이 연구에서는 식도 편평 세포 암종(ESCC)을 표적으로 하기 위해 5-플루오로우라실(5-FU) 및 LY294002(LY)가 로딩된 페길화된 나노리포좀을 제조했습니다. 입자는 물리화학적 및 생물학적 매개변수 측면에서 특성화되었습니다. 단일 운반체에서 자가포식 억제제와 화학요법 약물의 공동 전달이 성공적으로 달성되었습니다. 5-FU 및 LY-로딩된 PEG화 나노리포솜(FLNP)의 두 성분은 5-FU에 비해 상대적으로 더 빠르게 방출되는 LY와 함께 제어된 방식으로 방출되었습니다. FLNP는 산성 환경에서 약물의 점진적인 방출을 허용하는 수용체 매개 세포 흡수를 보여주었습니다. 나노입자(NP)의 세포 흡수는 FACS 분석에 의해 추가로 확인되었다. 5-FU와 LY의 조합은 개별 약물에 비해 더 높은 세포독성 효과를 나타냈다. 가장 중요한 것은 FLNP가 무료 칵테일 조합에 비해 암세포에서 훨씬 더 높은 항암 효과를 나타냈다는 것입니다. FLNP로부터의 LY의 더 빠른 방출은 자가포식 억제를 유도하여 5-FU에 대한 암세포의 민감도를 향상시켜 더 많은 세포 사멸을 초래합니다. 일관되게, FLNP는 다른 그룹에 비해 암세포의 더 큰 세포자멸사(~ 48%)를 유도했습니다. Western blot 분석은 5-FU와 LY가 개별적으로 caspase-3와 PARP의 발현을 증가시키는 반면, 예상대로 FLNP는 뛰어난 항암 효과를 나타내는 이들 단백질 마커의 현저한 발현을 유도했음을 분명히 보여주었습니다. 우리는 단일 나노운반체로부터 자가포식 억제제와 화학요법 약물의 프로그램된 방출이 ESCC에서 항암 요법의 전망을 증가시킬 것이라고 믿습니다.
<섹션 데이터-제목="배경">식도 편평 세포 암종(ESCC)은 식도암의 흔한 유형 중 하나로 중국과 같은 동아시아에서 더 많이 발생합니다[1, 2]. ESCC의 5년 생존율은 약 25%입니다. 수술은 ESCC 치료의 주요 치료 옵션입니다. 그러나 보조 화학요법은 ESCC 치료에 큰 영향을 미칠 것으로 믿어진다[3, 4]. 단일 약물 요법에 기초한 화학 요법 치료는 암세포의 이질성으로 인해 치료 효능이 좋지 않은 것으로 보고되었다[5]. 암세포는 종종 단일 항암제에 내성이 있으며 본질적으로 효과적이지 않습니다. 이와 관련하여 두 가지 이상의 약물의 조합은 서로 다른 세포 표적을 표적으로 하여 상승적인 방식으로 작용할 것입니다[6, 7]. 자가포식 억제제는 암세포의 다제내성(MDR)을 극복하는 것으로 보고되었습니다. 세포에 제한된 영양과 성장 인자가 있을 때 자가포식은 암 환경에 꼭 필요한 항상성을 제공하고 암의 생존에 기여합니다[8]. 자가포식은 또한 화학요법제로부터 암세포를 보호하는 역할을 합니다. 이 연구에서는 자가포식 억제제로 LY294002(LY)를 선택했습니다[9].
여러 연구에 따르면 autophagy 억제제는 항암제와 함께 사용할 때 가장 잘 작동합니다. 이 연구에서 우리는 5-플루오로우라실(5-FU)을 화학요법제로 선택했습니다. 5-FU는 주로 편평세포암의 치료에 사용되며 유방암 및 기타 암 환자에게 사용됩니다[10]. 5-FU는 수소 대신 우라실의 C-5 위치에 불소 원자가 있습니다. 5-FU의 항암 효과는 Bax, Bcl-2와 같은 다양한 분자의 조절에 기인하여 암세포의 세포자살을 유도한다[11, 12]. 5-FU 및 LY의 잠재적인 세포독성 효과에도 불구하고, 두 제제 모두 낮은 수용해도 및 안정성 문제로 인해 혈장 반감기가 짧고 정상 세포에 대한 바람직하지 않은 독성 효과를 초래합니다[6]. 또한, 두 항암제의 단순한 칵테일 혼합물은 약물의 무작위 방출과 다양한 조직에서 약물의 통제되지 않은 분포로 인해 시너지 효과를 유도하지 않습니다[7]. 따라서 두 항암제를 프로그램되고 통제된 방식으로 전달하여 치료 효과를 높이는 것이 가장 중요합니다.
