복합체를 형성할 수 있습니다. 풀러렌 및 DNA G 뉴클레오티드 뿐만 아니라 HL CCl₃의 상호작용에 의해 C₆₀의 이온-π 결합으로 그룹화 분자 및 DNA G 뉴클레오티드와의 정전기 결합에 의해.

MTT 테스트를 사용하여 IC₅₀의 인간 백혈병 CCRF-CM 세포에 대한 HL의 세포독성 활성 세포 처리 72시간에서 10μM 농도에서 검출된 값이 표시되었습니다. 16μM C₆₀의 결합된 작업에서 풀러렌 및 HL, IC₅₀ 값 낮은 5μM HL 농도에서 검출되었고 더 이른 48시간 배양 기간에 HL의 세포독성 효과가 낮은 2.5μM 농도에서 관찰되었으며 HL 자체는 세포 생존에 영향을 미치지 않습니다. C₆₀ 바인딩 풀러렌 및 HL은 안정한 복합체를 형성하면서 작은 DNA 홈을 갖는 것이 CCRF-CЕM 세포 증식의 상승적 억제의 가능한 이유 중 하나로 가정됩니다.

C₆₀ 적용 풀러렌과 2.5μM HL의 조합은 혈액 적혈구막의 구조적 안정성에 해로운 영향을 미치지 않는 것으로 나타났습니다. 따라서 C₆₀의 결합된 동작 낮은 농도의 풀러렌과 HL은 인간 백혈병 세포에 대한 HL 세포독성 효과를 강화했으며 용혈 효과가 뒤따르지 않았습니다.

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배경

탄소나노구조의 대표자 C₆₀ 풀러렌은 항산화제 또는 광감작제로서 뿐만 아니라 항암제의 독성 효과의 조절제로서도 고유한 물리화학적 특성 및 생물학적 활성을 갖는 것으로 나타났으며, 이는 세포 내부로 침투하여 약물 운반체로서의 기능을 하기 때문이다[1,2,3,4 ]. C₆₀ 분자는 doxorubicin, cisplatin, paclitaxel과 같은 화학 요법 약물과 상호 작용할 수 있으며 치료 효과를 향상시키는 복합체를 형성할 수 있습니다[5,6,7,8].

카바실아미도포스페이트(CAPh)는 독특한 구조, 생물학적 활성 및 생물의학 적용 관점으로 인해 주목을 받은 유기 분자입니다[9,10,11,12]. 분자의 단편 C(O)N(H)P(O)에서 함께 결합된 펩티드 및 포스포아미드 그룹의 존재는 생물학적 분자 및 세포막과의 상호작용을 결정합니다. 인산기 및 카르보닐기 근처의 치환기의 변화는 CAPh 입체화학적 및 약리학적 특성을 조절할 수 있는 가능성을 제공합니다. 특히, 다양한 CAPh 대표자가 항종양 활성을 갖는 것으로 나타났습니다[13, 14].

최근 우리는 CAPh의 대표적인 디메틸-N-(벤조일)-아미도포스페이트를 밀리몰 농도 범위에서 사용하여 백혈병 L1210 세포의 생존력을 감소시키고 독성 효과가 C₆₀에 의해 촉진됨을 확인했습니다. 풀러렌 [15]. 우리는 또한 추가적인 방향족 치환체와 음전기 CCl₃의 도입을 보여주었습니다. CAPh 구조로 그룹화하면 독성이 향상됩니다[16]. 따라서 디모폴리도-N-트리클로로아세틸포스포르아미드의 유의한 독성 효과는 기원이 다른 인간 백혈병 세포에 대해 나타났으나 유효 농도는 여전히 높았고 C₆₀과의 병용 작용 후에도 독성이 증가하지 않았습니다. 풀러렌이 관찰되었다. 이러한 조사를 계속하면서 우리는 포스포릴 그룹 근처에 모르폴리도 그룹 대신 두 개의 페녹시 치환체가 있는 CAPh 디페닐-N-(트리클로로아세틸)-아미도포스페이트(HL)의 새로운 대표자를 합성했습니다(그림 1).

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디페닐-N-(트리클로로아세틸)-아미도포스페이트(HL)의 구조

연구의 목적은 디페닐-N-(트리클로로아세틸)-아미도포스페이트(HL) 단독 또는 C₆₀과의 조합의 생물학적 활성을 추정하는 것이었습니다. 풀러렌은 DNA와의 상호 작용에 대한 실리코 분석을 사용하고 인간 백혈병 세포주에 대한 세포 독성 효과에 대한 시험관 내 연구를 사용합니다.

