신선한 vs 노화된 산화아연 나노입자의 세포독성: 아폽토시스 경로가 주요 원인

초록

산화아연 나노입자(ZnO NP)는 산업, 상업 제품, 의료 분야 등 광범위한 응용에 사용된다. 수많은 메커니즘 연구가 프리스틴(신선한) NP의 독성에 대해 수행되었으나, 변형된(노화된) ZnO NP에 의한 세포독성과 기저 메커니즘은 불분명하다. 여기서 우리는 ZnO NP의 물리화학적 변환을 시간에 따라 관찰한 후 신선한 NP와 노화된 NP의 세포독성을 평가했다. 신선한 ZnO NP가 노화된 것보다 더 높은 아폽토시스 수준을 유도함을 발견했다. 이에 따라 노화된 ZnO NP 처리된 인간-햄스터 하이브리드(A_L) 세포의 RNA 시퀀싱 데이터에서 p53, PI3k-Akt, FoXO, 글루타티온, ErbB, HIF-1, 옥시토신, Jak-STAT 신호 경로가 풍부해졌으나 아폽토시스 경로는 없었다. 정량적 PCR 결과 신선한 NP 처리군에서 IL1B와 CD69 mRNA 수준이 노화된 ZnO NP 및 염화아연 처리군보다 유의미하게 높았다. 위 결과들은 노화된 ZnO NP의 낮은 세포독성이 아폽토시스 유도 능력 감소에 부분적으로 기인함을 시사한다. 노화된 NP에 의해 활성화된 다중 신호 경로의 전사적 조절이 세포 항상성 구축에 도움을 줄 수 있다. 종합적으로 우리 연구는 ZnO NP의 노화(환경 변환) 과정이 독성과 생물학적 결과에 미치는 영향을 강조한다.

서론

지난 수십 년간 나노기술의 급속한 발전으로 나노입자(NP)가 산업, 인간 일상생활, 나노의학 등 다양한 분야에 적용되어 왔다[1, 2]. 나노기술 소비자 제품 인벤토리(CPI)는 2005년과 2015년 사이 나노 제품 수가 30배 증가했음을 보여주며, 이 중 762개 건강(피트니스) 제품, 72개 식품(음료), 23개 유아 제품이 포함된다[2]. 소비자 제품과 다양한 분야에서 NP 응용이 증가함에 따라 NP가 환경으로 유입될 가능성이 커졌으며, 잠재적 유해 영향에 대한 안전 우려가 제기된다. 산화아연(ZnO) NP는 가장 흔히 사용되는 NP 중 하나로, 전 세계 연간 생산량이 거의 3400톤에 달한다[3, 4]. 이전에 생물학적으로 불활성으로 간주되던 물질이 나노입자 상태에서 독성을 가질 수 있다. 점점 더 많은 연구가 ZnO NP가 포유류 세포와 동물에 유의미한 독성을 유도하여 상당한 위험을 초래할 수 있음을 밝혔다[5-7].

코팅, 표면 기능화, 산화 상태 수정 등 다양한 전략이 NP의 물리화학적 특성(용해, 응집, 세포막 교란 등)을 수정하여 잠재적 독성을 완화하는 데 사용되어 왔다[8-11]. 이러한 NP 수정이 독성 효과를 어느 정도 약화시키지만, 특정 노출 조건과 환경에서는 NP 사용이 항상 안전하지 않다[12-14]. 실제로 많은 종류의 NP가 안정적이지 않아 의도적이든 비의도적이든 자연 환경으로 방출된 후 "노화" 또는 "환경 변환"을 겪기 쉽다[14-17]. 최근 NP의 환경 변환 과정을 탐구하는 많은 연구가 수행되었으나, "변형된(노화된)" NP의 독성 효과에 대한 연구는 여전히 매우 제한적이며, 독성 메커니즘은 더욱 그렇다.

