프러시안 블루 나노입자 표지 중간엽 줄기세포:시험관 내 세포 생존, 증식, 이동, 분화, 세포골격 및 단백질 발현 평가

방법

세포 배양

마우스 MSC C3H10T1/2는 Nanjing KeyGen Biotech에서 입수했습니다. Inc. 세포는 37°C, 5% CO에서 10% 소 태아 혈청(FBS, 이스라엘) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신(Hyclone, USA)이 보충된 Dulbecco의 변형된 Eagle 배지(DMEM; Hyclone, USA)에서 배양되었습니다.>2 포화, 배지는 3일마다 변경되었습니다. 4회 계대 후 세포를 실험에 사용했습니다.

PBNP 준비

일반적인 합성에서 2.5mmol의 구연산(490mg)을 먼저 20mL의 1.0mM 수성 FeCl₃에 첨가했습니다. 60°C에서 교반 중인 용액. 이 용액에 20mL 1.0mM 수성 K₄를 적가했습니다. [Fe(CN)₆ ] 60°C에서 0.5mmol의 구연산(98mg)을 포함하는 용액. 맑고 밝은 파란색 분산액이 즉시 형성되었습니다. 30분 후, 용액을 실온으로 냉각하고 실온에서 추가로 5분 동안 계속 교반했습니다. 그런 다음, 동량의 에틸 알코올을 분산액에 첨가하고 10,000rpm에서 20분 동안 원심분리하여 나노 입자의 펠렛을 형성했습니다. 후자는 동일한 부피의 에틸 알코올을 첨가하고 원심분리하여 다시 분리되었습니다.

PBNP의 특성

합성된 PBNP의 적외선 분광법은 적외선 분광광도계(IR; Thermo Fisher Nicolet IS10)를 사용하여 측정하였다. 합성된 PBNP의 형태를 투과전자현미경(TEM; JEM 2100F)으로 조사하였다. 진동 샘플 자력계(VSM; Lakeshore 7307)를 사용하여 PBNP의 필드 종속 자화를 연구했습니다. Bruker D8 ADVANCE A25X(XRD)를 사용하여 X선 회절(XRD) 분석을 수행했습니다. PBNP의 다분산 지수는 Zetasizer Nano ZS에 의해 결정되었습니다.

PBNP의 세포내 분포 및 표지된 C3H10T1/2 세포의 미세구조

투과 전자 현미경(TEM)은 PBNP의 세포 내 분포를 평가하기 위해 수행되었습니다. 배지를 제거한 후, 세포를 PBS로 헹군 다음 0.25% 트립신으로 분해하였다. 그런 다음 세포를 1.5mL EP 튜브로 옮겨 원심분리했습니다(2000rpm, 5분). 그 후 상층액을 제거하고 0.25% 글루타르알데히드와 1% 오스뮴산으로 세포를 고정하였다. 세포를 다시 헹군 후 세포를 50% 에탄올, 70% 에탄올, 90% 에탄올, 90% 아세톤, 100% 아세톤에서 각각 20분씩 탈수하였다. 그런 다음 세포를 4°C에서 밤새 삽입했습니다. 그런 다음 섹션에서 3% uranium acetate-citrate 이중 염색을 수행했습니다. 마지막으로 TEM에서 이미지를 수집했습니다.

표지된 C3H10T1/2 세포의 미세구조를 평가하기 위해 주사 전자 현미경(SEM)을 수행했습니다. 배지를 제거한 후, 세포를 PBS로 헹구고 밤새 4°C로 미리 냉각시킨 3% 글루타르알데히드로 고정했습니다. 그런 다음, 세포를 PBS로 두 번 헹구고 1% 오스믹산 4°C로 1시간 동안 고정했습니다. C3H10T1/2 세포를 다시 세척한 후, 세포를 오름차순 알코올(30% 에탄올, 50% 에탄올, 70% 에탄올, 80% 에탄올, 90% 에탄올, 95% 에탄올 및 100% 에탄올)에서 2 동안 탈수시켰다. 각각 10분 그런 다음 세포를 70%, 80%, 90%, 95%, 100% 아세토니트릴 용액에 각각 15분 동안 담그었습니다. 그런 다음 진공 건조 및 금의 스프레이 코팅을 수행했습니다. 마지막으로 SEM으로 이미지를 수집했습니다.