방법/실험

화학물질

RPMI 1640 액체 배지, 소 태아 혈청(FBS), 페니실린/스트렙토마이신 및 L-글루타민(Biochrom, 독일), 디메틸설폭사이드(DMSO)(Carl Roth GmbH+Co, 독일), MTT[3-(4,5-디메틸티아졸- 2-일)-2,5-디페닐 테트라졸륨 브로마이드](Sigma-Aldrich Co, Ltd., USA), HCl(Kharkivreachim, 우크라이나).

화합물의 특성

용해도를 높이기 위해 다음 반응에 따라 디페닐-N-(트리클로로아세틸)-아미도포스페이트(HL)의 나트륨염을 얻었다(그림 2).

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나트륨 염에서 디페닐-N-(트리클로로아세틸)-아미도포스페이트(HL)의 용해도

200ml의 클로로포름에 녹인 트리클로로포스파조트리클로로아세틸 용액(0.035M)을 150ml의 클로로포름에 녹인 페놀산나트륨 현탁액(0.106M, 12.3g)에 천천히 첨가했습니다(그림 2, 1단계). 혼합물 온도는 40–50°C 이상으로 올라가지 않아야 합니다. 약 1시간 동안 교반을 계속한 다음, 용액을 70°C까지 가열하고 이러한 조건에서 20분 동안 교반하였다. 생성된 생성물 트리페녹시포스파조트리클로로아세틸을 증발시켰다. 그런 다음, 40ml의 1M NaOH를 첨가하고 90분 동안 환류했습니다(그림 2, 2단계). 생성된 혼합물을 증발시켰다. 나트륨 HL의 고체 침전물을 디에틸 에테르로 3회 세척하고 i에서 재결정화했습니다. - 백색 결정성 분말로서의 프로판올(수율 80%). NaL·3H₂의 무색 결정 X선 분석에 적합한 O는 i에 의해 획득되었습니다. -PrOH:H₂ O(9:1 v /v ) 용액은 천천히 증발합니다. 이 화합물은 공기에 안정하고 물과 알코올에 잘 용해됩니다. MP 215 °С.

HL은 원소 분석과 IR 및 NMR 분광법으로 확인했습니다. EL III Universal CHNOS 원소 분석기를 사용하여 원소 분석(C, H, N)을 수행했습니다. IR 스펙트럼 측정은 2cm^{− 1} 해상도의 Perkin-Elmer Spectrum BX FT-IR 분광계에서 KBr 펠릿으로 샘플에 대해 수행되었습니다. 스펙트럼 범위 4000–400cm^{− 1} 에서 무작위 흡수 인공물을 평균화하기 위해 결합된 8개의 스캔 누적 . ¹ DMSO-d6 용액의 H NMR 스펙트럼은 실온에서 AVANCE 400Bruker NMR 분광계로 기록되었습니다.

HL:IR(cm⁻¹ ):1639 vs, sh(vCO); 1353 s, sh(아미드 II); 1194 s, sh(vPO); 941 s, sh(νPN).

¹ H NMR(DMSO-d₆ ):7.05(t, 2H, γ-CH₂ ); 7.205, 7.255(dt, 8H, α- 및 β-CH₂ ).

CCl₃의 경우 C(O)N(Na)P(O)(OC₆ H₅ )₂ 원소 조성이 결정됨, %:C 40.58, H 2.35, N 3.15; 및 계산, %:C 40.37, H 2.42, N 3.36.

C₆₀의 합성 및 특성화 풀러렌

C₆₀의 매우 안정적인 콜로이드 수용액 풀러렌(200μM, 순도> 99.5%, 나노입자 평균 크기 최대 50nm)은 [17, 18]에 설명된 대로 Ilmenau 기술 대학(독일)에서 합성되었습니다.

셀 문화

실험은 인간 급성 T 세포 백혈병 CCRF-CM 세포주에서 수행되었습니다. 세포주는 라이프니츠 연구소 DSMZ-독일 미생물 및 세포 배양 컬렉션:CCRF-CM(ACC 240)에서 구입했습니다. 세포는 25cm² 를 사용하여 10% FBS, 1% 페니실린/스트렙토마이신 및 2mM 글루타민이 보충된 RPMI 1640 배지에서 배양되었습니다. 5% CO₂가 포함된 37°C의 플라스크 가습 인큐베이터에서.