나노입자는 암 표적 응용을 위한 약물 전달 운반체로 널리 조사되었습니다[13]. 난용성 약물은 나노입자에 안정적으로 포함될 수 있어 용해도 및 생체이용률이 향상될 수 있다. 모든 담체 중에서 리포솜은 전신적 적용에 대한 적합성에 대해 널리 연구되어 왔다[14, 15]. 이전 연구에서는 Doxil, Myocet, LipoPlatin 등을 포함하여 많은 상용 리포솜 제형을 사용할 수 있음이 입증되었습니다. 리포솜의 전신 순환은 친수성 껍질인 폴리에틸렌(글리콜)(PEG)의 표면 접합에 의해 개선될 수 있습니다[16]. PEG의 나노크기와 친수성 층은 혈액 순환을 연장하고 세망내피(RES) 매개 혈장 청소율을 감소시킵니다. 게다가 NP는 EPR(Enhanced Permeation and Retention) 효과를 통해 종양 조직에 수동적으로 축적될 수 있습니다[17, 18]. 따라서 화학요법제와 자가포식 억제제가 단일 운반체에 포함될 수 있다면 ESCC에서 상승적인 항암 효과를 기대할 수 있다.
지금까지 본 연구의 주요 목표는 ESCC를 치료하기 위해 5-FU와 LY의 조합을 투여하는 것이었다. 이를 위해 5-FU와 LY가 PEG화된 나노리포좀에 안정적으로 통합되었습니다. 자가포식 억제제(LY)의 조기 방출은 암세포의 보호 기전을 파괴한 후 5-FU가 암세포에서 더 강력한 방식으로 작용할 것으로 예상되었습니다. 약물이 적재된 리포솜은 입자 크기, 모양 및 방출 패턴의 측면에서 특성화되었습니다. 세포 흡수 및 세포 생존력 분석은 ESCC 암세포에서 수행되었습니다. 또한, annexin V/PI 염색 및 Hoechst 33382 염색을 통해 세포자멸사 분석을 수행하였다. 마지막으로 ESCC 세포 보유 이종이식 동물 모델에서 항종양 효능 연구를 수행했습니다.
5-Fluorouracil은 중국 Sigma-Aldrich에서 구입했습니다. 2-(4-모르폴리닐)-8-페닐-4H-1-벤조피란-4-온(LY294002, LY)은 중국 Beijing Huafeng United Technology Corporation에서 구입했습니다. L-α-포스파티딜콜린(계란/닭)(EPC), 디스테로일포스파티딜에탄올아민-폴리에틸렌 글리콜(2000)(DSPE-PEG) 및 콜레스테롤은 중국 Avanti Polar Lipids에서 구입했습니다. 다른 모든 화학 물질은 시약 등급이었고 추가 정제에 사용되었습니다.
EPC, DSPE-PEG 및 콜레스테롤을 메탄올-클로로포름 혼합물(10:4:1 M 비율(총 10 mg))에 혼합하고 이 유기 혼합물에 5-FU(1.5 mg) 및 LY(1.5 mg)를 추가했습니다. 유기 용매는 회전 증발기(Buchi, USA)를 사용하여 60°C에서 1시간 동안 증발되었습니다. 얇은 지질막을 PBS 버퍼로 1시간 동안 수화시킨 후 폴리카보네이트 멤브레인(200nm)을 통해 미니 압출기를 통해 압출했습니다. 약물이 로딩된 나노리포좀은 MW가 3500인 Millipore 튜브를 통해 여과되었다. 약물이 로딩된 리포좀은 상부 챔버에서 수집되었고 비포착 약물은 HPLC 방법으로 측정하였다. 약물 로딩 및 캡슐화는 다음 방정식을 사용하여 계산되었습니다.
