탄수화물-단백질 상호작용은 수정, 세포 신호 전달 또는 숙주-병원체 통신과 같은 기본적인 생물학적 과정을 매개합니다. 그러나 글리칸 인식 이벤트의 엄청난 복잡성으로 인해 최근 몇 년 동안 분석 또는 적용을 가능하게 하는 새로운 도구가 등장했습니다. 여기에서 우리는 표적 분자로 바이안테나리 N-글리칸 G0, 담체/모델 항원으로 오브알부민 및 이미징 프로브(G0-OVA-AuNCs)로 형광 금 코어를 포함하는 네오당단백질 기능화된 형광 금 나노클러스터의 첫 번째 준비를 설명합니다. 그 후, 우리는 식물 렉틴의 특이적 감지 및 수지상 세포의 시험관 내 이미징을 위해 생성된 G0-OVA-AuNC의 유용성을 보여줍니다.
10~100개의 금 원자로 형성된 금 나노클러스터(AuNC)는 매력적인 화학적 및 물리적 특성으로 인해 과학계의 주목을 받았습니다[1]. 3nm보다 작은 금 나노클러스터는 전자의 페르미 파장에 접근하여 크기 의존적 형광 방출을 일으키고 시험관 내 및 생체 내 적용을 위한 감지 및 이미징 프로브로서의 기회를 제공합니다[2,3,4]. 현재 형광 분석은 주로 로다민 또는 플루오레세인과 같은 유기 염료 또는 덜 일반적으로 양자점을 포함합니다[5,6,7]. 그러나 낮은 광화학적 안정성, pH에 민감한 형광성 또는 일부 유기 염료의 낮은 수용성 및 양자점의 독성으로 인해 사용이 손상될 수 있습니다[8]. 이러한 맥락에서, 금 나노클러스터는 위에서 언급한 한계가 없는 대안적인 초소형 형광단으로 간주될 수 있습니다. 또한, AuNC는 조직 투명도 창과 겹치기 때문에 생체 이미징에 매우 유리한 적색 가시광선에서 근적외선(IR) 영역으로의 큰 Stokes 이동 및 형광 방출 파장이 특징입니다[8,9,10].
금 나노클러스터의 단백질 보조 합성은 2009년 소혈청알부민(BSA)을 사용하여 처음 보고되었으며[11], 그 이후로 수용성 단백질 보호 나노클러스터는 나노과학에서 새로운 경향이 되었습니다[9, 12, 13]. AuNC의 제조를 위한 당단백질에 대한 관심은 훨씬 덜했으며[14] 합성 신당단백질로부터 AuNC 형성을 지지체로 설명하는 보고서를 알지 못합니다. 일반적으로 글리코실화는 접힘, 순환 수명 또는 안정성과 같은 당단백질의 물리화학적 특성을 조절합니다. 또한 수용체-리간드 인식과 같은 단백질의 중요한 생물학적 기능에 영향을 미칩니다. 따라서 신중하게 설계되고 특성화된 탄수화물[15]의 화학적 부착에 의한 단백질로부터 합성 신당단백질의 생성은 생물학적 응용을 위한 새로운 기능적 특성을 갖추게 할 수 있습니다. 탄수화물이 탄수화물 결합 단백질과의 상호작용을 통해 다양한 생물학적 과정에 참여하기 때문에[16, 17], 우리는 네오당단백질 금 나노클러스터를 시험관 내 및 생체 내 탄수화물 인식 이벤트를 연구하고 활용하기 위한 새로운 프로브로 생각합니다[18]. 이와 관련하여 단백질 표면에 여러 글리칸 사본이 존재하면 탄수화물의 다가 표현이 제공되어 결합 친화도가 향상됩니다.