RPMI 1640 배지의 세포는 C₆₀과 함께 배양되었습니다. 풀러렌(16μM) 또는 HL(2.5, 5, 10μM)을 24, 48, 72시간 동안 별도로 또는 함께 사용합니다. HL 또는 C를 추가하지 않은 세포 생존₆₀ 풀러렌은 100%로 수신되었습니다(대조군 샘플에는 0.05M DMSO가 포함됨).

세포 생존율(MTT) 분석

세포 생존력은 MTT[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide] 환원 분석에 의해 평가되었습니다[19]. 표시된 배양 시점에서 100μl 분취량(0,5 × 10⁴ 세포)를 96웰 마이크로플레이트 Sarstedt(Nümbrecht, Germany)에 넣고 MTT 용액(PBS 중 5mg/ml) 10μl를 각 웰에 첨가하고 플레이트를 37°C에서 추가로 2시간 동안 인큐베이션했습니다. 그런 다음 배양 배지를 DMSO 100μl로 교체했습니다. 디포르마잔 형성은 마이크로플레이트 판독기 Tecan Infinite M200 Pro(Männedorf, Switzerland)를 사용하여 570nm에서 흡수를 측정하여 결정했습니다.

동물

연구는 체중 170 ± 5 g인 "Wistar" 계통의 백인 수컷 쥐를 대상으로 수행되었습니다. 동물은 키예프의 타라스 셰브첸코 국립 대학교(Taras Shevchenko National University of Kyiv) ESC "생물학 및 의학 연구소"의 사육장에서 표준 조건하에 보관되었습니다. 동물들은 음식과 물에 자유롭게 접근할 수 있었습니다. 모든 실험은 위에 언급된 기관의 생명 윤리 위원회의 통제 하에 척추 동물 보호를 위한 유럽 협약의 국제 원칙에 따라 수행되었습니다.

적혈구 용혈 추정

"Wistar" 계통 쥐의 헤파린 처리된 혈액에서 적혈구를 얻었고 0.85% NaCl 용액에서 0.700 o.u로 희석했습니다. Scinco 분광광도계(독일)에서 630nm에서 적혈구 용혈은 0.001N HCl로 인해 발생했습니다. 용혈의 동역학은 분광광도계로 측정되었습니다(λ =630nm) 2분 동안 10초마다 용혈된 적혈구의 백분율은 [20]에 제시된 대로 계산되었습니다. 적혈구는 C₆₀가 포함된 0.85% NaCl 용액에서 배양되었습니다. 풀러렌(16μM) 또는 HL(2.5 및 10μM)을 별도로 1시간 동안 함께 사용합니다. HL 또는 C가 첨가되지 않은 적혈구₆₀ 풀러렌은 100%로 수신되었습니다(대조군 샘플에는 0.05M DMSO가 포함됨).

인 실리코 연구

이중 나선 DNA 분자는 PDB(Protein Data Bank) 기반의 템플릿으로 사용되었습니다. DNA 분자와 HL의 상호작용은 별도로 그리고 C₆₀과 함께 사용됩니다. 풀러렌이 연구되었습니다. 우리는 DNA 분자의 다음 구조를 고려했습니다:2MIW(CCATCGCTACC - DNA 나선의 작은 홈으로 화합물 삽입), 1XRW(CCTCGTCC - DNA 나선의 작은 홈으로 화합물 삽입), 2M2C(GCGCATGCTACGCG - 결합 DNA 나선의 크고 작은 홈이 있는 화합물). 우리는 QXP 패키지에 내장된 체계적 도킹(SDOCK+) 알고리즘을 적용했습니다. 우리는 DNA로 잠재적으로 가능한 300개의 복합체를 생성했으며, 그 중 가장 좋은 10개는 QXP 패키지에 내장된 스코어링 기능을 사용하여 다음 단계를 위해 선택되었습니다[22].

DNA 분자와 HL의 상호작용은 별도로 그리고 C₆₀과 함께 사용됩니다. 풀러렌은 (1) 수소 결합의 수, (2) DNA와 해당 구조의 접촉 표면 면적, (3) DNA와 도킹된 구조 사이의 거리, (4) 총 에너지 바인딩 구조의.