PBNP의 세포 생존율 분석

세포 생존율은 MTT(Sigma, USA)를 사용하여 평가하였다. 세포를 96웰 플레이트에 1 × 10 ³ 으로 시딩했습니다. 37°C, 5% CO₂에서 웰당 세포 대기. 밤새 배양한 후, 배양 배지를 다양한 농도의 PBNP(0, ​​5, 10, 20, 40, 80μg/mL)를 포함하는 100μL 새 배지로 교체한 다음, 세포를 추가로 1~3일 동안 배양했습니다. 배양 배지를 제거하고 세포를 20μL의 MTT(5mg/mL)와 함께 37°C에서 4시간 동안 인큐베이션했습니다. 침전된 보라색 염료 결정을 150μL의 디메틸 설폭사이드(DMSO; Sigma-Aldrich, USA)에 부드럽게 흔들어 10분 동안 용해했습니다. 광학 밀도(OD) 값은 마이크로플레이트 리더를 사용하여 490nm의 파장에서 측정했습니다. 세포의 결과는 퍼센트 생존 세포로 표현되었습니다.

확산 분석

MTT, MTS, WST-1 및 XTT와 비교하여 RTCA는 실험의 전체 기간에 대한 분석이 가능하고 세포 배양 실험에 부정적인 영향을 미치는 라벨링이 필요하지 않습니다[19]. 그래서 xCELLigence 시스템(Roche/ACEA Biosciences)을 사용하여 실시간으로 세포 증식을 측정했습니다. 간단히 말해서, 세포를 5 × 10 ³ 에서 E-Plate-16(ACEA Biosciences, Inc. San Diego, USA)에 접종했습니다. 150μL 완전 배지로 웰당 세포. 24시간 성장한 후 배지를 다양한 농도의 PBNP를 포함하는 새로운 배지로 교체하고 추가로 96시간 동안 배양했습니다. 이 시스템은 RTCA-DP 기기[21]에 의해 실시간으로 세포 수와 생존율에 대한 정량적 정보를 제공하기 위해 미세전극이 통합된 세포 배양 플레이트에 세포 부착에 의해 생성된 전기 임피던스를 측정했습니다[20]. 세포 증식은 다음 4일 동안 15분마다 주기적으로 측정되었습니다.

셀룰러 마이그레이션의 실시간 모니터링

C3H10T1/2 세포 이동은 실시간 세포 침입 및 이동(RT-CIM) 분석 시스템(ACEA Biosciences, Inc. San Diego, USA)을 사용하여 측정되었습니다. 세포는 멤브레인을 통해 상부 챔버에서 하부 챔버로 세포 이동으로 인해 센서에 접촉하고 부착할 때 "셀 인덱스" 판독값에 대한 임피던스를 증가시키는 능력이 있습니다. 간단히 말해서, 세포는 4× 10 ⁴ 의 밀도로 상부 챔버에 접종되었습니다. 다양한 농도의 PBNP가 존재하는 무혈청 배지에서 웰당. CIM 플레이트의 하단 챔버는 10% FBS를 포함하는 165μL 완전 배지로 채워졌습니다. 100시간 동안 10분마다 RTCA DP 기기로 세포 이동을 모니터링했습니다. 결과를 반영하기 위해 셀 인덱스(CI)를 사용했습니다. CI 값은 살아있는 세포가 세포 수, 모양 및 부착을 효과적으로 측정하기 위해 마이크로플레이트 웰의 생체 적합성 미세 전극 표면과 상호 작용함에 따라 전기 임피던스의 변화에서 파생되었습니다. 마이그레이션된 셀의 수가 많을수록 셀 인덱스가 커집니다.

Transwell 분석을 통한 세포 마이그레이션 조사

48시간 동안 다른 농도의 PBNP로 배양한 후 밀도가 2 × 10 ⁶ 인 세포 셀/cm ² Transwell 챔버(8μm 기공 크기, BD FalconTM, USA)에서 37°C 및 5% CO₂에서 24시간 동안 배양했습니다. . 배양 후 내부 챔버를 세척하고 챔버 바닥에 이동된 세포를 고정하고 0.1% 크리스탈 바이올렛으로 염색하였다. 각 단계 후에 PBS로 5분 동안 3번 세척했습니다. 이동된 세포는 도립 위상차 현미경(CK2, Olympus, Japan)을 사용하여 서로 다른 시야에서 사진을 찍었습니다.