여기, 우리는 식물 렉틴에 대한 감지 프로브 및 수지상 세포(DC)의 시험관 내 이미징을 위한 렉틴 수용체의 표적화 시약으로서 자가 형광 신당단백질 기능화된 AuNC의 사용을 탐구합니다. 렉틴은 다양한 생물학적 인식 현상을 돕는 탄수화물 결합 단백질입니다. 예를 들어 고등 식물에서 렉틴은 외래 당단백질의 인식 및 응집을 통해 식물을 먹는 유기체의 성장과 증식을 억제합니다[19]. 반면에 포유동물의 DC에서는 C형 렉틴 수용체(CLR)가 세포 표면에서 발현되어 병원체 인식에 중요한 역할을 합니다[20]. 글리칸으로 장식된 항원은 특정 CLR에 의해 인식되어 추가로 세포내이입되고 처리되며 결국 특정 면역 반응을 유도하는 T 세포에 제공됩니다. 우리의 이전 연구에서 우리는 합성 바이안테나리 GlcNAc 종결 N-글리칸 G0를 사용한 모델 항원인 오브알부민(OVA)의 기능화가 DC에 대한 표적화 및 후속 항원 흡수 및 제시를 향상시킨다는 것을 보여주었다[21]. 우리는 위에서 언급한 현상이 G0 글리칸과 DC 표면에 발현되는 세포내이입 C-형 렉틴 수용체의 상호작용에 의해 시작된다고 가정했습니다. 결과적으로, 우리는 형광 및 다가 G0-OVA 금 나노클러스터가 이전 연구에서 적용된 형광 표지된 G0-OVA의 대안이 될 수 있고 DC 시각화를 위한 새로운 도구로 사용될 수 있다고 믿습니다. 더욱이, 강력한 T 세포 면역 반응의 개시를 가능하게 하는 DC의 글리칸 매개 표적화는 백신 후보의 효능을 향상시키는 데 사용될 수 있다[22,23,24]. 이 초기 연구에서 우리는 네오당단백질에서 시작하는 금 나노클러스터의 합성과 렉틴 응집 실험을 사용하여 G0 글리칸의 기능 및 접근성에 대한 평가를 제시할 것입니다. 마지막으로 우리는 수지상 세포 이미징을 위한 형광 금 나노클러스터의 잠재력을 보여줄 것입니다.
우리는 결합되지 않은 OVA 단백질을 사용한 이전 보고서를 기반으로 G0 글리칸(G0-OVA-AuNC)으로 장식된 오브알부민 금 나노클러스터의 합성을 최적화했습니다[25, 26]. 단백질 보호 AuNC는 금 테트라클로로금(III) 산(HAuCl4 . 3H2 O) 단백질 용액, 그 다음 1M 수산화나트륨 수용액. 반응 pH의 증가는 OVA에 존재하는 트립토판 및 티로신 잔기의 환원 가능성을 향상시킵니다(그림 1a)[14]. 단백질 스캐폴드는 환원제 및 안정화 시약으로 작용하여 단백질 구조 내부에 작은 금 클러스터를 가두어 환경에서 분리합니다. 형광성 OVA-AuNC의 합성을 위한 이전 프로토콜에는 고농축 OVA 용액이 필요했습니다(최대 65mg mL −1 ) [25]. AuNC의 제조를 위한 유용한 OVA 신당접합체의 사용을 제한하기 위해 우리는 OVA-AuNC를 효율적으로 생성할 수 있는 접합되지 않은 OVA의 최소량을 결정했습니다. OVA 농도가 15mg mL −1 인 것을 발견했습니다. 강력한 형광 방출로 클러스터를 생성하기에 충분했습니다(추가 파일 1:그림 S1). OVA-AuNC의 형성은 반응 시간을 18시간에서 6분으로 단축하는 마이크로파 조사에 의해 상당히 가속화되었습니다[25]. 또한, 마이크로파 조사는 균일하고 단분산 클러스터의 형성을 선호하는 용액에 균일한 가열을 제공했습니다[1]. 이러한 방식으로 제조된 OVA-AuNC는 옅은 갈색을 나타내며 UV 조명 아래에서 강한 적색 형광을 방출합니다(그림 1b). OVA-AuNC의 UV-Vis 스펙트럼은 5nm보다 큰 금 나노입자가 없음을 시사하는 국부적인 표면 플라즈몬 공명 밴드에 해당하는 흡광도가 부족하며 [27] 이는 투과 전자 현미경(TEM)에 의해 추가로 확인되었습니다. 우리는 1.9 ± 0.7nm 범위에서 OVA-AuNCs 금 코어의 평균 직경을 측정했습니다(추가 파일 1:그림 S2). 마지막으로 OVA-AuNC의 평균 유체역학적 크기는 8.7nm ± 2.5nm로 동적 광산란에 의해 지정되었습니다(추가 파일 1:그림 S2). OVA(6.5~7nm 직경[28])와 유사한 크기 범위는 금 코어당 단일 단백질 분자의 존재를 시사합니다. 