비영구적 NP의 전형적인 대표로서 ZnO NP는 매우 높은 반응성을 가지며, 환경으로 방출되거나 동물에 섭취된 후 물리화학적 특성과 발생 상태가 변환되어 독성학적 효과에 중대한 영향을 미칠 수 있다[17, 18]. 예를 들어 ZnO NP의 황화 과정이 전하, 소수성, 응집 상태를 변화시켜 인간 타액, 땀, 기관지폐포 세척액에서 황화 상태 NP 흡착을 초래함이 밝혀졌다. 또한 ZnO NP에 흡착된 단백질이 특수 단백질 코로나를 형성하여 보통 생물학적 효과에 영향을 미친다[19]. 생리 식염수의 인산염이 ZnO NP를 약 5-10시간 내에 준안정적인 ZnHPO₄와 Zn₃(PO₄)₂로 전환시킬 수 있다[20]. 인간 T 림프구에 대한 in vitro 노출 시스템(37°C, 10% FBS 함유 RPMI1640 배지, 24시간)에서 ZnO NP(≤3μg/mL)의 완전한 변환 과정이 싱크로트론 방사선 X선 흡수 근단 구조 분광법(XANES)으로 조사되었다[21]. 위 연구들은 프리스틴(신선한) ZnO NP의 생물학적 효과만 평가함으로써 ZnO NP의 환경 및 건강 위험이 과소평가될 수 있음을 시사한다. 이 문제를 고려하여 NP의 노화와 환경 변환 과정을 종합적으로 이해할 긴급한 필요가 있다[22].

우리 이전 연구는 ZnO NP가 초순수에서 40-120일 노화 시 물리화학적 변환을 거쳐 Zn₅(CO₃)₂(OH)₆, Zn(OH)₂, Zn²⁺로 변환됨을 밝혔다[23]. 흥미롭게도 노화된 ZnO NP는 신선한 것보다 낮은 세포독성을 보였으나[23], 이러한 변이의 독성 메커니즘은 불분명하다. 현재 연구에서 우리는 신선한 ZnO NP와 노화된 ZnO NP 간 다른 세포독성의 근본 원인을 탐구하고자 했다. 두 가지 다른 입자 크기(20nm, 90-200nm) ZnO NP를 체계적으로 적용했다. 세포독성 분석 결과 노화된 ZnO NP가 신선한 것보다 덜 뚜렷한 형태 이상과 상대적으로 높은 세포 생존율을 유도함을 보였다. RNA 시퀀싱 데이터는 신선한 ZnO NP 처리 세포에서 아폽토시스 유전자가 풍부해진 반면, 노화된 ZnO NP 처리에서는 이 유전자들이 훨씬 덜 영향을 받음을 보여주었다. 또한 노화된 ZnO NP에 노출된 세포에서 절단된 카스파제-3 단백질 수준이 감소하여, 신선한 ZnO NP가 배양 세포에서 아폽토시스를 유도하는 힘이 더 강함을 추가로 시사했다. 이전 발견과 결합하여, 이 연구는 노화된 ZnO NP의 감소된 세포독성이 세포 아폽토시스 유발 능력 감쇠에 기인함을 시사한다.

재료 및 방법

나노입자 및 시약

제조사 보고 평균 크기 20nm(99.5% 순도, 거의 구형)와 90-200nm(99.9% 순도, 불규칙 형태)의 상용 ZnO 나노파우더(ZnO NP)를 Nanostructured & Amorphous Materials(미국 휴스턴)에서 구입했다. 달리 명시하지 않는 한 본 연구에 사용된 모든 시약과 화학물질은 Sigma-Aldrich(중국 상하이)에서 구입했다.