C₆₀과의 화합물 복합체의 안정성 평가 풀러렌, 우리는 OPLS-AA 힘장[26, 27]을 기반으로 하는 Nosé-Poincaré-Anderson 알고리즘(NPA)[24, 25]에 따라 Gromacs 소프트웨어 도구[23]를 사용하여 짧은 분자 역학(MD, 100ps)을 수행했습니다. .

계산은 다음 매개변수에 대해 수행되었습니다. 온도(켈빈 단위) - 300; 압력(킬로파스칼) - 100; 수소 원자 또는 리간드를 포함하는 결합은 알고리즘에 의해 제한되었습니다[25].

통계 분석

데이터는 4개 이상의 독립적인 실험의 평균 ± SD로 표시되었습니다. 평균(M)과 표준편차(SD)는 각 그룹에 대해 계산되었습니다. 이원 ANOVA를 사용한 후 Bonferroni 후 테스트를 사용하여 통계 분석을 수행했습니다. p 값 <0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다. 데이터 처리 및 플로팅은 특수 애플리케이션 GraphPad Prism 7(GraphPad Software Inc., USA)을 사용하여 IBM PC에서 수행되었습니다.

결과 및 토론

인 실리코 연구

HL과 DNA의 상호작용

HL은 AGC-GCTA 뉴클레오티드를 통해 작은 DNA 홈에 결합될 때 DNA에 삽입되어 안정적인 복합체를 형성할 수 있는 것으로 나타났습니다(그림 3a). 이 경우 A 뉴클레오티드의 질소 염기와 HL 페닐기 사이의 적층 상호작용 뿐만 아니라 CCl₃ 사이의 정전기적 상호작용 그룹 및 C 뉴클레오티드가 형성되었습니다. MD 시뮬레이션 후 DNA 이중 나선 및 HL의 RMSD 값은 각각 3.3 및 1.62Å인 것으로 나타났습니다. HL(GCA-CTA)의 뉴클레오타이드 환경이 부분적으로 변화되어 적층 상호작용이 상실되었으며, HL의 G 뉴클레오타이드와 CO 그룹 사이에 수소 결합이 형성되었다.

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디페닐-N-(트리클로로아세틸)-아미도포스페이트(HL)와 DNA 분자의 상호작용:a , b 마이너 및 메이저 홈으로 바인딩; ㄷ 작은 홈에 삽입. PDB 데이터베이스에서 사용된 DNA 구조:a , b —2M2C 및 c —1XRW

주요 DNA 홈과 HL의 결합은 TCG-AT 뉴클레오티드를 통해 발생했습니다(그림 3b). 이 경우 HL의 CO 그룹과 A 뉴클레오티드의 질소 염기 사이에 수소 결합이 형성되고 HL 페닐과 C 및 G 뉴클레오티드의 질소 염기 사이에 적층 상호 작용이 발생했습니다. 게다가, HL CCl₃ 사이의 정전기 결합의 확률 AT 뉴클레오티드의 그룹 및 질소 염기가 나타났습니다.

MD 시뮬레이션 후 HL의 뉴클레오티드 환경에는 변화가 감지되지 않았습니다. DNA와 HL의 RMSD 값은 각각 2.77과 1.58Å이었습니다. 그로 인해 C nucleotide와 phenyl group 사이의 stacking 상호작용이 사라졌다.

HL이 DNA에 삽입된 경우 환경은 CG-CG 뉴클레오티드로 구성되었습니다(그림 3c). CG 뉴클레오타이드와의 스태킹 상호작용이 나타났습니다. 하나의 페닐 그룹은 질소 염기 사이에 고정되었고 다른 하나는 C 뉴클레오타이드와 스태킹 상호작용을 형성했습니다.

MD 시뮬레이션 후 DNA 이중 나선과 HL의 RMSD 값은 각각 1.71과 1.89Å였습니다. HL의 뉴클레오티드 환경은 변경되지 않았습니다. 페닐 그룹 중 하나는 G 뉴클레오티드의 질소 염기와 이온-π 상호작용을 형성했으며, 이는 1.12Å 이동한 것으로 보입니다.

획득한 에너지 매개변수는 HL 자체 내에서 뿐만 아니라 DNA와 HL 사이의 입체 충돌 에너지가 미미하다고 증언했습니다(표 1).