아가로스 겔 전기 영동에 의한 OVA-AuNC의 추가 분석은 OVA 및 OVA-AuNC에 대해 양극을 향한 유사한 이동성을 보여 두 종에 대해 유사한 크기와 중성 pH에서 음전하를 추가로 확인시켜줍니다(그림 1c). OVA-AuNC의 형광 방출 스펙트럼은 350 nm에서 여기 시 λ 670 nm에서 최대 방출 피크를 보여줍니다(그림 1d). AuNC의 여기 스펙트럼은 넓고 Stokes는 크게 이동합니다(200nm 이상). 이는 청색 방출 Alexa Fluor® 405 염료와 같은 유사한 여기 파장을 특징으로 하는 다른 형광 프로브(다중화)가 있는 경우 스펙트럼 다색 검출 응용 분야에 이상적입니다. [26]. OVA-AuNC의 양자 수율(QY)은 0.1M NaOH(QY =≈ 92%)의 플루오레세인이 참조 표준으로 사용될 때 ≈ 4%로 계산되었습니다[29]. 금 코어의 산화 상태는 X선 광전자 분광법(XPS) 측정을 기반으로 Au(I) 및 Au(0) 종의 혼합물에 지정되었습니다(추가 파일 1:그림 S3)[11, 30]. 단백질 2차 구조 원형 이색성(CD)에 대한 연구는 AuNC에서 OVA에 대한 고유 접힘의 손실을 시사하는 무작위 코일 조직을 밝혀냈는데 아마도 합성 중 가혹한 알칼리성 조건으로 인한 것일 수 있습니다(추가 파일 1:그림 S4) [31]. 마지막으로, 우리는 또한 시험관 세포 배양에 가장 일반적으로 사용되는 혈청 보충제인 FBS(소태아 혈청)를 함유한 용액뿐만 아니라 광범위한 pH(3-11) 내에서 OVA-AuNC의 놀라운 안정성을 관찰했습니다. (추가 파일 1:그림 S5). OVA 금 나노클러스터의 이러한 기능은 시험관 내 및 생체 내 생물학적 분석에 대한 유용성을 강조하고 흥미진진한 새로운 응용 분야를 열어줍니다. 예를 들어, OVA-AuNC의 pH에 둔감한 형광 방출은 약산성 pH를 특징으로 하는 엔도솜 구획 내부에서도 신호 손실 없이 세포 내부의 효율적인 입자 추적을 허용할 수 있습니다[32, 33]. 반대로, 이러한 조건에서는 이러한 염료의 최대 형광 방출이 염기성 pH에서 달성되기 때문에 특정 플루오레세인 접합체의 사용이 손상될 수 있습니다. OVA-AuNC는 또한 물과 세포 성장 배지 모두에서 우수한 용해도를 보였다. OVA-AuNC의 완전한 가용화는 물과 세포 성장 배지 모두에서 최대 40mg/mL 농도까지 관찰되었습니다. (추가 파일 1:그림 S6). 다양한 OVA-AuNCs 희석액에서 형광 방출 스펙트럼을 측정하고 37°C에서 최대 24시간 동안 인큐베이션한 상태에서 안정적인 것으로 조사되었습니다.
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아 OVA-AuNCs 합성의 도식적 표현. ㄴ OVA(파란색 선) 및 OVA-AuNC(주황색 선)의 UV 가시 스펙트럼. 삽입:OVA-AuNC의 이미지(a ) 및 OVA(b ) 가시광 조명 아래(왼쪽) 및 UV 조명 조명(365nm) 아래(오른쪽) ㄷ OVA(Coomassie Blue G-250으로 염색) 및 OVA-AuNC(UV 조명 조명 하에서)의 아가로스 겔 전기영동. d OVA-AuNC의 형광 여기(녹색 선) 및 방출(분홍색 선) 스펙트럼
G0-OVA 신당단백질 보호 AuNC의 합성을 위해 우리는 처음에 G0 기능화된 OVA 신당단백질을 준비했습니다. C5 아미노 링커가 장착된 바이안테나리 N-글리칸 G0는 이전에 설명한 대로 합성되었으며[34], OVA와의 접합은 가교 시약으로 디숙신이미딜 수베레이트 에스테르(DSS)를 사용하여 달성되었습니다(그림 2a)[21, 35]. 간단히 말해서, 접합은 2단계 반응으로 수행됩니다. N-글리칸 G0는 13배 과량의 DSS 링커로 기능화된 다음 OVA의 유리 아미노기에 커플링됩니다. 글리칸/단백질 비율을 제어함으로써 OVA 치환 정도를 효과적으로 조정할 수 있었습니다(SI 참조). 네오당단백질의 성공적인 형성은 SDS-PAGE 겔에서 전기영동적으로 더 느린 확산 밴드의 출현에 의해 확인된 반면(그림 2b), 도입된 글리칸의 평균 수는 MALDI-TOF 질량 분석에 의해 추가로 결정되었습니다[21](그림 2b). 2c). 이 전략에 따라 우리는 단백질당 N-글리칸 G0의 2–3, 3–4 및 5–6 복사본을 표시하는 OVA 네오글리코컨쥬게이트를 생성했습니다.