나노입자 분산, 노화 및 특성 분석

ZnO NP 스톡 현탁액(1mg/mL)을 건조 나노파우더를 Milli-Q H₂O(밀리포어, 18MΩ·cm)에 분산시키고 오토클레이빙(120°C, 30분)으로 멸균한 후 25°C에서 0-60일 자연 노화 기간 동안 보관했다. 0일과 60일 자연 변환된 ZnO NP를 각각 신선한 NP와 노화된 NP로 지정했다. 적절한 분산을 위해 특성 분석이나 세포 배양 전 신선한 현탁액과 노화된 현탁액을 초음파 욕조에서 100W로 30분간 초음파 처리했다. 신선하고 노화된 ZnO NP의 형태, 입자 크기, 응집은 투과전자현미경(TEM, JEOL JEM-2010, 일본 도쿄)으로 특성 분석했다. 신선하고 노화된 ZnO NP의 결정 구조는 정품 표준과 비교하여 분말 X선 회절(XRD, PANalytical B.V., 중국 상하이)로 결정했다. ZnO NP의 자연 노화 과정과 특성 분석 세부사항은 이전에 기술되었다[23].

세포 배양 및 ZnO NP 처리

중국 햄스터 난소(CHO) gly2A 돌연변이체와 인간 섬유아세포 융합으로 형성된 인간-햄스터 하이브리드 세포인 A_L 세포주를 사용했다. 이 하이브리드 세포는 표준 CHO-K1 염색체 세트와 인간 11번 염색체 단일 사본을 포함하며, 37°C, 5% CO₂ 인큐베이터에서 글리신(2×10⁻⁴M), 겐타마이신(25g/mL), 태아 소 혈청(8%, 하이클론, 미국 그랜드 아일랜드) 첨가 햄 F12 배지(하이클론, 미국 그랜드 아일랜드)로 배양했다[24]. 신선하고 노화된 ZnO NP 스톡 현탁액을 30분 초음파 처리(100W)하여 응집 방지 후 세포 배양 배지로 적절히 희석하여 세포에 노출시켰다. NP 없는 세포 배양 배지로 유지된 세포를 각 실험에서 대조군으로 사용했다.

세포독성 검출 분석

대수 성장기 A_L 세포를 35mm 페트리 접시(접시당 6×10⁴ 세포)에 유리 슬라이드 위에 파종하고 24시간 배양 후 자극했으며, 이후 1, 5, 10, 12, 15, 20μg/mL 신선하거나 노화된 ZnO NP를 함유한 2mL 배양 배지로 72시간 처리했다. 처리 완료 후 라이카 DM4B 현미경(라이카, 독일)으로 세포 형태 이미지를 획득했다. ZnCl₂를 아연 이온 참고 물질로 포함하여 ZnO NP와의 세포독성을 비교했다.

세포 생존율 검출을 위해 셀 카운팅 키트(CCK-8)(APExBIO, 중국 상하이)를 사용했다. 구체적으로 A_L 세포를 96웰 플레이트(웰당 4×10³ 세포)에 배양 배지로 24시간 파종하고, ZnCl₂, 신선한 및 노화된 ZnO NP 다양한 농도를 함유한 배지로 24, 48, 72시간 각각 처리했다. 작업 용액에서 스톡 현탁액으로부터 첨가된 NP 부피는 각 웰 배양 배지 총 부피의 5% 미만이었다. 처리 완료 후 배양 배지를 흡인하고, 제조사 지침에 따라 100μL CCK-8 작업 용액으로 37°C에서 2시간 인큐베이션했다. 그런 다음 Spectra Max M2 형광 리더(몰레큘러 디바이스, 영국 워킹엄)로 450nm에서 흡광도를 기록했다. 세포 생존율을 대조군 세포 흡광도(100%)로 정규화한 각 농도 NP의 흡광도 백분율로 계산했다.

RNA 추출, 역전사 및 정량적 PCR

대수 성장기 A_L 세포를 35mm 직경 페트리 접시(접시당 6×10⁴ 세포)에 배양 배지로 24시간 파종했다. 그런 다음 배지를 12μg/mL ZnCl₂, 신선한 및 노화된 ZnO NP를 함유한 2mL 배양 배지로 교체하고 72시간 처리했다. 처리 완료 후 배양 배지를 흡인하고 세포를 PBS로 3회 세척했다. 이후 제조사 지침에 따라 각 접시에 1mL 트라이졸 시약(인비트로젠, 미국 칼스배드)을 첨가하여 총 RNA를 추출했다. 추출 후 얻은 총 RNA의 농도와 순도를 Q5000 UV-Vis 분광광도계(Quawell, USA)로 정량했다. 정량 후 TransGene RT-PCR 키트(TransGene Biotech, 중국 베이징)로 제조사 프로토콜에 따라 RNA 템플릿에서 cDNA를 얻기 위해 역전사를 수행했다. 결과 cDNA 샘플을 Q5000 UV-Vis 분광광도계로 정량하고, SYBR-Green 형광 염료(TransGene Biotech, 중국 베이징)를 사용하여 Roche RT-PCR 시스템(Applied Biosystems)에서 분석했다[25].