체외 세포 분화

C3H10T1/2 세포 표지 또는 표지되지 않은 PBNP를 유도하여 지방세포 또는 골세포의 2개의 하류 세포 계통으로 분화시켰다. 세포가 6-웰 플레이트에서 합류에 도달한 후, 세포를 골형성 유도 배지(10nM 덱사메타손, 50μM 아스코르브산, 10mM β-글리세로포스페이트, Sigma를 함유하는 10% FBS/DMEM) 또는 지방형성 유도 배지(10% 1μM 덱사메타손, 0.5mM 이소부틸메틸크산틴, 10μM 인슐린, Sigma를 포함하는 FBS/DMEM). 3주 후, 세포를 PBS로 세척하고, 4% 폴리옥시메틸렌으로 고정하고, Alizarin Red 또는 Oil Red O(Sigma)로 염색하였다. 유도된 세포는 도립 위상차 현미경(CK2, Olympus, Japan)을 사용하여 서로 다른 시야에서 사진을 찍었습니다.

F-액틴 시각화를 위한 면역형광 분석

MSC는 48시간 동안 24웰 플레이트에서 다양한 농도의 PBNP와 함께 배양되었습니다. 세포를 4% 파라포름알데히드로 10분 동안 고정하고, 0.2% Triton-100으로 5분 동안 투과화하고, PBS 중 1% BSA로 실온에서 30분 동안 차단한 다음, 팔로이딘(1:100, Thermo Fisher Scientific , USA) 및 DAPI(1:800, Thermo Fisher Scientific, USA)를 실온에서 30분 동안 처리했습니다. NIS 요소 소프트웨어가 있는 Nikon eclipse Ti-S 현미경에서 형광 현미경 검사를 수행했습니다.

Western Blot 분석에 의한 단백질 발현

세포의 단백질 발현을 웨스턴 블롯 분석을 통해 평가하였다. MSC를 24시간 동안 6웰 플레이트에서 다양한 농도의 PBNP(0, ​​25, 50μg/mL)를 함유한 배지와 함께 배양하고, 빙냉 PBS로 2회 세척하고, 프로테아제 억제제 및 나트륨 오르토바나데이트(Beyotime, 중국). 30분 후 샘플을 4°C에서 10분 동안 14,000rpm으로 원심분리한 다음 BCA 키트(Beyotime, China)를 사용하여 샘플의 단백질 농도를 결정했습니다. 동일한 양의 단백질을 10% SDS-PAGE 젤(Beyotime, China)에서 전기영동하고 PVDF 멤브레인(GE Healthcare)으로 옮겼습니다. 멤브레인을 Tween20(TBST)이 포함된 Tris 완충 식염수에서 5% 우유로 실온에서 2시간 동안 차단한 다음 항-β-카테닌(1:1000, CST, USA), 항비멘틴(1:1000 , Abiocode) 및 항-β-액틴(1:1000, CST, USA)을 4°C에서 하룻밤 동안 처리했습니다. 막을 각각 5분 동안 3번 세척한 다음 실온에서 적절한 2차 항체와 함께 2시간 동안 인큐베이션했습니다. 신호는 ECL 및 ECL-plus(Beyotime, 중국)로 감지되었으며 향상된 화학 발광을 사용하여 Image Lab™ 소프트웨어가 있는 Molecular Image® ChemiDoc™ XRS+ 시스템(Bio-Rad Inc., 미국)에 노출되었습니다.

MRI를 통한 세포 라벨링 효율성의 세포 영상 조사

MSC를 다른 농도(25 및 50μg/mL)의 PBNP로 처리하고 대조군 세포를 PBNP가 없는 완전 배지로 48시간 동안 배양하고 PBS 완충액으로 3회 세척하고 트립신 처리하고 수집한 다음 1mL 1에 포매했습니다. %(w /v ) 이미징 연구를 위한 아가로스 솔루션. 또한 50μg/mL PBNP로 표지된 MSC를 14일 동안 골형성 분화를 유도한 후 MRI 신호 효과를 조사했습니다. T2 강조 영상은 TE =23ms, TR =400ms, NEX =2.0, 슬라이스 두께 2cm, FOV 20 × 20cm, 행렬 크기 × 384 인 반전 회복 기울기 에코 시퀀스를 사용하여 수행되었습니다. 256.