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아 G0-OVA 네오당접합체(n =원자가). ㄴ 다른 원자가의 N-글리칸 G0를 함유하는 OVA 및 G0-OVA 신당단백질의 SDS-PAGE 겔 전기영동. ㄷ 다른 원자가의 N-글리칸 G0를 포함하는 OVA 및 G0-OVA 네오당단백질의 MALDI-TOF 질량 스펙트럼
다음으로, 우리는 이전에 최적화된 조건에서 AuNC(그림 3a)의 준비에 합성 신당단백질을 사용하고 클러스터의 물리적 및 광학적 특성에 대한 글리칸 기능화 및 그 원자가의 효과를 조사했습니다. 그림 3에서 볼 수 있듯이 G0-OVA-AuNC의 흡수 UV-Vis 및 형광 방출은 278 nm에서 특징적인 흡광도와 최대 약 670 nm에서 적색 형광 방출을 갖는 OVA-AuNC와 동일했습니다(그림 3b, c).
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아 G0 글리칸 유래 OVA-AuNC 합성의 도식적 표현. ㄴ G0-OVA-AuNC(파란색, 주황색 및 녹색 선)와 OVA-AuNC(분홍색 선)의 형광 방출 스펙트럼. ㄷ G0-OVA-AuNC(파란색, 주황색 및 녹색 선) 및 OVA-AuNC(분홍색 선)의 UV 가시 스펙트럼
또한 TEM 측정을 통해 G0-OVA-AuNC 코어에 대해 1.6 ± 0.5nm의 평균 직경을 설정했습니다(그림 4). 이는 OVA-AuNC의 크기(1.9 ± 0.7nm)와 비슷합니다. 따라서 우리의 결과에 기초하여 라이신 잔기 또는 N-말단을 통해 OVA에 접합된 글리칸은 테스트된 원자가에서 당단백질의 전체 환원 가능성 및 추가 클러스터 형성에 영향을 미치지 않는다고 생각합니다[36]. 또한, 당은 단백질의 시스테인 그룹과 금 코어 사이의 클러스터 안정화 Au(I) 티올레이트 중합체[37, 38]의 형성을 방해하지 않는 것으로 보입니다. 심지어 더 많은 수(5-6개 사본)가 존재하는 경우에도 마찬가지입니다.
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G0-OVA-AuNC의 TEM 이미지(3/4). 삽입:G0-OVA-AuNC(3/4)의 금 코어 직경의 크기 분포
마지막으로, OVA-AuNCs와 유사한 방식으로 G0-OVA-AuNCs(3/4) 단백질의 2차 구조가 CD에 의해 지정되었고 무작위 코일 조직이 드러났습니다(추가 파일 1:그림 S4). 그러나 AuNC의 단백질 스캐폴드에 글리칸을 부착함으로써 탄수화물 결합 단백질과 상호작용할 수 있는 표적 분자를 도입하고 동시에 OVA 단백질은 구조적 변화가 렉틴 인식을 변경하지 않는 운반체로만 남아 있습니다. 전체 시스템. 생쥐에서 항체 생산과 T 세포 활성화에서 변성 OVA의 항원 능력이 설명되었습니다. T 세포의 활성화는 천연 OVA와 변성 OVA 모두에 존재하는 특정 아미노산 서열의 인식을 통해 매개되기 때문에 항원 2차 구조와 무관합니다[40]. 사실, 항원 OVA 323-339 펩타이드는 OVA에 대한 주요 특이적 T 세포 반응을 설명하며 이 펩타이드는 면역 반응을 유도하기 위해 나노입자에 사용되었습니다[41].
네오당단백질 보호 금 나노클러스터에 새로 도입된 글리칸 사슬의 기능을 조사하기 위해 응집 실험에서 서로 다른 식물 렉틴과의 상호 작용을 조사했습니다. G0-OVA-AuNC 및 OVA-AuNC의 배양을 두 가지 다른 식물 렉틴, 즉 말단 GlcNAc 부분에 특이적인 Bandeiraea simplicifolia lectin-II(BSL-II) 및 Solanum tuberosum과 함께 수행했습니다. N-글리칸에 존재하는 핵심 키토비오스를 인식하는 렉틴(STL) [34, 42]. 또한 G0-OVA-AuNC와 렉틴 간의 비특이적 상호작용을 제거하기 위해 Aleuria aurantia L-fucose에 특이적인 lectin(AAL)이 대조군으로 포함되었습니다. 우리는 G0-OVA-AuNCs(5/6) 용액에 BSL-II, STL 및 AAL 렉틴의 농도를 증가시켰습니다. 암실에서 인큐베이션한 후, 용액을 원심분리하고 상청액의 형광을 측정하였다. 그림 5에서 볼 수 있듯이 BSL-II 및 STL과 함께 인큐베이션한 후 농도 의존적으로 형광 강도의 감소를 관찰할 수 있었습니다(그림 5a-d). 