하우스키핑 유전자인 글리세랄데히드-3-인산 탈수소효소(Gapdh)를 내부 대조군으로 사용하여 Il-1α, Il-1β, Caspase 3, CD69, Jun, MT1 mRNA 발현을 평가했다. 결과는 표적 유전자와 Gapdh 간 상대 발현 비율로 표현했다. 본 연구에 사용된 프라이머 서열은 표 1에 제공된다.

RNA 시퀀싱 데이터 분석

대조군, 노화된 ZnO NP 처리군, ZnCl₂ 처리군 A_L 세포의 총 RNA 샘플을 방페이 바이오사이언스(중국 베이징)에서 시퀀싱했다. 간단히, A_L 세포 총 RNA를 TRIZOL 프로토콜에 따라 이소프로판올 침전까지 추출했다. 그런 다음 RNA 샘플을 추출 버퍼에 재현탁하여 시퀀싱했다. 원시 카운트 RNA 시퀀싱 데이터를 R 패키지 Deseq2[Eric1]로 분석했다. 벤 다이어그램은 R 패키지 VennDiagram[Eric1.2]으로 생성했다. 유의미하게 변한 유전자를 추가 경로 농축 분석에 사용했다. 실험은 3개 독립적 반복으로 수행했다. rRNA 유전자, 미토콘드리아 유전자, 40bp 미만으로 검출된 유전자는 분석에서 제외했다.

RNA 시퀀싱 데이터, 참조 시리즈 GSE97852, GSE60159, GSE39444는 유전자 발현 옴니버스[Eric 2, 3, 4]에서 얻었다. 유전자 세트 농축 분석 플롯은 R(버전 3.6.2) fgsea 패키지[Eric 5]로 생성했다. 1.5배 유의미 변화 & p값 < 0.05인 아폽토시스 유전자를 추가 분석에 사용했다. 유전자 트리가 있는 히트맵은 R 패키지 "ComplexHeatmap"[Eric 6]으로 생성했다. 평균 연결법을 클러스터링 방법으로, 유클리드 거리를 거리 측정 방법으로 사용했다. 경로 농축 분석은 STRING2.0[Eric 7]로 수행했다.

웨스턴 블로팅

대수 성장기 A_L 세포를 60mm 직경 페트리 접시(접시당 1.5×10⁵ 세포)에 배양 배지로 24시간 파종했다. 그런 다음 배지를 12μg/mL 신선한 또는 노화된 ZnO NP를 함유한 4mL 배양 배지로 교체하고 24시간 처리했다. 노출 기간 종료 후 배양 배지를 흡인하고, 세포를 PBS로 3회 세척한 후 얼음 위에서 RIPA 용해 버퍼(베이오타임, 중국)로 용해하여 세포 단백질을 수집했다. 동일한 양의 세포 단백질을 12% SDS-PAGE 겔에서 분리한 후 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF) 막(로슈, 스위스)으로 전이시켰다. 간단히, 5% 무지방 우유로 TBST에서 25°C 2시간 차단 후, 제조사 프로토콜에 따라 적절한 희석비로 1차 항체를 4°C에서 오버나이트 인큐베이션했다. 이후 HRP 결합 2차 항체(1:5000, 프로메가, 미국 매디슨)로 25°C에서 2시간 인큐베이션했다. 마지막으로 향상된 화학발광(ECL)(보스터, 중국) 용액으로 면역 표지를 검출했다. 항-프로/절단 카스파제-3 및 항-액틴 1차 항체는 각각 Cell Signaling Technology와 ImmunoWay에서 구입했다.