우리는 마이너 및 메이저 DNA 그루브 또는 마이너 DNA 그루브에 삽입된 HL 결합의 에너지 매개변수에 대한 비교 분석을 수행했습니다. 범프 값은 HL이 DNA에 삽입된 경우 6.2kJ/mol, 마이너 및 메이저 DNA 홈과 결합하는 경우 2.5kJ/mol인 것으로 나타났습니다(표 1). Int 값은 HL이 DNA에 삽입된 경우 8.7 kJ/mol, 주요 DNA 홈과 결합한 경우 6.3 kJ/mol, 작은 DNA 홈과 결합한 경우 3.6 kJ/mol이었습니다. 이 데이터는 DNA의 작은 홈과의 HL 결합이 가장 안정적임을 보여주었습니다.

HL과 C의 결합된 상호 작용₆₀ DNA가 있는 풀러렌

이전에 컴퓨터 시뮬레이션을 사용하여 C₆₀ 분자는 DNA와 상호작용하여 안정적인 C₆₀을 형성할 수 있습니다. +DNA 작은 홈과 결합할 때 DNA 복합체 [15]. 그림 4와 같이 C₆₀ 풀러렌은 또한 CCl₃과 이온-π 결합을 형성할 수 있습니다. HL 분자 그룹.

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디페닐-N-(트리클로로아세틸)-아미도포스페이트(HL)와 C_{60의 결합된 상호작용 DNA가 있는 풀러렌(HL+C₆₀ 또는 C₆₀ +HL 버전):a , b 작은 홈과 큰 홈으로 바인딩, c , d 작은 홈과 큰 홈에 삽입합니다. PDB 데이터베이스의 사용된 DNA 구조:a , b —2M2C, c —1XRW 및 d —2MIW}

우리는 HL의 분자 모델링의 두 가지 버전인 C₆₀을 사용했습니다. 풀러렌과 DNA 상호작용은 [16]에서 제안되었고 MD 시뮬레이션 결과의 해석에 유용한 것으로 입증되었습니다. 우리는 버전에서 DNA 분자의 1XRW PDB 구조를 사용했습니다. 처음에는 HL이고 그 다음에는 C₆₀입니다. 분자가 DNA에 삽입됨(HL+C₆₀ ) 및 DNA 분자의 2MIW PDB 구조 - 버전에서 초기 C₆₀일 때 분자와 HL은 DNA에 삽입됩니다(C₆₀ +HL).

HL+C₆₀의 경우 마이너 DNA 홈으로 결합 버전은 GCTA-GCAT 뉴클레오티드를 통해 발생했습니다(그림 4a). 페닐 그룹은 작은 홈을 채우고 스태킹 상호작용에 들어갔다:C₆₀을 갖는 그룹 풀러렌과 G 뉴클레오티드의 질소 염기를 가진 다른 것. 정전기 상호작용이 CCl₃ 사이에 발생했습니다. HL 그룹 및 G 뉴클레오티드 및 C₆₀의 질소 염기 둘 다 풀러렌.

MD 시뮬레이션 결과, 이 경우 DNA 이중 나선은 상당한 이동성을 특징으로 했으며(RMSD 값은 3.08 Å), HL에 대한 RMSD 값은 2.04 Å인 반면 C₆₀ 풀러렌은 거의 움직이지 않았습니다. 결과적으로 HL+C₆₀의 뉴클레오티드 환경은 구조가 TGC-GCATG에 의해 변경되었습니다. 또한, HL의 아미노기와 DNA 사이의 수소 결합과 질소성 GC 염기의 뉴클레오티드와 C₆₀ 사이의 적층 상호작용 풀러렌이 나타났습니다.

HL+C₆₀ 바인딩 주요 DNA 홈이 있는 C-ATCC 뉴클레오티드를 통해 발생했습니다(그림 4b). HL CO 그룹과 A 뉴클레오티드의 질소 염기 사이에 수소 결합이 형성되었습니다. 페닐 그룹은 주요 DNA 홈을 채우고 C₆₀과 스태킹 상호작용에 들어갔습니다. 풀러렌.

MD 시뮬레이션 결과에 따르면 HL+C₆₀의 염기 환경은 구조는 변경되지 않음:DNA 및 HL에 대한 RMSD 값은 각각 3.14 및 2.24Å, C₆₀ 풀러렌은 거의 움직이지 않았습니다. 이 경우 HL과 C₆₀ 사이의 모든 상호 작용 풀러렌은 사라지고 HL은 DNA와 입체적으로만 상호작용했다. 결과적으로 C₆₀ 풀러렌과 HL은 주요 DNA 홈에서 밀려납니다.