반면 AAL 존재에서는 형광 강도가 변하지 않았습니다(그림 5a-d). 5e). G0-OVA-AuNCs(5/6)를 STL과 함께 배양한 후 UV 램프 조사에서는 가시적인 침전물이 관찰되었지만 AAL과 함께 배양했을 때 침전물은 나타나지 않았습니다(그림 5f). 초기 형광 값(F0)과 렉틴 배양 후 최종 값(F)의 관계는 증가하는 렉틴 농도에 대해 나타내었다(그림 5b, d). G0-OVA-AuNC(5/6)와의 STL 상호작용은 0~7.5μM의 선형성을 보여주었으며 검출 한계는 방정식 SD*3/S에 따라 계산되었습니다(여기서 SD는 보정 곡선의 표준 편차이고 에 기울기 값) [12, 13] 2.35μM(y) =1.95x + 0.4266, R 2 =0.97). 같은 방식으로 BSL-II와 G0-OVA-AuNC(5/6)의 상호작용은 0~10μM의 선형성을 보였고 검출 한계(LOD)는 2.83μM(y =0.5687x + 0.5838, R 2 =0.965). 흥미롭게도, G0-OVA-AuNCs(2/3)(추가 파일 1:그림 S7, AB)와 같은 더 적은 수의 접합된 당을 포함하는 클러스터는 BSL-II 및 STL을 추가할 때 형광 강도의 유의한 변화를 나타내지 않았으며, 이는 응집력 부족. 이 거동은 글리칸 밀도의 작은 차이만 적용되는 경우에도 렉틴의 가교 활성에 대한 글리칸의 다가 제시의 중요한 효과를 강조합니다. 중요하게는, 렉틴과 함께 배양된 비접합 OVA-AuNC의 형광 방출 강도의 변화가 관찰되지 않았습니다(추가 파일 1:그림 S7, C-D). 토종 닭 OVA가 높은 만노오스 또는 덜 풍부한 하이브리드 및 복합형 N-글리칸으로 주로 치환된 단일 N-연결된 글리코실화 부위(Asn-292)를 포함하더라도[43], 이러한 당 변형은 STL 또는 BSL-II에 의해 인식되지 않습니다. , 아마도 1가 표시 때문일 것입니다. 이것은 G0-OVA-AuNC에 화학적으로 도입된 G0와 STL/BSL-II 사이의 특정 탄수화물-렉틴 상호작용의 존재를 확인하고 OVA-AuNC의 렉틴에 대한 비특이적 결합을 배제했습니다. 우리는 탄수화물 결합 단백질 바이오마커의 검출을 위해 이 시스템의 가능한 적용을 예상합니다. 그럼에도 불구하고, 많은 수의 글리칸 사본을 표시하는 신당단백질의 준비는 검출 한계를 개선하는 원하는 렉틴에 대한 구성체의 결합력을 증가시킬 것입니다[44].
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G0-OVA-AuNC의 렉틴 응집 분석(5/6). 아 BSL-II와 배양 후 OVA-G0(5/6)-AuNCs 용액의 상층액의 대표적인 형광 스펙트럼. ㄴ BSL-II의 농도 증가에 대한 F0/F의 표현. ㄷ STL과 함께 배양 후 OVA-G0(5/6)-AuNCs 용액의 상층액의 대표적인 형광 스펙트럼. d 증가하는 STL 농도에 대한 F0/F의 표현. 이 AAL과 함께 배양 후 OVA-G0(5/6)-AuNCs의 상층액의 대표적인 형광 스펙트럼. 에 UV 조명 조명(365nm)에서 AAL 및 STL과 함께 G0-OVA-AuNC(5/6)의 배양에 해당하는 이미지. STL과 함께 인큐베이션한 후 가시적인 침전물이 형성되었습니다. 오른쪽:G0-OVA-AuNC와 식물 렉틴 간의 결합에 대한 개략도
우리는 또한 탄수화물 단백질 상호 작용에서 배지 구성 요소의 가능한 효과를 구별하기 위해 세포 성장 배지가있는 상태에서 G0-OVA-AuNC (5/6)와 STL의 상호 작용을 연구했습니다. G0-OVA-AuNC(5/6)를 송아지 태아 혈청이 보충된 완전한 Iscove의 변형 Dulbecco 배지(IMDM)에 용해시키고 STL의 양을 증가시키면서 배양했습니다. 생성된 용액을 아가로스 겔 전기영동으로 분석하였다. (추가 파일 1:그림 S8). G0-OVA-AuNC(5/6)의 전기영동 이동성은 물과 복합 매질 모두에서 유지됩니다. 그럼에도 불구하고, 증가하는 양의 STL이 존재하는 경우, 복잡한 세포 배지의 존재하에서도 단백질 탄수화물 상호작용을 강조하는 음극으로 G0-OVA-AuNC(5/6)의 용량 의존적 변위가 있었습니다. 이는 G0-OVA-AuNC(5/6)와의 단백질 탄수화물 상호작용이 배지 성분의 존재에 의해 방해받지 않는다는 것을 나타냅니다.