통계 분석

결과는 삼중으로 수행된 최소 3개의 독립적인 실험의 평균 ± SD로 표시되었습니다. 처리 그룹은 일원 분산 분석(ANOVA)과 학생의 t를 사용하여 비교되었습니다. 테스트가 사용되었습니다. 피 <0.05는 유의한 차이로 인정되었습니다.

결과 및 토론

PBNP 특성화

투과 전자 현미경(TEM)은 직경이 20-25nm인 PBNP(그림 1a)를 특성화하기 위해 수행되었습니다. 형태의 경우, PBNP는 직육면체 구조를 보였다. 그림 1b는 합성된 PBNP의 적외선 분광법을 보여줍니다. PBNP는 Fe ³⁺ 의 전형적인 흡수 피크를 나타냈습니다. -CN은 약 2085.23nm로 PBNP와 일치했습니다. 필드 종속 자화 측정은 PBNP의 자기 특성을 연구하는 데 추가로 사용되었습니다. 그림 1c는 실온에서 PBNP의 자화 곡선을 보여주며, 이는 PBNP의 초상자성을 보여줍니다. 그림 1d는 200, 220, 400, 420에서의 회절 피크를 보여주며 이는 PBNP의 XRD 패턴과 확증됩니다. 또한, PBNP의 다분산 지수는 0.16으로 균일한 입자 크기 분포를 나타냅니다.

<그림><사진><소스 유형="이미지/webp" srcset="//media.springerature.com/lw685/springer-static/image/art%3A10.1186%2Fs11671-018-2730-z/MediaObjects/ 11671_2018_2730_Fig1_HTML.png?as=webp">

PBNP 특성화. 아 PBNP의 형태. ㄴ PBNP의 UV-vis 흡광도 스펙트럼. ㄷ PBNP의 필드 종속 자화. d PBNP의 XRD 패턴

PBNP의 세포 흡수 및 세포독성

MSC에 대한 PBNP의 세포 흡수를 추가로 확인하기 위해, PBNP를 처리하거나 처리하지 않은 상기 C3H10T1/2 세포의 세포 미세형태를 연구하였다. 그림 2는 PBNP 유무에 관계없이 48시간 배양 후 C3H10T1/2 세포의 SEM 및 TEM 이미지를 보여줍니다. SEM 이미지에서, 표지된 C3H10T1/2 세포의 미세구조는 대조군 C3H10T1/2 세포와 비교할 때 뚜렷한 변화가 없었습니다. TEM 이미지에서 PBNP와 함께 인큐베이션하지 않은 대조군 C3H10T1/2 세포는 명백한 세포 미세 구조를 갖는 전형적인 세포 미세 형태를 나타냈다. 그러나 PBNP와 함께 배양한 후 C3H10T1/2 세포의 세포질에서 PBNP의 무작위 분포가 명확하게 관찰되었습니다. 그리고 일부 PBNP는 세포의 세포질 내의 소포에 국한된 것으로 나타났습니다. C3H10T1/2 세포의 세포질에서 PBNP의 무작위 분포가 관찰되었지만 세포 내 흡수의 정확한 메커니즘은 불분명했습니다. 우리는 C3H10T1/2 세포에서 PBNP의 내재화가 Prussian blue-Poly(l-lysine), 금, 은 및 금속산화물을 포함한 다양한 무기 나노입자가 엔도사이토시스를 통해 세포에 쉽게 흡수됩니다[15, 22, 23].