$$ \mathrm{DL}\ \left(\%\right)=\left(\mathrm{Weight}\ \mathrm{of}\ \mathrm{적재된}\ \mathrm{drug}/\mathrm{weight}\ \mathrm{of}\ \mathrm{리포솜}\right)\times 100\% $$$$ \mathrm{EE}\ \left(\%\right)=\left(\mathrm{Weight}\ \mathrm{ of}\ \mathrm{적재}\ \mathrm{약물}/\mathrm{가중치}\ \mathrm{of}\ \mathrm{약물}\ \mathrm{초기}\ \mathrm{추가됨}\right)\times 100 \% $$나노 입자의 입자 크기 및 크기 분포는 Zetasizer(Nano ZS, Malvern Instruments, UK)를 사용하여 동적 광산란(DLS) 기술에 의해 결정되었습니다. 입자 크기는 증류수로 적당히 희석한 후 25°C에서 측정하였다. 모든 측정은 3회 수행되었습니다.
NP의 형태는 100kV의 가속 전압에서 투과 전자 현미경(TEM; H-7600, Hitachi, Tokyo, Japan)으로 처음 연구되었습니다. 샘플을 탄소 코팅된 구리 그리드에 로드하고 건조했습니다. NP 형태는 원자력 현미경(AFM)에서 추가로 관찰되었습니다. 샘플은 운모 표면에 놓였습니다.
5-FU 및 LY-로딩된 PEG화 나노리포솜(FLNP)으로부터의 5-FU 및 LY의 시험관 내 방출은 37°C에서 인산 완충 식염수(PBS, pH 7.4)에서 연구되었습니다. NP 분산액(담체에 각 약물 1mg을 포함하는 1ml)을 투석막(MW ~ 3500)에 넣고 양쪽 끝을 밀봉했습니다. 투석막을 30ml의 방출 매질이 담긴 튜브에 넣었습니다. 투석 막을 포함하는 튜브를 진탕조에 넣고 전제 조건 시점 동안 인큐베이션하도록 하였다. 특정 시점에서 100μl의 샘플을 회수하고 동일한 양의 새 버퍼로 교체했습니다. 완충액에서 방출된 약물의 양은 HPLC 방법에 의해 연구되었습니다. L-2200 자동 시료 주입기와 L-2420 UV-Vis 검출기로 구성된 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 시스템(Hitachi, Tokyo, Japan)을 사용했습니다. Inertsil C18 Column(150mm × 4.6mm, 5μm 입자 크기, Cosmosil, Nacalai Tesque Inc., USA)은 1.0mL/min의 유속과 25°의 컬럼 온도에서 이동상의 등용매 용리 하에 사용되었습니다. 씨. 상관 계수(r 2 ) 약 0.9995. 5-FU 및 LY에 대한 LOD(μg/ml)는 각각 0.020 및 0.050이었습니다. 5-FU 및 LY에 대한 LOQ(μg/ml)는 각각 0.070 및 0.150이었습니다.
식도암 세포주 EC 9706은 10% FBS 및 100 units/mL 페니실린, 100 mg/ml streptomycin in 5% CO2가 포함된 정상 RPMI 배지에서 배양되었습니다. 그리고 가습기의 습도 95% 분위기.
NP의 세포 흡수는 공초점 레이저 주사 현미경(CLSM)으로 관찰되었습니다. 이를 위해 로다민 B가 로딩된 NP를 제조하고 HEPES 완충액이 있는 Sephadex G-50 컬럼을 사용하여 겔 여과에 의해 정제했습니다. 세포를 12-웰 플레이트에 시딩하고 밤새 인큐베이션하였다. 그런 다음 세포를 로다민 B가 로딩된 NP(10μg/ml)에 노출시키고 2시간 동안 배양했습니다. 세포를 PBS로 3회 세척하고 2% 파라포름알데히드(PFA)로 고정한 후 PBS로 다시 세척하였다. 그런 다음 세포를 핵 염색제로 DAPI로 염색했습니다. 세포를 세척하고 형광 현미경(Nikon TE2000-E 현미경)으로 관찰했습니다.
