약물 내성 미생물 및 종양 발생으로 인해 증가하는 문제를 해결하기 위해 금속 나노 입자, 특히 은 나노 입자를 식물 합성하여 치료 조치를 취하는 접근 방식이 수행되고 있습니다. 본 연구에서는 주요 바이오폐기물인 석류과일 껍질(Punica granatum ), 은 나노 입자를 합성합니다. 석류 껍질의 수성 추출물을 사용하여 은 나노 입자(AgNPs)를 합성했습니다. 합성된 AgNPs의 형성은 UV-Vis spectroscopy, X-ray diffraction(XRD), transmission electron microscopy(TEM), 주사전자현미경(SEM), energy-dispersive X-ray spectroscopy(EDX)를 통해서 확인되었다. 무색 수용액이 암갈색 용액으로 변하는 것. UV-Vis 분광법을 사용하여 짙은 갈색 용액은 24시간, 48시간, 72시간 동안 반응한 후 UV-Vis 분광법에서 378nm에서 플라스몬 공명 밴드 피크를 나타냈습니다. XRD 보고서는 AgNP가 입방 구조를 가지고 있음을 보여주었습니다. TEM 및 SEM 보고서는 나노입자가 20~40nm 범위의 구형 모양과 크기와 26.95nm의 평균 입자 크기로 용액에 균일하게 분포되어 있음을 보여주었습니다. EDX 이미징은 또한 AgNP의 존재를 확인했습니다. 합성된 AgNPs는 그람-음성 및 그람-양성 박테리아, 특히 병원체 Escherichia coli에 대해 우수한 항균 효과를 나타내는 것으로 밝혀졌습니다. (ATCC 25922), 녹농균 (ATCC 27584), 상상균 (ATCC 8427), 살모넬라 장티피 (ATCC 14028), 황색 포도상구균 (ATCC 29213), 표피 포도상구균 (MTCC 3615) 및 클렙시엘라 폐렴 AgNPs의 세포독성 효과를 결장암 세포주(RKO:ATCC® CRL-2577™)에 대해서도 시험했으며, 12.5에 노출된 3일과 5일에 생존율이 각각 56%와 61%인 것으로 관찰되었습니다. AgNPs의 μg. 이 간단하고 경제적이며 친환경적인 방법은 석류 껍질 추출물을 사용하여 생합성된 AgNPs가 항균 활성도 있는 대장암 치료제 개발을 위한 새롭고 강력한 솔루션이 될 수 있음을 시사합니다.
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배경
지난 수십 년 동안 나노기술에 대한 연구, 특히 나노입자의 녹색 합성 및 특성화와 관련된 연구가 증가했습니다. 크기가 100nm 미만인 나노입자가 약물 전달 및 생물의학 응용에 이상적인 제제이기 때문입니다[1]. 나노 입자의 합성은 나노 기술, 생명 공학, 화학 처리, 물리적 방법론, 시스템 공학, 분자 모터, 나노 결정 및 나노 바이오 물질을 포함한 여러 분야에서 영향력 있는 역할을 합니다[2]. 오늘날 나노 입자 생산의 세 가지 방법이 존재합니다. 즉, 화학적, 물리적 및 "녹색" 경로가 있으며, 녹색 경로에는 식물 추출물 및 미생물 여과물을 포함한 생물학적 환원제의 사용이 포함됩니다. 처음 두 가지 방법은 비용이 많이 들고 독성 부산물을 생성하는 경우가 많지만, 녹색 나노합성 방법은 저렴하고 친환경적인 공정으로 인식되고 있습니다[3,4,5].