형광 이미징을 위한 클러스터의 잠재력과 G0-OVA 신당단백질[21]에 의한 DC 표적화의 이전 성공은 우리가 시험관 내 쥐 DC에 의한 흡수에서 G0-OVA-AuNC를 연구하도록 장려했습니다. 우리는 자기 형광 G0-OVA-AuNCs(3/4)의 내재화를 시각화하기 위해 공초점 형광 현미경을 사용했습니다. C57BL/6J 마우스 및 CD11c + 에서 비장 DC를 분리했습니다. 개체군을 자기 활성화 세포 분류(MACS)(추가 파일 1:그림 S9)로 정제하고 밤새 폴리-d-리신 코팅 유리 커버 슬립에 접종했습니다. 개념 증명으로 정제된 DC를 G0-OVA-AuNC(3/4)와 함께 배양하고 세척하여 결합되지 않은 물질을 제거하고 고정했습니다. 배양 40분 후 공초점 형광 현미경 이미지가 획득되었으며(그림 6) G0-OVA-AuNC(3/4)와 함께 배양된 수지상 세포에서 강력한 형광을 관찰하여 효과적인 내재화(그림 6a)와 형광 부족을 보여줍니다. 음성 대조군(자극되지 않은 CD11 + 세포; 추가 파일 1:그림 S9). 나노클러스터의 내재화는 Z -축(z-스택) 및 단일 DC의 3D 이미지를 재구성하여 세포 내부에서 나오는 형광 방출을 시각화합니다(그림 6b 및 추가 파일 1:그림 S10).
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공초점 현미경으로 측정한 쥐 DC에 의한 G0-OVA-AuNC(3/4)의 흡수. 아 CD11c + 의 대표 이미지 G0-OVA-AuNC(3/4)와 배양 후 세포. ㄴ 세포 내부의 G0-OVA-AuNC의 흡수를 나타내는 단일 수지상 세포의 Z 스택 이미지
요약하면, 우리는 응집 실험 및 DC 흡수 분석에 사용된 신당단백질 보호 금 나노클러스터를 준비하고 특성화했습니다. 특정 식물 렉틴 감지의 예에서 우리는 탄수화물-단백질 상호작용 분석을 위한 G0-OVA-AuNC의 유용성을 입증했습니다. 우리는 또한 형광 현미경으로 수지상 세포의 시험관 내 이미징을 보여주었습니다. 그러나 먼저 DC에 의한 나노클러스터 흡수에서 글리칸의 역할을 더 잘 이해하기 위해(예:세포 구획에서 나노클러스터의 국소화를 따라) 두 번째로, 생체 및 세포 적합성을 연구하기 위해 추가 실험을 수행해야 합니다. G0 글리칸의 표적화 특성과 DC에 의한 G0-OVA 흡수 증가를 설명하는 이전 결과를 바탕으로, 우리는 G0-OVA-AuNC가 형광 표지된 신당단백질에 대한 매력적인 대안이 될 수 있다고 믿습니다.
결론적으로, 이 초기 연구에서 우리는 네오당단백질로 보호된 금 나노클러스터의 첫 번째 합성과 비접합 단백질 클러스터와 비교한 물리적 및 광학적 특성의 평가를 제시합니다. 우리는 식물 렉틴과의 특정 상호 작용에 의해 응집 분석에서 AuNC에 대한 설탕 G0의 접근성을 확인했으며, 이는 렉틴의 효과적인 가교 활성을 위한 최소 글리칸 밀도의 중요성을 추가로 강조했습니다. 개념 증명으로 우리는 또한 모델 뮤린 DC의 이미징에서 G0-OVA-AuNC의 적합성을 입증했습니다.
우리는 자가 형광 신당단백질 기능화된 AuNC가 탄수화물-단백질 상호작용의 분석 및 적용을 가능하게 하는 매력적인 도구가 될 수 있다고 믿습니다. 큰 Stokes 이동, 수용성 또는 pH 안정성과 같은 고유한 물리적 및 화학적 특성을 기반으로 하는 G0-OVA-AuNC는 유기 염료 라벨의 대안이 될 수 있으며 DC 시각화, 탄수화물 매개 흡수 연구 및 식물에 사용될 수 있습니다. 렉틴 감지. 마지막으로, 글리칸의 부착을 위해 OVA와 같은 면역원성 운반체를 사용함으로써 신당단백질 기능화된 금 나노클러스터는 항원 흡수, 처리 및 제시에 대한 심층 연구를 가능하게 할 뿐만 아니라 미래에 형광 치료제 또는 보조 분자.