통계

통계 분석은 최소 3개 독립 실험 결과 평균으로 수행했다. 모든 데이터는 평균 ± 표준편차(SD)로 제시했으며, 일원 분산 분석(ANOVA)으로 통계적으로 비교했다. 모든 플롯에서 p값 < 0.05를 *로 표시하고 통계적으로 유의미한 것으로 간주했다.

결과

ZnO NP 특성 분석

신선하고 노화된 ZnO NP 간 상세한 물리화학적 특성 차이를 결정하기 위해 먼저 TEM으로 NP 형태를 관찰했다(그림 1A). 우리 결과에 따르면 20nm 신선한 ZnO NP는 거의 구형 결정이었고 90-200nm 신선한 ZnO NP는 불규칙한 막대/입방체 결정이었다. 단일 입자 크기는 제조사 제공 크기와 일치했다. 분명히 20nm와 90-200nm ZnO NP 모두 초순수에서 응집 경향이 있었다. 또한 원래 NP의 모양과 크기에 관계없이 20nm와 90-200nm ZnO NP 미세구조가 60일 노화 후 맑은 결정 구조에서 비정질 또는 시트/바늘 형태 상태로 극적으로 변화했다. 또한 신선하고 노화된 NP의 결정성과 상 순도는 25°C에서 Cu Kα 방사선(λ = 0.15418nm)을 사용한 X선 회절(XRD)로 결정했다(그림 1B). 신선한 ZnO NP의 XRD 패턴은 샘플이 결정질 우르츠라이트 구조로 구성되며 특징적인 불순물 피크가 없음을 나타내어 신선한 NP의 높은 품질을 시사한다. 노화된 NP의 경우 XRD 패턴에서 Zn₅(CO₃)₂(OH)₆(카드 번호 00-011-0287)과 Zn(OH)₂(카드 번호 00-003-0888) 고상 신생이 나타나 ZnO NP(20 및 90-200nm)가 노화 과정에서 화학적 변환을 겪음을 나타낸다.

신선한 vs 노화된 산화아연 나노입자의 세포독성: 아폽토시스 경로가 주요 원인 — 신선하고 노화된 ZnO NP의 물리화학적 특성. A Milli-Q 물에서 신선/노화 NP(100μg/mL, 20 및 90-200nm) 저해상도 TEM 대표 현미경 사진, B 건조 형태의 신선 NP, 노화 NP, ZnO, Zn(OH)₂, Zn₅(CO₃)₂(OH)₆ 기준 XRD 패턴

신선/노화 ZnO NP 노출 A_L 세포 형태 관찰

NP 처리는 in vitro에서 현저한 세포 형태 변화를 초래한다[26]. 따라서 10 및 15μg/mL 신선하거나 노화된 ZnO NP에 72시간 노출된 A_L 세포를 입체 현미경으로 관찰했다. 그림 2에서 대조군 세포 형태는 정상이었다. 세포가 잘 부착되어 대부분 2시간 내 부착했다. 대부분 세포가 방추형 또는 다각형이었으며, 소수의 새로 분열하는 세포가 더 투명한 세포질과 부착 과정 중 더 나은 분산을 보였다. 12μg/mL 신선한 ZnO NP(20nm 및 90-200nm)로 72시간 처리 시 세포 형태가 유의미하게 변했다. 대부분 세포가 3-5시간 내 부착했으나 잘 퍼지지 않았고, 일부 세포는 둥글게 변해 다각형 모양을 잃었다. ZnO NP 농도를 15μg/mL로 증가시켰을 때 처리된 세포가 위축되어 부착할 수 없었으며, 10μg/mL 처리 세포보다 유의미하게 낮은 세포 생존율을 시사했다. 이 결과들은 신선한 ZnO NP의 LC₁₀₀이 72시간 처리 시 15μg/mL 미만일 가능성을 나타낸다. 반면 20nm 및 90-200nm 노화 NP 처리군(15μg/mL) 세포 형태는 유의미하게 영향을 받지 않았으며, 생존 세포 대부분이 부착하고 퍼질 수 있었고, 절반 미만의 죽은 세포만 관찰되어 노화된 ZnO NP가 신선한 것보다 훨씬 낮은 세포독성을 가짐을 드러냈다.