나노입자의 녹색 합성에서 단백질, 효소 및 탄수화물을 포함한 식물 구성 요소는 표적 생체 분자와 쉽게 상호 작용할 수 있는 나노 입자를 공식화하는 데 사용됩니다[6]. 은 나노입자 합성에 대한 이러한 접근은 식물 나노기술에 의해 제어될 수 있는 다양한 형태의 암 또는 기타 질병에 대한 향후 치료에서 중요한 역할을 할 수 있습니다[7, 8]. 대장균과 같은 그람 음성 박테리아 , 녹농균 , 및 Proteus vulgaris , 및 황색 포도구균과 같은 그람 양성 병원체 및 S. 표피 , 병원 내 감염의 대부분을 차지합니다[9]. 실제로 폐렴과 혈류 감염을 포함한 외과적 감염 역시 그람 양성균과 그람 음성균의 존재에 기인한다[10]. AgNPs의 식물 매개 합성은 공중 보건 관련 미생물 병원체에 대한 효과적인 항균제의 개발에 도움이 될 수 있습니다. 최근 합성된 AgNPs는 항생제인 levofloxacin과 상승작용을 일으켜 전체 항균활성을 증가시킬 수 있다는 사실이 알려져 있다[11]. 많은 연구자들은 합성된 AgNP가 그람 양성 및 그람 음성 병원체에 대한 잘 알려진 항균 특성과 다른 암 및 정상 세포주에 대한 세포 독성 효과를 포함한다고 보고했습니다[12,13,14]. 또한 AgNPs는 높은 표면적 대 부피 비율로 인해 매우 효율적이고 쉽게 파괴될 수 있으며 은 이온 단독과 비교할 때 박테리아 세포를 침투할 수 있는 능력이 있습니다[13].
현재 연구는 Punica granatum의 수성 추출물을 사용한 AgNPs의 녹색 합성에 초점을 맞추고 있습니다. 껍질을 벗기고 37°C에서 24시간 배양 후 줄무늬 플레이트와 최소 억제 농도(MIC) 측정을 사용하여 항균 특성을 조사합니다. 그람 음성균 E. 대장균 (ATCC 25922), P. 녹농균 (ATCC 27584), P. 저속한 (ATCC 8427) 및 살모넬라균 (ATCC 14028) 뿐만 아니라 그람 양성 박테리아 황색 포도상구균 (ATCC 29213), S. 표피 (MTCC 3615) 및 K. 폐렴 합성된 AgNPs에 의한 잠재적인 성장 억제를 테스트하기 위해 연구되었습니다. 또한, 결장암 세포주(RKO:ATCC® CRL-2577™)에 대한 세포독성 효과를 테스트한 결과 12.5μg의 AgNP를 투여했을 때 3일차에 56%, 5일차에 61%의 세포 생존율을 보였습니다.
방법
껍질 추출물의 준비
사우디 석류 열매 1kg(Punica granatum -사우디아라비아 왕국의 타이프 지역에서 재배)는 사우디아라비아 리야드의 슈퍼마켓에서 구입했습니다. 과일을 수돗물로 여러 번 씻은 다음 이중 증류수(DDH2 영형). 세척 후 껍질을 조심스럽게 제거했습니다. 석류 껍질은 DDH2로 철저히 헹굽니다. O 표면 오염을 방지하고 실온에서 완전히 건조되도록 하십시오. 마지막으로 껍질을 곱게 갈았다. 10g의 미세 분말을 100mL의 DDH2에 담그었습니다. 실온에서 24시간 동안 O 생성된 혼합물을 Whatman No. 1 여과지를 사용하여 여과하여 수성 추출물을 얻었다. 모든 과정은 멸균된 조건에서 진행되었습니다.
AgNP의 합성 과정
질산은(AgNO3; 0.1mM)을 250mL의 DDH2O와 혼합했습니다. 그런 다음 석류 껍질 추출물 수용액 10ml를 첨가하고 용액을 진탕 배양기를 사용하여 5분 동안 철저히 혼합했습니다. 반응 혼합물은 24시간 후에 무색 용액에서 갈색 용액으로 색이 변하는 것으로 밝혀졌으며, 이는 은 이온이 은 나노 입자로 환원되었음을 나타냅니다. 그런 다음 나노입자 용액을 15,000RPM에서 15분 동안 원심분리하고 이 과정을 4회 반복했습니다. 마지막으로, 정제된 AgNPs를 수집하고 합성된 NPs의 특성과 생물학적 활성을 분석하기 위해 추가 분석을 수행했습니다. 잉여 껍질 추출물은 추가 분석을 위해 4°C에 보관되었습니다.