모든 용액은 Diamond UV 정수 시스템(Branstead International, IA, Madrid, Spain)의 나노순수(18MΩcm)에서 준비했습니다. AuNC의 준비에 사용된 모든 유리 제품은 이전에 왕수 용액(HNO3 :HCl, 1:3, v /v ) 및 나노순수로 광범위하게 헹구었다. 금(III) 염화물 삼수화물, 수산화나트륨 및 트리에틸아민은 Sigma Aldrich에서 구입했습니다. LPS가 없는 오브알부민은 Hyglos(독일 Bernried)에서 구입했습니다. 디숙신이미딜 수베레이트(DSS) 및 DMSO는 Thermo Fisher Scientific에서 구입했습니다. N-글리칸 G0는 이전에 설명한 대로 화학적으로 합성되었습니다[21].
OVA 또는 네오당단백질의 교반 용액에(15mg mL −1 ) 나노순수, HAuCl4의 0.1M 수용액 ·3H2 O(4.2mM, 최종 농도)를 적가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 5분 동안 교반하고 1M NaOH 수용액(150mM 최종 농도)을 적가하여 혼합물의 pH를 증가시켰다. 생성된 용액을 Biotage® Initiator 마이크로웨이브 반응기에서 6분 동안 100°C에서 인큐베이션했습니다. AuNC의 투석은 Thermo Fisher Scientific의 Slide-Z-lyser TM 투석 카세트(10K MWCO)에서 나노순수를 사용하여 수행되었습니다.
ScanIt 소프트웨어로 작동하는 λ 350nm에서 여기 파장을 가진 Varioskan Flashmicroplate 리더(Thermo Scientific)에서 Nunc™ 96-웰 폴리스티렌 블랙 플레이트를 사용하여 합성된 OVA 및 네오당단백질 보호 AuNC의 형광 방출 스펙트럼을 측정했습니다.
OVA-AuNC 및 OVA 단백질의 아가로스 겔 전기영동은 0.75% 아가로스 겔에서 80V에서 30분 동안 수행되었습니다. OVA로 보호된 AuNC의 시각화는 UV 광 조사(365nm)에서 수행되었으며 OVA 단백질은 Coomassie Blue G-250으로 염색되었습니다.
TEM 이미징은 200kV의 가속 전압으로 JOEL JEM-2100F 전계 방출 TEM에서 수행되었습니다. AuNC 솔루션은 초박형 탄소 지지체(Ted Pella, Redding, USA)로 코팅된 구리 TEM 그리드에 드롭 캐스트되었습니다. ImageJ(Java)를 사용하여 금 나노클러스터의 평균 직경을 정량화했습니다.
G0-OVA-AuNC 10마이크로리터(5/6)[0.2mg mL −1 ] TSM 완충액(20mM Tris·HCl, 150mM NaCl, 2mM CaCl2 , 2mM MgCl2 , pH =.4)를 Nunc™ 384-웰 폴리스티렌 블랙 플레이트에 놓았다. 그 후, 10μL의 Aleuria aurantia 렉틴(AAL), 솔라늄 튜베로섬 렉틴(STL) 및 TSM 완충액의 Bandeiraea simplicifolia lectin-II(BSL-II)를 첨가하여 최종 단백질 농도가 0, 2.5, 5, 7.5, 10μM이 되었습니다. 상응하는 용액을 어두운 곳에서 부드러운 진탕 하에 밤새 인큐베이션하였다. 단백질 용액을 11,000g에서 1시간 동안 원심분리하고 상층액의 형광 방출 스펙트럼을 λ 350nm에서 여기 파장으로 Varioskan Flash 마이크로플레이트 판독기(Thermo Scientific)로 기록했습니다. AuNCs-렉틴 복합체 형성시 침전을 관찰하기 위해 대조 실험을 수행하였다. 그런 다음 10μL의 G0-OVA-AuNC(5/6)[0.2mg mL −1 ]를 10μL의 AAL 및 STL[40μM]과 함께 1시간 동안 인큐베이션한 후 11,000g(1시간)에서 원심분리했습니다. 이미지는 UV 광 조사(365nm)에서 촬영되었습니다.
모든 실험에 사용된 쥐의 수지상 세포는 Charles River(CIC biomaGUNE, San Sebastian, Spain)에서 사육한 C57BL/6J 마우스에서 분리되었습니다. 동물 실험 프로토콜은 CIC biomaGUNE의 동물 윤리 위원회의 승인을 받았으며 동물 윤리 및 복지에 관한 유럽 연합의 ARRIVE 지침 및 지침에 따라 수행되었습니다. 마우스를 기존의 사육 환경(22 ± 2 °C, 55 ± 10% 습도, 12시간 주야 주기)에서 유지하고 표준 식단을 임의로 먹였습니다. 마우스를 100% O2 중 2.5% 이소플루란으로 마취했습니다. 경추 탈구로 안락사됨.