<그림><사진><소스 유형="이미지/webp" srcset="//media.springerature.com/lw685/springer-static/image/art%3A10.1186%2Fs11671-018-2730-z/MediaObjects/ 11671_2018_2730_Fig2_HTML.png?as=webp">

48시간 동안 다양한 농도의 PBNP로 배양한 후 C3H10T1/2 세포의 SEM 및 TEM 이미지. 아 SEM 이미지. ㄴ TEM 이미지. ↑, 세포 내 분포 PBNPs

MSC에서 세포독성과 세포생존율을 평가하기 위해 MTT법을 시행하였다. 세포를 37°C, 5% CO₂에서 1~3일 동안 배양했습니다. 다양한 농도의 PBNP가 DMEM에 현탁되어 있습니다. 3개의 독립적인 실험을 수행했으며 평균과 표준 편차를 보고했습니다. 그림 3은 PBNP(5, 10, 20, 40, 80μg/mL)로 처리된 MSC의 생존력이 각각 24~72시간에서 대조군 세포와 관련되었음을 보여줍니다. 결과는 PBNP가 MTT와 동일한 양의 PBNP로 처리된 세포에 대해 무독성임을 나타내었다. 또한, MSC의 성장 곡선을 조사하기 위해 xCELLigence 기기를 사용한 실시간 증식 분석이 사용되었습니다. 결과는 MSC의 성장 곡선이 이러한 농도의 PBNP에 의해 크게 영향을 받지 않았음을 보여주었으며(그림 4a), 24, 48, 72 및 96시간 처리 후 세포 생존율을 계산하여 그림 4b에 나타내었습니다. 이러한 결과는 PBNP가 MSC의 증식에 영향을 미치지 않음을 시사합니다.

<그림><사진><소스 유형="이미지/webp" srcset="//media.springerature.com/lw685/springer-static/image/art%3A10.1186%2Fs11671-018-2730-z/MediaObjects/ 11671_2018_2730_Fig3_HTML.png?as=webp">

MTT 방법으로 측정한 다양한 양의 PBNP가 존재할 때 C3H10T1/2 세포의 생존력

<그림><사진><소스 유형="이미지/webp" srcset="//media.springerature.com/lw685/springer-static/image/art%3A10.1186%2Fs11671-018-2730-z/MediaObjects/ 11671_2018_2730_Fig4_HTML.png?as=webp">

RT-CIM 분석에 의해 결정된 바와 같이 다양한 양의 PBNP의 존재하에서 C3H10T1/2 세포의 증식. 아 C3H10T1/2 세포의 성장 곡선. ㄴ 24, 48, 72, 96시간 처리 후 C3H10T1/2 세포의 세포 생존율

셀 마이그레이션 기능

다양한 농도의 PBNP로 처리된 MSC의 이동은 Transwell 분석과 새로운 기술인 RT-CIM 분석 시스템을 사용하여 테스트되었습니다. Transwell 분석에서, 표지된 세포는 이동에서 명백한 변화를 나타내지 않았습니다. RT-CIM 분석 시스템을 사용하여 실시간으로 세포 이동을 모니터링하여 보다 정확한 데이터를 반영하고 세포 이동 능력을 보다 정확하게 예측할 수 있었습니다. RT-CIM 분석 시스템에서, 비록 표지의 초기에 표지된 세포가 표지되지 않은 세포보다 천천히 이동했습니다. 그러나 72시간과 96시간에서는 표지된 세포와 표지되지 않은 세포 사이의 세포 이동에 큰 차이가 없었으며, 이는 고농도의 PBNP가 MSC 운동성에 영향을 미치지 않았음을 나타냅니다(그림 5).

<그림><사진><소스 유형="이미지/webp" srcset="//media.springerature.com/lw685/springer-static/image/art%3A10.1186%2Fs11671-018-2730-z/MediaObjects/ 11671_2018_2730_Fig5_HTML.png?as=webp">

다양한 양의 PBNP가 존재할 때 C3H10T1/2 세포의 이동. 아 RT-CIM 분석에 의해 결정된 C3H10T1/2 세포의 이동. ㄴ 12, 24, 48, 72, 96시간 처리 후 C3H10T1/2 세포의 세포 지수. ㄷ Transwell assay로 측정한 C3H10T1/2 세포의 이동(배율 × 200)

체외 세포 분화

표지 및 표지되지 않은 MSC의 다능성을 Alizarin Red 및 Oil Red O 염색으로 조사했습니다. 그림 6은 레이블이 있는 MSC가 레이블이 없는 MSC와 마찬가지로 지방세포와 골세포로 성공적으로 분화될 수 있음을 보여줍니다. 이러한 결과는 PBNP가 표지된 MSC의 만능성을 유지하는 세포의 분화 능력을 방해하지 않음을 시사합니다.