AgNP의 특성
석류 껍질 수성 추출물에 의한 은 이온 감소는 Perkin Elmer Lambda 950 UV/Vis/NIR 분광광도계를 사용하여 200~800nm에서 반응 시작 후 1nm의 분해능에서 24, 48 및 72시간 동안 모니터링했습니다. . XRD 패턴은 2θ에서 20~50 범위의 스캔 속도가 가능한 PANalytical X-ray 회절계로 얻었습니다. 은 나노 입자의 결정 구조를 결정하는 데 사용되었습니다.
AgNP의 표면 지형 및 조성 분석은 JEOL JEM-1230(JEOL, Tokyo, Japan) 및 JSM 6380 LA SEM에서 3.0nm의 분해능으로 수행된 TEM 분석을 사용하여 수행되었습니다. AgNPs의 원소 분석은 JED 2200 시리즈(Jeol)를 사용하여 EDX(energy-dispersive X-ray spectroscopy)로 분석하였다.
항균 연구
세균 현탁액 준비
박테리아 균주 E. 대장균 (ATCC 25922), P. 녹농균 (ATCC 27584), P. 저속한 (ATCC 8427), S. 타이피 (ATCC 14028), S. 구균 (ATCC 29213), S. 표피 (MTCC 3615) 및 K. 폐렴 사우디 아라비아 왕국 리야드의 King Khalid 병원에서 얻은 것입니다. 박테리아 세포의 신속한 식별은 이전에 발표된 방법에 따라 수행되었습니다[15]. 확인된 모든 배양물을 한천 배지로 옮기고 연구에 필요할 때까지 - 20°C에서 보관했습니다. 이 시점에서 각 박테리아 균주를 멸균 영양 한천에 접종하고 37°C에서 24시간 동안 배양했습니다. 정지(10
6
CFU/mL)는 24시간 배양된 배양액의 접종 루프를 5mL의 영양액으로 옮기고 37°C에서 2시간 동안 배양하여 준비했습니다.
항균 분석
항균 활성 분석은 한천 웰 확산 방법을 사용하여 수행되었습니다[16]. 멸균 면봉을 신선한 세균 현탁액으로 적시고 고체 멸균 Muller-Hinton 한천 플레이트에 펼쳤습니다. 코르크 천공기를 사용하여 한천 플레이트에서 웰을 만들었습니다. 서로 다른 농도(25, 50, 75, 100μL)의 합성 나노입자 현탁액을 각 연속 웰에 부었습니다. 모든 플레이트를 37°C에서 24시간 동안 인큐베이션했습니다. 모든 인큐베이션 플레이트의 각 웰 주위에서 억제 영역(mm)을 측정했습니다. 각 실험에 대해 3번의 복제가 수행되었습니다[17].
세포 증식 분석
세포 증식에 대한 AgNPs의 효과는 이전에 설명한 대로 Alamar Blue 분석을 사용하여 평가되었습니다[12].
간단히 말해서 0.005 × 10
6
세포/웰을 다양한 농도(100–0.3μg/mL)의 AgNP로 96웰 플레이트에 접종하고 37°C에서 2~5일 동안 배양했습니다. 배지 DMEM에는 4500mg/L d-글루코스, 4mM l-글루타민, 110mg/L 피루브산나트륨, 10% 소태아혈청(FBS), 1X 페니실린-스트렙토마이신 및 비필수 아미노산이 보충되었습니다. (모두 미국 Gibco-Invitrogen에서 구입). 대조 웰은 배지 단독으로 처리되었고 3일 및 5일에 세포 증식이 측정되었습니다. 이 시점에서 Alamar Blue(1:10)를 각 웰에 첨가하고 플레이트를 37°C에서 4시간 동안 인큐베이션했습니다.; 그런 다음 분광광도계 마이크로플레이트 판독기(Biotek Synergy 2; Biotek Instruments, USA)를 사용하여 플레이트를 읽고 상대 형광 단위(RFU)를 기록했습니다.