C57BL/6J 마우스(n =3, 여성, 생후 27~28주). 비장 세포를 분리하기 위해 2mM l-글루타민, 100U/mL 페니실린, 100μg/mL 스트렙토마이신 및 10% 송아지 태아 혈청(FCS, PAN Biotech)이 보충된 Iscove의 변형 Dulbecco 배지(IMDM)로 비장을 세척했습니다. 세포 현탁액을 차갑게 유지하고 40μm 세포 여과기를 통해 여과하여 세포 응집체를 제거했습니다. 원심분리(300g, 5분, 4°C) 후, 세포 펠릿을 새로 준비된 적혈구 용해 완충액(10% 100mM Tris pH 7.5 + 90% 160mM NH4) 5mL에 재현탁했습니다. Cl), 부드럽게 혼합하고 실온에서 2분 동안 배양합니다. 세포를 완전한 IMDM 배지에서 2회 세척하고 MACS 완충액(PBS, 0.5% BSA, 2mM EDTA)에 재현탁하기 전에 원심분리했습니다. 수지상 세포(CD11c + 세포)를 CD11c + 를 사용한 자기 활성화 세포 분류에 의해 C57BL/6 쥐 비장 세포 현탁액에서 분리했습니다. MicroBeads(밀테니). 자기 마이크로비드와 함께 인큐베이션된 세포를 자기장에 배치된 MACS 컬럼에 로딩하였다. 결합되지 않은 세포는 컬럼을 통과하고 나머지 CD11c + 세포를 MACS 완충액으로 세척하고 컬럼에서 용리시켰다. DC 순도를 높이기 위해 CD11c + 세포 정제를 반복하였다. 세포 현탁액을 원심분리하고 IMDM 완전 배지에 재현탁하고 계수했습니다.
CD11c + cells from C57BL/6J mice (2 × 10 6 cells) were seeded on poly-d-lysine-coated glass cover-slips overnight. G0-OVA-AuNCs (3/4) were added to cells (150 μg mL −1 ) and incubated for 40 min at 37 °C. After incubation, cells were carefully washed with cooled PBS and fixed with 3% paraformaldehyde at RT for 20 min. After washing with PBS and water, the cover-slips were mounted on slides using Vectashield® mounting medium. Fluorescent images were taken using the Zeiss LSM 510 laser scanning confocal microscope (Carl Zeiss) equipped with a UV laser (365 nm) and × 63 oil immersion objective.
Aleuria aurantia lectin
Gold nanoclusters
Bovine serum albumin
Bandeiraea simplicifolia lectin-II
Circular dichroism
C-type lectin receptors
Dendritic cells
Dimethyl sulfoxide
Disuccinimidyl suberate ester
Fetal bovine serum
Biantennary N-glycan
Neoglycoprotein functionalized gold nanoclusters
Gold tetrachloroauric (III) acid
Iscove’s modified Dulbecco’s medium
적외선
Limit of detection
Magnetic-activated cell separation
Ovalbumin
Quantum yield
Solanum tuberosum lectin
투과전자현미경
X선 광전자 분광법
나노물질
초록 나노기술은 과학의 모든 분야에서 중요한 응용으로 가장 유망한 연구 분야가 되었습니다. 최근 몇 년 동안, 산화주석은 나노미터 범위에서 이 물질의 합성으로 개선된 매혹적인 특성으로 인해 엄청난 주목을 받았습니다. 오늘날 주석 산화물 나노 입자를 생산하기 위해 수많은 물리적 및 화학적 방법이 사용됩니다. 그러나 이러한 방법은 고가이고 높은 에너지를 필요로 하며 합성 과정에서 다양한 유독성 화학물질을 사용한다. 인간의 건강 및 환경적 영향과 관련된 증가된 우려는 생산을 위한 비용 효율적이고 환경 친화적인 공정의 개발로 이어졌습니다
초록 그래핀 너머의 2차원(2D) 반도체는 가장 얇고 안정적인 알려진 나노물질을 나타냅니다. 21세기의 지난 10년 동안 제품군과 애플리케이션의 급속한 성장은 첨단 나노 및 광전자 기술에 전례 없는 기회를 가져왔습니다. 이 기사에서는 개발된 2D 나노 물질에 대한 최신 연구 결과를 검토합니다. 이러한 2차원 나노물질 및 이종구조의 고급 합성 기술을 요약하고 새로운 응용에 대해 논의했습니다. 제작 기술에는 최신 2D 반도체의 화학 기상 증착(CVD), 원자층 증착(ALD)에 특히 중점을 두고 비정질 및 결정질 2D 나노물질을 모두