노화된 ZnO NP가 신선한 NP보다 낮은 세포독성 유도

신선하고 노화된 ZnO NP 간 세포독성 차이를 추가로 조사하기 위해 CCK-8 키트로 세포 생존율을 측정했다. 그림 3에서 볼 수 있듯이 A_L 세포를 신선하고 노화된 ZnO NP(0-20μg/mL, 20nm 및 90-200nm) 기울기 농도로 24시간, 48시간, 72시간 인큐베이션하면 용량 의존적 세포 생존율 감소가 나타났다. ZnO NP ≤10μg/mL 처리 시 명백한 세포독성이 관찰되지 않았다. 신선하고 노화된 ZnO NP 용량이 12, 15μg/mL로 증가하면 세포 생존율이 시간 의존적 감소 경향을 보였다. 분명히 노화 NP 처리군 세포 생존율이 신선 NP 처리군보다 유의미하게 높았다. 또한 ZnCl₂ 처리도 용량 및 시간 의존적으로 세포 생존율을 저해했으나, ZnCl₂ 세포독성은 신선하고 노화된 ZnO NP 모두보다 훨씬 낮았다.

신선 ZnO NP 처리가 아폽토시스 경로 활성화 및 아폽토시스 유전자 상향 조절

노화 NP의 낮은 세포독성 기저 메커니즘을 밝히기 위해 신선 및 노화 ZnO NP의 RNA 시퀀싱 데이터를 분석했다. 그림 4A, B에서 신선 ZnO NP 처리 후 주르캣 세포(p = 0.017)와 HMDM 세포(p = 0.041)에서 아폽토시스 경로가 활성화됨. 아폽토시스 유전자: ANXA1, CYLD, TNFSF10, IER3, CDKN1A, JUN, SAT1, PMAIP1, CD38, ISG20이 신선 ZnO NP 처리 주르캣 세포에서 유의미하게 풍부해졌다. 아폽토시스 유전자: CD38, TNFRSF12A, CCNA1, BMP2, PPP2R5B, EREG, IFNGR1, CD44, CD14, GNA15, GCH1, TIMP1, BTG2, IL1B, IL1A, BTG3, BCL2L11, SC5D, SPTAN1이 신선 ZnO NP 처리 HMDM 세포에서 유의미하게 풍부해졌다(그림 4C, D). 주르캣 세포(말초 혈액 T 림프구 세포)와 HMDM 세포(인간 단구 유래 대식세포)는 다른 종류의 세포이므로 아폽토시스 유발 방식이 다를 수 있다. 요약하면, 이 결과들은 신선 ZnO NP 노출이 다양한 세포에서 다른 아폽토시스 경로를 활성화할 수 있음을 보여준다.

노화 ZnO NP는 신선 ZnO NP처럼 아폽토시스 유전자 상향 조절하지 않음

노화 ZnO NP 처리 A_L 세포 RNA 시퀀싱 데이터에서 p53, PI3k-Akt, FoXO, 글루타티온, ErbB, HIF-1, 옥시토신, Jak-STAT 신호 경로가 풍부해짐(그림 5A). 주르캣 및 HMDM 세포에서 풍부해진 아폽토시스 유전자는 노화 ZnO NP 처리 세포에서 유의미하게 영향을 받지 않음(그림 5B). 발견을 추가 확인하기 위해 실시간 PCR로 관련 유전자 발현을 검사했다. 아폽토시스 유전자 중 일부: BMP2, PMAIP1, IL1α, CD69, CCNA1, CD38, IL1β가 노화 ZnO NP 처리 A_L 세포에서 검출되지 않음(데이터 미표시), 아마도 이들 유전자 대부분이 면역계 세포에서 발현되기 때문. 신선 ZnO NP 처리군에서 관찰된 다른 상향 조절 아폽토시스 유전자(IL1α, IL1β, CD59)는 노화 ZnO NP 처리로 발현 수준이 유의미하게 변하지 않음. 반면 양성 대조군인 MT1 발현 수준이 유의미하게 증가했으나, Caspase 3 발현은 유의미하게 변하지 않음(그림 5C). 이 데이터들은 노화 ZnO NP가 신선한 것과 달리 A_L 세포에서 아폽토시스 경로 유전자 활성화에 덜 강력함을 시사한다.