<그림><사진><소스 유형="이미지/webp" srcset="//media.springerature.com/lw685/springer-static/image/art%3A10.1186%2Fs11671-018-2730-z/MediaObjects/ 11671_2018_2730_Fig6_HTML.png?as=webp">

PBNP가 있거나 없는 세포의 시험관 내 세포 분화. 지방 세포에 대한 오일 레드 O 염색 및 골세포에 대한 알리자린 레드 염색. 이미지는 라벨링 3주 후 획득했습니다(배율 × 200)

세포 골격에 대한 라벨링 PBNP의 영향

PBNP가 MSC의 세포골격에 미치는 영향을 조사하기 위해 F-액틴의 면역형광 분석을 사용했습니다. 팔로이딘 염색은 표지되지 않은 MSC와 비교하여 48시간 동안 표지한 후 세포골격의 적색 액틴 필라멘트의 변경을 보여주지 않습니다. 48시간 동안 표지된 세포와 표지되지 않은 세포에서 액틴 필라멘트의 완전성과 분포를 비교한 결과 어떠한 변화도 나타나지 않았습니다(그림 7).

<그림><사진><소스 유형="이미지/webp" srcset="//media.springerature.com/lw685/springer-static/image/art%3A10.1186%2Fs11671-018-2730-z/MediaObjects/ 11671_2018_2730_Fig7_HTML.png?as=webp">

48시간 동안 다양한 양의 PBNP가 존재하는 C3H10T1/2 세포의 면역형광(배율 × 400). ↑, 세포골격

서부 얼룩 분석

Wnt 신호 전달 경로는 세포 증식, 분화, 세포자멸사, 조직 형성 및 줄기 세포 운명의 조절에 중요한 역할을 합니다[24]. 따라서 β-카테닌은 MSC의 기능성 단백질입니다. 또한, vimentin은 중간엽 바이오마커이며 MSC의 기능적 단백질이기도 합니다[25]. 이 두 단백질은 MSC의 생물학적 기능과 관련이 있습니다. β-catenin과 vimentin의 발현은 Western blot analysis로 평가하였다. 그림 8은 48시간 동안 다양한 농도의 PBNP를 처리한 MSC의 β-카테닌 및 비멘틴 발현이 PBNP를 처리하지 않은 MSC의 발현에 비해 유의한 변화가 없음을 보여줍니다. 이러한 결과는 PBNP가 MSC의 β-catenin 및 vimentin의 발현을 변화시킬 수 없음을 나타내었고, 이는 PBNP 처리 후 MSC의 생물학적 기능의 안정성을 보여주었다.

<그림><사진><소스 유형="이미지/webp" srcset="//media.springerature.com/lw685/springer-static/image/art%3A10.1186%2Fs11671-018-2730-z/MediaObjects/ 11671_2018_2730_Fig8_HTML.png?as=webp">

웨스턴 블롯은 48시간 동안 PBNP를 처리하거나 처리하지 않은 MSC의 β-카테닌 및 비멘틴 발현을 보여줍니다. β-카테닌 및 비멘틴의 수준은 소프트웨어 ImageJ에 의해 정량화되었습니다.

체외 MRI

MSC는 다른 줄기 세포와 마찬가지로 재생 의학의 중요한 원천이 된 뼈, 연골, 지방, 근육 및 심장 세포를 분화할 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다. 그리고 MSC의 이동과 결과를 추적하는 것은 결함 복구에서 외인성 MSC의 역할과 결과를 평가하는 데 매우 중요합니다. 자기공명영상(MRI)은 임상 투여 후 MSC를 관찰하는 데 도움이 되며 MRI 조영제가 필요합니다. 효과적인 T2 강조 세포 MRI 조영제로 사용되는 PBNP의 가능성이 입증되었으며[14], 일부 다른 연구에서도 PBNP의 표면 변형이 MRI에서 성능을 향상시키는 것으로 나타났습니다[17, 26]. 현재 PBNP 라벨링은 다양한 세포에서 사용되어 왔습니다. Dumont et al. 소아 뇌종양의 MRI 및 형광 기반 영상화를 위한 약제로 PBNP를 기술했습니다[27]. Pereraet al. 위장관 종양의 조기 발견을 위해 가돌리늄이 포함된 PBNP를 개발했습니다[28]. 및 Cano-Mejia et al. PBNP(Prussian blue nanoparticle) 기반 광열 요법(PTT)과 항CTLA-4 체크포인트 억제를 결합하여 신경모세포종을 치료했습니다[29]. 그러나 PBNP로 표지된 MSC에 대한 관련 보고는 거의 없습니다. 또한, PBNP를 라벨링한 후 MSC의 세포 기능 및 생존력에 부정적인 영향이 있는지 여부는 불분명합니다.