세포 사멸/괴사 분석
세포 사멸/괴사를 결정하기 위해 세포를 다양한 농도(25-1.5μg/mL)의 AgNP로 처리했습니다. 5일째에 세포를 100μg/mL AO(아크리딘 오렌지) 및 100μg/mL EtBr(ethidium bromide)(AO/EtBr, Sigma, St. Louis, MO)을 포함하는 이중 형광 염색 용액(1μL)으로 염색했습니다. ). 염색된 세포를 AO/EtBr(1:100) 염료 용액에 1분 동안 노출시키고 Nikon Eclipse Ti 형광 현미경을 사용하여 관찰했습니다. 결과를 실험 대조군과 비교하였다. 두 염료의 조합인 AO/EtBr은 비정상적인 염색질 조직을 가진 세포를 시각화하는 데 도움이 됩니다. AO/EtBr의 차등 섭취는 생존 가능한 세포와 생존할 수 없는 세포의 식별을 허용합니다. 특히, AO는 apoptosis를 겪은 세포의 수를 시각화하는 데 사용되었습니다.
통계 분석
Microsoft Excel 2010 및 GraphPad Prism 6.0 소프트웨어(GraphPad, San Diego, CA, USA)를 사용하여 통계 분석 및 그래프 작성을 수행했습니다. 피 값은 일원 ANOVA 다중 비교를 사용하여 계산되었습니다. 다양한 농도에 대한 항균 데이터 분석은 P의 유의 수준으로 테스트되었습니다. <0.05.
결과 및 토론
AgNPs는 석류 껍질의 수성 추출물을 환원제 공급원으로 사용하여 성공적으로 합성되었습니다. 그림 1a는 250mL의 DDH2에 용해된 0.1mM 질산은을 보여줍니다. O 무색 용액을 만듭니다. 그런 다음, 10mL의 껍질 추출물을 넣고 잘 섞은 다음 그림 1b와 같이 24시간 동안 반응 혼합물이 서서히 암갈색으로 변하였다. AgNPs 합성 중 관찰된 색상 변화는 잎, 꽃, 껍질, 종자 및 과일과 같은 여러 유형의 식물 부분 추출물을 사용할 때 유사한 반응에 대해 보고되었습니다. 색상 변화는 AgNO3로 인한 것입니다. 식물 공급원과 상호 작용하고 질산은에서 원소 은으로 감소[18,19,20,21,22].
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아 질산은 0.lmM. ㄴP 이후에 색상이 변경됩니다. 그라나툼 껍질 추출물 추가
그림 2는 석류 껍질 수성 추출물을 사용하여 합성된 AgNP의 UV-Vis 스펙트럼을 보여줍니다. 그림 2와 같이 흡광도 밴드는 378nm에서 24시간, 48시간, 72시간 반응시간에 피크가 나타나며 강도는 각각 0.96, 1.08, 1.16입니다. 반응 시간이 길어지면서 강도가 증가하여 AgNP의 농도가 높아졌습니다. 표면 플라즈몬 공명 데이터는 AgNPs의 농도가 증가하면 AgNP 피크가 증가하여 시간이 지남에 따라 감소된 은의 양이 증가함을 보여주었습니다. AgNO3로 석류 추출물에서 전자 방출로 인해 AgNPs를 형성하기 위해 반응했고, 동시 반응은 아스코르브산 라디칼을 산화시키기 시작했습니다. 석류 껍질 추출물에서 AgNP를 생성한 다른 연구에서 유사한 UV-Vis 흡수 스펙트럼이 관찰되었으며 흡광도 피크는 371nm입니다[23].
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48~72시간 간격으로 합성된 AgNP의 UV-Vis 흡광도 스펙트럼
녹색 합성 AgNPs의 XRD 패턴은 그림 3에 나와 있습니다. 2θ에서 6개의 강한 회절 피크가 관찰됩니다. 0에서 90 사이의 값은 중앙 Ag 이온이 있는 면이 있는 입방체의 111, 200, 220 및 311 평면을 할당할 수 있음을 나타냅니다. XRD 스펙트럼은 합성된 AgNP가 결정 구조로 형성되었음을 시사한다. 이 결과는 이전에 JCPDS 데이터베이스(No. 04-0783)에 게시된 XRD 패턴과 일치합니다. 관찰된 미확인 결정성 피크(*)는 산화은에 해당합니다[24]. 0.1-mM 석류 수성 껍질 나노입자의 TEM 이미지가 그림 4에 나와 있습니다. 이 이미지는 입자가 직경이 20~40nm 범위이고 평균 입자 크기가 26.95nm인 구형 모양임을 보여줍니다. Actinidia deliciosa를 사용한 나노입자 나노합성과 관련하여 유사한 보고가 있었습니다. 과일 추출물 [25]. 합성된 AgNPs의 SEM 관찰(그림 5)은 석류 껍질 세포 표면에 은 나노입자의 균일한 분포를 보여줍니다. 이 이미지에서 나노입자는 직경이 20~40nm인 구형인 것으로 확인되었으며, 이는 Raphanus sativus를 사용하여 생성된 직경이 34~50nm 범위인 구형 AgNP에 대한 이전 보고서와 유사합니다. L. 껍질 추출물 [26].