신선하지만 노화되지 않은 ZnO NP가 활성화된 카스파제 3 단백질 발현 증가

Caspase 3 유전자 발현 검출만으로는 아폽토시스 경로 활성화를 직접 나타낼 수 없다. ZnO NP 처리가 아폽토시스 단백질 수준을 변화시킬 수 있는지 추가 분석하기 위해, 세포 아폽토시스 활성화를 나타내는 일반적인 바이오마커인 절단된 카스파제 3 단백질 발현을 웨스턴 블로팅 분석으로 조사했다. 그림 6에서 대조군 대비 신선 ZnO NP(20nm) 처리가 세포 내 절단 카스파제 3 단백질 수준을 1.31 ± 0.023배 증가시켰으며, 이는 노화 20nm ZnO NP 처리군(1.12 ± 0.039배)보다 유의미하게 높았다. 신선 ZnO NP 입자 크기가 90-200nm로 증가했을 때 신선 NP에 의한 절단 카스파제 3 단백질 발현이 1.46 ± 0.078배 증가하여 노화 NP(1.07 ± 0.075배)보다 유의미하게 더 컸다. 이 데이터들은 신선 ZnO NP가 노화된 것보다 세포 아폽토시스 유도 힘이 더 강함을 추가로 입증했다.

논의

ZnO NP는 자연 노화 과정에서 Zn₅(CO₃)₂(OH)₆으로 물리화학적 변환을 겪으며 Zn²⁺를 방출한다고 보고되었다[23, 28]. 그러나 변형된(노화된) ZnO NP에 의한 세포독성과 기저 메커니즘은 불분명하다. 여기에서 신선 및 노화 ZnO NP 간 다양한 세포독성 메커니즘을 밝히기 위해 RNA 시퀀싱 분석과 RT-PCR 검사를 수행했다. 또한 세포 아폽토시스 핵심 실행자인 카스파제 3 단백질 수준을 조사하기 위해 웨스턴 블로팅을 적용했다.

우리 데이터는 노화 ZnO NP가 A_L 세포에서 신선 ZnO NP보다 훨씬 적은 세포독성을 유도함을 보였다. 본 연구에서 20nm 및 90-200nm 신선 ZnO NP의 LC₁₀₀은 15μg/mL 미만(그림 3)으로, 19-36nm ZnO NP의 NIH-3T3 또는 MSTO 세포에 대한 LC₁₀₀이 약 15μg/mL라는 이전 발견과 일치했다[29]. NP의 물리화학적 특성 환경 변환이 독성을 극적으로 변화시킬 수 있음을 확인했다. ZnO NP 황화 과정이 전하, 소수성, 응집 상태를 변화시켜 인간 타액, 땀, 기관지폐포 세척액에서 황화 상태 NP 흡착을 초래함이 보고되었다. ZnO NP에 흡착된 단백질이 특수 단백질 코로나를 형성하여 생물학적 효과에 영향을 미침[19]. 생리 식염수에 널리 존재하는 인산염이 ZnO NP를 약 5-10시간 내 준안정적 ZnHPO₄와 Zn₃(PO₄)₂로 전환시켜 소화관 상피 세포에 세포독성을 보임[20]. Ivask 등은 싱크로트론 방사선 XANES를 사용하여 인간 T 림프구 in vitro 노출 시스템(37°C, 10% FBS 함유 RPMI1640 배지, 24시간)에서 ZnO NP(≤3μg/mL) 완전 변환 발생을 입증했다. 변환 생성물의 스펙트럼과 세포독성은 ZnSO₄와 일치함[21]. 우리 결과는 ZnCl₂의 A_L 세포에 대한 용량 및 시간 의존적 독성을 보여주었으며, 그 세포독성은 신선 및 노화 ZnO NP 모두보다 훨씬 낮았다(그림 3). 이 관찰은 신선 ZnO NP 세포독성이 방출된 Zn²⁺에만 완전히 기인하지 않음을 추가로 설명한다[30].