세포 흡수는 유세포 분석기를 사용하여 추가로 관찰되었습니다. 세포를 12-웰 플레이트에 시딩하고 밤새 인큐베이션하였다. 그런 다음 세포를 로다민 B가 로딩된 NP에 노출시키고 각각 1시간 및 2시간 동안 배양했습니다. 그런 다음 세포를 추출하고 PBS로 두 번 세척했습니다. 세포를 PBS 완충액에 재현탁하고 CELLQuest 소프트웨어(Becton Dickinson Biosciences, San Jose, CA, USA)가 장착된 Calibur 형광 활성화 세포 분류기를 사용하여 분석했습니다.
개별 제형의 세포독성 가능성은 3-(4,5-디메틸-2-티아조일)-2,5-디페닐 테트라졸륨 브로마이드(MTT) 분석에 의해 평가되었습니다. 간단히 말해서 1 × 10 4 세포를 96웰 플레이트에 접종하고 24시간 동안 배양했습니다. 그런 다음 세포를 각기 다른 농도의 유리 5-FU, LY, 5-FU + LY 및 FLNP에 노출시키고 24시간 동안 추가 배양했습니다. MTT 용액을 준비하고(5mg/ml), 10μl의 MTT 용액을 각 웰에 첨가하고 4시간 동안 인큐베이션했습니다. DMSO를 첨가하여 포르마잔 결정을 추출하고 마이크로플레이트 리더(Synergy™ HTX Multi-Mode Microplate Reader)(570nm에서)를 사용하여 흡광도를 조사했습니다.
암 세포의 아폽토시스는 Annexin-V/PI 염색 프로토콜(BD Biosciences, USA)에 의해 결정되었다. 간단히 말해서, EC 9706을 12웰 플레이트에 접종하고 24시간 동안 배양했습니다. 세포를 각각 유리 5-FU, LY, 5-FU + LY 및 FLNP와 함께 인큐베이션하고 24시간 동안 추가로 인큐베이션했습니다(동등한 약물 농도 1μg). 세포를 추출하고 실온에서 15분 동안 annexin V-FITC 및 PI로 염색한 다음 FACS CELLQuest 소프트웨어(Becton Dickinson Biosciences, San Jose, CA, USA)를 사용하여 유세포 분석을 통해 계수했습니다.
암 세포의 아폽토시스는 Hoechst 33342 염색 프로토콜에 의해 추가로 결정되었습니다. 간단히 말해서, EC 9706을 12웰 플레이트에 접종하고 24시간 동안 배양했습니다. 세포를 각각 유리 5-FU, LY, 5-FU + LY 및 FLNP와 함께 인큐베이션하고 24시간 동안 추가로 인큐베이션했습니다(동등한 약물 농도 1μg). 세포를 2% PFA로 고정하고 Hoechst 33342(1μg/ml)와 함께 15분 동안 배양했습니다. 그런 다음 형광 현미경으로 세포 사멸을 관찰했습니다.
EC 9706 세포를 파종하고 유리 5-FU, LY, 5-FU + LY 및 FLNP로 각각 처리한 후 24시간 동안 추가 배양했습니다. 그런 다음 세포를 용해하고 상층액을 소듐 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)에 적용하고 폴리비닐리덴 디플루오라이드 멤브레인(Millipore)에 블로팅합니다. 막을 5% 탈지유로 차단한 다음 특정 1차 항체와 함께 4°C에서 밤새 인큐베이션했습니다. 2차 항체 접합체 양고추냉이 퍼옥시다제와 함께 인큐베이션한 후, 신호 검출을 위해 ECL 시스템(AbClon)을 사용하여 블롯이 드러났습니다. 필름은 Kodak M35-A X-OMAT 프로세서를 사용하여 현상되었습니다.