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P에서 합성된 AgNP의 XRD 패턴. 그라나툼 껍질 추출물
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P에서 합성된 AgNP의 TEM 이미지. 그라나툼 껍질 추출물
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P에서 합성된 AgNP의 SEM 이미지. 그라나툼 껍질 추출물
여기에 제시된 석류 껍질 추출물을 사용하여 은 나노 입자의 식물 합성에서 얻은 나노 입자의 크기는 약물 전달에 매우 유망합니다. 100nm 미만의 나노 입자 크기는 스마트 시스템 개발에 중요한 역할을 하는 것으로 보고되어 치료 및 영상 가치를 향상시키고 특정 조직에 약물을 전달하여 제어 방출 요법을 제공하는 것으로 보고되었습니다[27]. 나노 입자의 크기와 모양은 표적 조직에서 약물의 생체 이용률에 영향을 미칩니다. 100nm의 나노입자는 직경이 1μm인 입자와 비교할 때 2.5배 더 큰 흡수를 나타내는 것으로 보고되었습니다[28, 29]. 나노 입자의 크기는 분해, 혈관 역학, 표적화, 제거 및 흡수 메커니즘과 같은 입자 기능에서 핵심적인 역할을 합니다[30]. 또한 합성된 AgNPs의 나노결정질 특성은 보고된 바와 같이 생체 분포 및 약동학을 개선합니다[31, 32]. 석류 바이오 폐기물의 활용은 이전에 보고된 바와 같이 폐기물 활용에 대한 새로운 접근 방식이 될 것입니다[33].
EDX 연구의 데이터는 그림 6과 같이 합성된 나노입자에서 발견된 원소의 정성 및 정량 분석을 제공했습니다. EDX 연구는 합성된 NP의 함량에 대한 원소 분석을 제공하고 NP가 70%로 구성되는 것으로 추정했습니다. 무게로 Ag. 결과에서 확인된 다른 요소와 결합에는 C-K, O, C-U, Cu 및 K가 포함되었으며, 각각은 전체 질량의 작은 비율에 해당했습니다. EDX 보고서는 0.1mM AgNO3의 낮은 농도가 많은 수의 합성 AgNP가 생성되었습니다. 0.3mM AgNO3에 대해서도 유사한 결과가 보고되었습니다. 이를 3시간 동안 증류수에 붓고 300°C로 가열하고 석류 껍질 추출물 1, 2, 3g에 증류수 30mL를 혼합하고 80°C로 가열합니다[34].
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P에서 합성된 AgNP의 EDX 이미지. 그라나툼 정량 분석을 통한 껍질 추출물
25, 50, 75 및 100μg/mL 시료를 사용하여 석류 합성 AgNPs의 항균 특성을 한천 웰 확산 테스트를 통해 그람 양성균과 그람 음성균 모두에 대해 조사했습니다. 그람 음성 박테리아 E가 있는 한천 플레이트. 대장균 , S. 타이피 , 및 녹농균 억제 영역은 그림 7a-c에 나와 있습니다. 낮은 농도의 석류 합성 AgNPs(25 및 50μL)는 P에 대한 억제 활성을 나타냈습니다. 녹농균 및 E. 대장균 그러나 S를 반대하지는 않습니다. 타이피. 석류 제품의 유사한 항균 효과가 이전에 보고된 바 있으며, 여기서 가장 강력한 억제는 E. 대장균 , S. 구균 , 및 P. 녹농균 [35,36,37].