HL+C₆₀일 때 작은 DNA 홈에 삽입되면(그림 4c), CGT-GAG 뉴클레오티드와의 결합이 발생했습니다. C₆₀ 풀러렌은 작은 DNA 홈에 내장되어 입체적으로 상호 작용합니다. HL 페닐 그룹은 CG-CG 뉴클레오타이드의 질소 염기와 스태킹 상호작용을 형성했습니다. MD 시뮬레이션에 따르면 DNA 및 HL에 대한 RMSD 값은 각각 2.29 및 2.13Å, C₆₀ 풀러렌은 거의 움직이지 않았고 CC1₃ HL 그룹은 G 뉴클레오티드의 질소 염기와 정전기적 상호작용을 시작했습니다.

C₆₀의 경우 +HL 버전, 작은 DNA 홈과의 결합(그림 4d)은 CGC-GCC 뉴클레오티드를 통해 발생했습니다. HL 페닐 그룹 중 하나는 C₆₀과 함께 스택킹을 형성했습니다. 풀러렌 및 다른 G 뉴클레오티드. CC1₃ HL 그룹은 C 뉴클레오티드의 질소 염기와 정전기적 결합을 형성하는 것으로 나타났습니다. MD 분석에 따르면 이 경우 DNA와 HL의 RMSD 값은 각각 2.35와 2.75 Å, C₆₀ 풀러렌은 움직이지 않고 C₆₀의 뉴클레오티드 환경 +HL 구조는 CGCT-GC에 의해 변경되었습니다. 또한 C₆₀ 분자는 DNA 깊숙이 침투하여 C 뉴클레오티드의 질소 염기와 적층 상호작용을 형성했습니다.

계산된 에너지 매개변수에 따르면 C₆₀의 경우에 형성된 복합체 작은 DNA 홈으로의 +HL 삽입이 가장 단단했습니다(범프 값 20.0kJ/mol)(표 1). 대조적으로 HL+C₆₀의 경우 HL+C₆₀일 때 이 매개변수는 6.2kJ/mol에 불과했습니다. 마이너 DNA 홈에 삽입되었고, 마이너 DNA 홈과 결합된 경우 7.8kJ/mol, 주요 DNA 홈과 결합된 경우 8.8kJ/mol로 삽입되었습니다. 게다가, 에너지 매개변수는 HL+C₆₀ 내부에서 강한 수소 결합의 형성이 +DNA 복합체는 Hbnd의 값이 - 2.3kJ/mol일 때 DNA의 주요 홈과 결합하는 경우에만 가능하고, 다른 유형의 상호작용에서는 0 또는 - 1.0kJ/mol과 같습니다(표 1). 또한 이 경우 MD 결과에 따르면 C₆₀ 풀러렌과 HL은 주요 DNA 홈에서 옮겨진 것으로 보입니다.

따라서 C₆₀ 작은 DNA 홈을 가진 +HL 결합은 C₆₀의 가장 가능성 있는 버전으로 제안됩니다. 풀러렌, HL 및 DNA 결합 상호 작용

HL 생물학적 효과의 체외 연구

CCRF-CЕM 세포 생존력

시험관 내 실험에서 2.5~10μM 범위의 디페닐-N(트리클로로아세틸)-아미도포스페이트(HL)가 인간 백혈병 CCRF-CЕM 세포의 생존력에 미치는 장기적인 영향이 MTT 테스트로 추정되었습니다. 세포는 16μM C₆₀가 포함된 RPMI 1640 배지에서 24시간, 48시간 및 72시간 동안 배양되었습니다. 풀러렌 또는 HL 단독 또는 이들의 조합. C₆₀ 없이 배양된 세포의 생존력 또는 HL은 100%로 간주되었습니다.

배양 24시간에서 CCRF-CЕM 세포 생존율에 대한 HL의 영향은 관찰되지 않았습니다(그림 5). 여전히 더 장기간 배양하면 5 및 10μM 농도에서 HL의 세포독성 활성이 분명해졌으며 48시간에서 세포 생존율은 각각 25% 및 33% 억제되었으며 72시간에서는 계속 감소했습니다.