우리 이전 연구도 노화 ZnO NP가 신선 ZnO NP보다 ROS(활성 산소 종) 유도 힘이 더 강하지만, 세포 살상 능력은 감쇠됨을 보였다[23]. 우리는 노화 ZnO NP에 의한 낮은 세포독성이 포유류 세포에서 더 잘 견딜 수 있을 것으로 추론한다. 현재 RNA 시퀀싱 데이터 연구는 아폽토시스 유전자가 신선 ZnO NP 처리 세포에서 상향 조절된 반면, 노화 NP 처리군에서는 훨씬 덜 영향을 받음을 보여주었다. IL1α와 IL1β는 인터루킨 1 사이토카인 패밀리 구성원이다. IL1α와 IL1β 방출은 카스파제 8 의존적 아폽토시스를 부분적으로 활성화한다[31]. CD69는 칼슘 의존적 렉틴 슈퍼패밀리 제2형 막관통 수용체 구성원을 인코딩한다. CD69 발현 증가는 아폽토시스 앤넥신 V와 CD95(Fas) 마커 발현 증가와 연관됨[32]. JUN은 AP-1 전사 인자 소단위체다. JUN 활성 증가는 알파-포드린을 단백질분해적으로 절단하며, 이는 인터루킨 1베타 전환 효소(ICE) 기질이자 시스테인 프로테아제 CED-3 패밀리 구성원으로, 추가로 프로그램된 세포 사멸을 유발함[33]. 이러한 아폽토시스 유전자 발현 증가는 신선 NP가 여러 다른 방식으로 아폽토시스를 유발함을 드러낸다. 이러한 아폽토시스 유전자 발현 상승 후 아폽토시스 과정은 결국 아폽토시스 단백질에 의해 실행된다(그림 7). 카스파제 3은 다양한 아폽토시스 시나리오의 핵심 프로테아제이며, 이 단백질 절단은 외부 및 내부 아폽토시스 경로 모두 활성화에 필요하다[34, 35]. 따라서 절단 카스파제 3 검출은 다양한 아폽토시스 신호에 의한 아폽토시스 식별을 위한 일반적인 방법이다[36]. 우리 웨스턴 블로팅 데이터는 20nm 및 90-200nm ZnO NP 모두에서 아치사량 노출이 모든 처리군에서 프로 카스파제 3 수준을 변화시키지 않았음을 보여주었다. 대조적으로 절단 카스파제 3은 신선 NP 처리에 의해 유의미하게 상승했으나, 노화 NP는 절단 카스파제 3 수준에 거의(또는 전혀) 영향을 미치지 않았다(그림 6). RNA 발현 분석과 결합하여, 우리 결과는 신선 ZnO NP가 세포 아폽토시스 유도 힘이 더 강함을 명확히 밝혔다.

결론

본 연구에서 초순수 내 ZnO NP의 자연 물리화학적 변환을 확인하고, 신선 및 노화 NP에 의한 세포독성 변이를 조사했다. 우리 노화 ZnO NP 처리 A_L 세포 RNA 시퀀싱 데이터와 데이터베이스의 신선 NP 데이터를 중심으로 분석했다. 노화 NP 처리군에서 특이적으로 풍부해진 신호 경로를 신선 NP 또는 ZnCl₂ 처리군과 비교했다. 우리 데이터는 노화 ZnO NP의 낮은 세포독성이 아폽토시스 유도 능력 감쇠와 밀접히 관련되며, NP에 의해 활성화된 다중 경로의 전사적 조절이 포유류 세포에서 세포 항상성 확립을 촉진함을 시사한다.