PBNP가 세포의 T2 강조 MRI 대비를 향상시키는 능력이 있는지 여부를 조사하기 위해 PBNP의 유무에 관계없이 MSC를 배양하고 MRI 신호 효과를 조사했습니다. 라벨링의 시간적 안정성을 모니터링하고 MSC가 분화될 때 PBNP가 이미징 기능을 상실하는지 여부를 조사하기 위해 MSC를 PBNP와 함께 배양하고 14일 동안 MSC를 골형성 분화로 유도한 다음 MRI 신호 효과를 조사했습니다. 도 9에 도시된 바와 같이, PBNP와 함께 배양된 MSC의 펠릿은 명확한 MRI 신호 어둡게 하는 효과를 보였고, 표지된 MSC의 SI 값은 표지되지 않은 MSC와 분명한 차이를 보였다. 특히, 표지된 MSC는 분화 유도 시 명확한 MRI 신호 어둡게 하는 효과도 보였다. 이러한 결과는 PBNP가 MSC의 세포 영상화를 위한 효과적인 T2 조영제로 사용될 가능성이 있으며 세포 분화 후에도 조영제의 장기간 보유를 제공할 수 있음을 입증했습니다.

<그림><사진><소스 유형="이미지/webp" srcset="//media.springerature.com/lw685/springer-static/image/art%3A10.1186%2Fs11671-018-2730-z/MediaObjects/ 11671_2018_2730_Fig9_HTML.png?as=webp">

MSC의 T2 강조 MRI 팬텀. 아 횡단면. ㄴ SI 값의 정량적 분석. **피 <0.001 대 대조군

자성 나노입자(MNP)로 표지된 MSC에 대한 많은 발표된 데이터가 있지만 MNP의 적용은 세포 독성으로 인해 제한되었습니다. MNP를 표적 조직에 전달할 때 대부분의 MNP는 간과 비장에 분포하는 경우가 많기 때문에 MNP의 독성을 무시할 수 없다[30]. 예를 들어 Costa C는 SPION이 신경 세포와 신경교 세포에 세포독성을 일으킬 수 있음을 발견했습니다[31]. 위에서 언급했듯이 PBNP는 검출 가능한 세포 독성을 나타내지 않았으며 세포 골격, 세포 형태 및 기능 단백질을 포함한 MSC의 세포 특성에 영향을 미치지 않았습니다. 따라서 효과적인 T2 강조 세포 MRI 조영제로 PBNP를 사용하는 것의 강점은 세포 독성 측면에서 입증될 것입니다.

결론

요약하면, 우리는 중간엽 줄기세포의 추적에 PBNP를 도입하고 PBNP로 표지된 후 MSC의 생존, 이동 가능성 및 세포 특성을 연구했습니다. 또한, 우리는 또한 MSC의 세포 MRI에 대한 효과적인 T2 강조 MRI 조영제로서 PBNP의 잠재력을 입증했습니다. PBNP는 MSC의 표지에 효과적으로 사용될 수 있으며 MSC의 생물학적 특성에 영향을 미치지 않습니다. 이 결론은 MSC라는 레이블의 새로운 길을 열었습니다.

약어

DMEM:

Dulbecco의 수정된 Eagle 배지

DMSO:

디메틸설폭사이드

FBS:

태아 소 혈청

MRI:

자기공명영상

MSC:

간엽줄기세포

NIR:

근적외선

OD:

광학 밀도

PBNP:

프러시안 블루 나노 입자

TEM:

투과전자현미경

VSM:

진동 샘플 자력계

Curcumin-loaded 키토산-소 혈청 알부민 나노입자는 잠재적으로 Aβ 42 식균 작용을 강화하고 알츠하이머병에서 대식세포 분극화를 조절합니다 하이브리드 이산화티타늄 나노복합체 코팅의 향상된 확산 반사율 및 미세구조 특성