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다양한 농도의 디페닐-N-(트리클로로아세틸)-아미도포스페이트(HL)와 함께 배양된 CCRF-CEM 세포의 생존력. (M ± m, n =8); *p <0.05 대조군과 비교

CCRF-CЕM 세포 생존율의 50% 감소(IC₅₀ )은 10μM 농도에서 HL의 작용하에 72시간에 검출되었습니다(그림 5). 최근에 우리는 또 다른 CAPh의 대표적인 dimorfolido-N-trichloracetylphosphorylamid가 농도 1mM에서 72시간에 CCRF-CЕM 세포 생존율을 50% 감소시키는 것으로 나타났습니다[16]. 이러한 데이터의 비교 분석은 CAPh 유도체의 구조에 모르폴리도 그룹 대신 페녹시를 도입하면 백혈병 세포에 대한 효과적인 독성 농도가 2차 감소할 수 있음을 보여줍니다. -P(O)(OC₆ 의 구조적 유연성이 있다고 가정합니다. H₅ ) 코어는 이 화합물과 DNA의 보다 효과적인 상호 작용을 보장합니다.

C₆₀의 영향 없음 배양 기간 동안 세포 생존율에 단독으로 사용된 풀러렌이 검출되었습니다(데이터는 제시되지 않음). 동시에 그림 6에 표시된 결과는 C₆₀ 풀러렌은 CCRF-CЕM 세포에 대한 HL 세포독성 활성을 강화했습니다. C₆₀의 결합된 작업에 따라 풀러렌 및 HL의 경우, HL 단독 작용보다 낮은 HL 농도(5μM)와 더 이른 배양 기간(48시간)에서 세포 생존율의 50% 감소가 관찰되었습니다. 게다가 72시간에 C₆₀의 합동 행동 풀러렌 및 HL의 경우 HL 자체가 세포 생존율에 영향을 미치지 않는 2.5μM의 낮은 농도에서 HL의 세포독성 효과가 검출되었습니다(그림 6).

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디페닐-N-(트리클로로아세틸)-아미도포스페이트(HL) 단독 또는 16μM C₆₀와 함께 배양된 CCRF-CEM 세포의 생존력 풀러렌. (M ± m, n =8); *p 대조군 세포와 비교하여 <0.05; ^# 피 <0.05 HL과 비교

따라서 C₆₀ 풀러렌은 HL의 세포독성 효과를 강화하고 저농도에서 백혈병 세포의 작용에 대한 민감도를 상당히 증가시키는 것으로 나타났습니다. C₆₀ 풀러렌은 24시간에 걸쳐 백혈병 세포 내부에 축적될 수 있고[28] 세포 내 구획[29,30,31], 특히 핵에 국한될 수 있습니다[32, 33]. 활발하게 증식하는 암세포의 핵 DNA와의 상호 작용은 제외됩니다.

따라서 in vitro에서 얻은 데이터는 in silico 연구 결과와 일치하며 C₆₀의 초기 결합을 보여줍니다. 분자 및 안정한 복합체의 형성과 함께 작은 DNA 홈을 갖는 HL의 CCRF-CЕM 세포 증식의 상승적 억제의 가능한 이유 중 하나가 될 수 있습니다.

용혈에 대한 적혈구 내성

HL 및 C₆₀의 항암 잠재력 추정 풀러렌 조합의 경우 비악성 세포, 특히 혈액 세포에 대한 가능한 영향을 고려하는 것이 중요합니다.

산성 용혈에 대한 적혈구 내성에 대한 연구는 막 수준에서 약리학적 제제의 영향을 설명할 수 있습니다. 용혈의 역학은 적혈구 원형질막 파괴의 역학과 구조적 조직의 안정성을 반영합니다. 그림 7에서 용혈 적혈구 비율의 의존성은 첨가 없이(대조군) HL 또는 C₆₀와 함께 NaCl 용액에서 1시간 동안 배양되었습니다. 풀러렌 단독 또는 조합. 16μM C₆₀의 영향 없음 적혈구 용혈에서 풀러렌이 검출되었습니다(표시되지 않음). 2.5μM 농도의 HL 단독 또는 C₆₀과 조합 용혈에 대한 영향을 받는 적혈구 내성(그림 7). 한편, 10μM 농도에서 HL의 작용하에 최대 20초의 용혈 가속이 감지되었습니다. 10μM HL과 C₆₀의 결합된 작업 풀러렌은 20초에 60%의 용혈된 적혈구로 추가 용혈 강화로 이어졌습니다.