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그람 음성 병원체의 AgNPs의 항균 효과 및 억제 영역(a –ㄷ )
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그람 양성 병원체의 AgNPs의 항균 효과 및 억제 영역(d –f )
그림 8a-c는 합성된 AgNPs의 그람 양성 병원체 K에 대한 항균 활성을 보여줍니다. 폐렴 , S. 구균 , 및 S. 표피 . K의 경우 낮은 AgNP 농도(25 및 50μL)에서도 항균 활성이 관찰되었습니다. 폐렴, 각각 9 및 14nm의 억제 영역과 S에 대한 것입니다. 구균 , 각각 6 및 14nm의 억제 영역이 있습니다. 이전 연구에서도 합성 나노입자로 처리한 그람 양성균의 성장 억제가 확인되었습니다[35,36,37,38]. 합성된 AgNP에 노출된 후 평가된 항균 활성은 7~21mm 범위의 억제 영역을 보여주었습니다. 그림 9는 P의 다양한 농도(25~100μL)에 따른 억제 효과를 나타냅니다. 그라나툼E에서 AgNP를 벗겨냅니다. 대장균 , 피. 녹농균 , S. 타이피 , 케이. 폐렴 , S. 구균 , 및 S. 표피 . 낮은 농도의 AgNP에서도 S를 제외한 모든 미생물에서 우수한 항균 활성이 관찰되었습니다. 타이피 , 앞서 보고된 바와 같이 [38].
AgNPs의 세포독성 효과를 분석하기 위해 결장암 세포주(RKO:ATCC® CRL-2577™)를 이용하였다. 3일째에 12.5μg 처리로 56%의 생존력을 발견했고 5일째에 61%의 생존력을 발견했습니다. 증식의 전반적인 유의미한 감소는> 12.5μg에서 관찰되었으며(그림 10a), 또한 AO/EtBr 염색 이미지는 집락과 세포 수를 시각화하여 증식 감소를 확인했습니다(그림 10b). 흥미롭게도 우리는 12.5μg에서 핵주위 세포질 액포가 있는 세포를 관찰할 수 있었습니다(그림 10b, c). 이 과정은 프로그램된 세포 사멸을 향상시키기 위한 자가포식 과정에서 리소좀의 분해 경로일 수 있습니다. 그러나 자가포식 기능에 대한 AgNP의 효과를 확인하기 위해서는 추가 연구가 필요합니다. Pimpinella anisum을 사용하여 합성된 AgNPs에 대한 이전 연구에서 씨앗에서 12μg의 AgNP가 세포 사멸 또는 괴사를 강화하여 HCT116 세포에 독성이 있음을 발견했습니다[12]. 낮은 농도의 AgNPs도 세포자멸사를 유도할 수 있는 것으로 보고되었습니다[39]. Punica granatum으로 합성된 AgNPs에 대한 현재 실험 껍질 추출물도 12.5μg에서 55~62%의 독성을 보였습니다. 또한, AO/EtBr 염색은 자가포식을 통한 예정된 세포 사멸의 명확한 그림을 보여주었습니다.
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그람 음성 및 그람 양성 병원체에 대한 AgNP의 항균 활성
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AgNP의 세포독성. 아 RKO 세포에 대한 세포 증식 및 생존력 분석. 일원 분산 분석 다중 비교, ***P <0.0005. ㄴ RKO 세포에 대한 아폽토시스/괴사 분석. ㄷ 다양한 용량의 AgNP에 노출된 RKO 세포
결론
본 연구의 결과는 석류 껍질 추출물이 20-40nm 크기 범위(평균 크기, 26.95nm)의 은 나노 입자를 합성하는 좋은 환원제이며, 효율적인 약물 전달과 생체 이용률 증가를 위한 이상적인 전제 조건임을 보여주었습니다. 대상 사이트. 시험된 유기체에 대한 합성된 AgNP의 항균 활성은 낮은 농도의 AgNP(25–100μL)에서도 그람 음성 및 그람에 대한 치료를 위한 새로운 항균제의 개발을 위한 녹색 합성 AgNP의 항생제 효율성을 확인합니다. -양성 병원체. 더욱이, 관찰된 결장암 세포주에 대한 AgNP의 세포독성 효과와> 12.5μg의 용량 수준에서 세포 증식의 감소는 종양의 1차 치료제로서 AgNP를 더욱 촉진합니다.