<그림>

디페닐-N-(트리클로로아세틸)-아미도포스페이트(HL)가 별도로 존재하고 16μM C₆₀와 조합된 경우의 용혈에 대한 적혈구 내성 풀러렌. (M ± m, n =8)

얻은 데이터는 C₆₀ 2.5μM HL과 결합된 풀러렌은 혈액 적혈구막의 구조적 안정성에 해로운 영향을 미치지 않았으며 동시에 백혈병 세포에 대해 이 낮은 농도에서 HL의 세포독성 활성을 상당히 증가시킬 수 있었습니다. C₆₀의 시너지 효과에도 불구하고 플러렌과 HL을 10μM 농도로 백혈병 세포에 투여했을 때, 용혈 효과의 강화로 인해 이들 조합의 적용이 제한되는 것으로 나타났습니다.

마지막으로, 위의 시험관 내 연구의 맥락에서 물/고체 계면은 수송, 나노구조의 열역학적 특성[34, 35] 및 세포막과의 상호작용 모두에 영향을 미칠 수 있는 제한된 물을 가지고 있음을 강조하는 것이 중요합니다. [36].

카르바실아미도포스페이트 유도체의 세포내 국소화, 특히 포스포라미데이트의 세포 내 침투에 대한 문헌 데이터가 있습니다. 따라서, 포스포라미데이트 유도체는 MDA-231 유방암 및 폐암(H460, H383, 및 H2009) 세포주의 막을 관통할 수 있다[37]. 니트로벤질 포스포아미드 머스타드는 세포막을 가로질러 침투하고 NTR⁺ 의 미토콘드리아에 국한되는 것으로 나타났습니다. 포유동물 세포[10]. C₆₀ 핵과 미토콘드리아에 축적되어 수동 확산 또는 세포내이입[28, 30, 32][30, 32, 33]으로 인해 암세포의 막을 관통할 수 있는 풀러렌은 작은 항종양 분자의 수송체가 될 수 있습니다[ 38,39,40].

결론

포스포릴기 디페닐-N-(트리클로로아세틸)-아미도포스페이트(HL) 근처에 2개의 페녹시 치환기를 갖는 카르바실아미도포스페이트 유도체의 새로운 대표가 합성되고 세포독성제 자체로서 그리고 C60과 조합하여 시험되었다. 풀러렌. 분자 시뮬레이션 결과에 따르면 C₆₀일 때 풀러렌과 HL은 작은 DNA 홈으로 결합되고 HL 페닐기와 C₆₀의 상호작용을 적층하여 안정화된 단단한 복합체가 형성됨 풀러렌 및 DNA G 뉴클레오타이드 뿐만 아니라 HL CCl₃의 상호작용에 의해 C₆₀의 이온-π 결합으로 그룹화 분자 및 DNA G 뉴클레오티드와의 정전기 결합에 의해.

MTT 테스트를 사용하여 IC₅₀의 인간 백혈병 CCRF-CM 세포에 대한 HL의 세포독성 활성을 보여주었습니다. value detected at 10 μM concentration at 72 h of cells treatment. The cytotoxic effect of HL was facilitated by C₆₀ fullerene. Under combined action of 16 μM C₆₀ fullerene and HL, the value of IC₅₀ was detected at lower 5 μM HL concentration and at earlier 48 h period of incubation and besides the cytotoxic effect of HL was observed at a low 2.5 μM concentration at which HL by itself had no influence on cell viability.

Previously, we have shown a significant toxic effect of dimorfolido-N-trichloroacetylphosphoramide against human leukemic cells of different origin, but its effective concentration was high and no enhancement of toxicity after combined action with C₆₀ fullerene was observed [16]. We assume that introduction of flexible of –P(O)(OC₆ H₅ ) groups instead of morfolido groups into CAPh derivative contributed to lowering of its toxic concentration against human leukemic cells ensuring its effective interaction with C₆₀ molecule and DNA. Binding of C₆₀ fullerene and HL with minor DNA groove with formation of a stable complex is assumed to be one of the possible reasons of their synergistic inhibition of CCRF-CЕM cells proliferation.

We have revealed that application of C₆₀ fullerene in combination with 2.5 μM HL had no harmful effect on structural stability of blood erythrocytes membrane, while combination of C₆₀ fullerene with 10 μM HL appeared to be limited by intensification of hemolytic effect.

Thus, C₆₀ fullerene was shown to potentiate cytotoxic effect of HL and to increase significantly human leukemic cells sensitivity to its action in a low concentration. A combination of C₆₀ fullerene with HL in a low concentration 2.5 μM may be promising for further biomedical studies.