동물 연구는 중국 장쑤성 수베이 인민 병원의 기관 동물 관리 및 사용 위원회에서 유명한 지침에 따라 수행되었습니다. 6주 된 암컷 누드 마우스에 1 × 10 6 을 접종했습니다. 100μl의 배지에서 마우스의 오른쪽 옆구리에 있는 OE-19 세포. 종양이 80mm 3 까지 자라도록 허용했습니다. (10일째). 동물을 각 그룹에 6마리의 마우스로 5개의 그룹으로 나누었습니다. 마우스에 각각의 제형을 5mg/kg의 고정 용량으로 주사하고 실험의 처음 10일 동안 3회 투여했습니다. 종양 크기는 버니어 캘리퍼스를 사용하여 종양 부피로 측정하고 공식을 사용하여 크기를 추정했습니다. 볼륨 =(너비 2 × 길이)/2.
데이터는 평균 ± 표준편차로 표현하였다. 통계적 유의성은 t를 사용하여 결정되었습니다. 테스트 및 분산 분석(ANOVA). 피 <0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다.
암세포는 종종 단일 항암제에 내성이 있으며 본질적으로 효과적이지 않습니다. 이와 관련하여 두 가지 이상의 약물의 조합은 서로 다른 세포 표적을 표적으로 함으로써 상승적인 방식으로 작용할 것입니다. 자가포식 억제제는 암세포의 다제내성(MDR)을 극복하는 것으로 보고되었습니다. 여러 연구에 따르면 autophagy 억제제는 항암제와 함께 사용할 때 가장 잘 작동합니다. 이 연구에서 우리는 화학요법제로 5-플루오로우라실(5-FU)을 선택하고 자가포식 억제제로 LY294002(LY)를 선택했습니다. 짧은 혈장 반감기와 바람직하지 않은 독성 효과를 초래하는 자유 약물의 용해도 및 안정성 문제를 해결하기 위해 PEG화 나노리포좀에 5-FU와 LY를 안정적으로 통합했습니다(그림 1).
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5-fluorouracil 및 LY-loaded PEGylated nanoliposomes 준비의 개략도
이중 약물이 로딩된 리포솜은 박막 수화법에 의해 제조되었습니다. 블랭크 리포솜의 평균 입자 크기는 ~ 110 nm로 우수한 분산 지수를 갖는 것으로 나타났습니다. 이중 약물 부하 리포솜(FLNP)의 입자 크기는 우수한 다분산 지수(PDI ~ 150)로 ~ 150nm로 증가했습니다(그림 2a). 입자 크기의 증가는 주로 리포솜에 소수성 약물의 혼입에 기인합니다. 약 200nm의 입자 크기는 향상된 투과 및 체류 효과(EPR) 덕분에 종양 조직에서 약물 축적을 향상시키는 것으로 보고되었습니다. 약물-로딩된 리포솜은 방오 효과에 기여하는 표면에 PEG의 존재로 인한 장기 저장 능력을 나타냈다. 또한 FLNP는 ~ 25mV의 평균 표면 전하를 나타내어 콜로이드 안정성을 나타냅니다. 음의 표면 전하는 전신 순환의 상호 작용을 피할 것입니다.
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FLNP의 물리화학적 특성. 아 DLS 방법에 의한 FLNP의 입자 크기 분포. ㄴ FLNP의 TEM 이미지. ㄷ FLNP의 AFM 이미지
FLNP의 형태는 먼저 TEM을 사용하여 관찰되었습니다(그림 2b). 알 수 있는 바와 같이, 입자는 전형적인 구형이고 구리 그리드에 균일하게 분산되어 있습니다. 둘레에 약간 회색빛이 도는 껍질은 표면에 PEG가 존재하기 때문입니다. TEM에서 관찰된 입자 크기는 DLS의 입자 크기에 비해 약간 작습니다. TEM의 입자 크기는 DLS의 ~ 150nm에 비해 ~ 130nm였습니다. 두 기술의 입자 크기 차이는 측정 상태에 기인할 수 있습니다. TEM은 건조 조건에서 입자를 측정하는 반면 DLS는 수화 조건 및 PEG 사슬 연장에서 입자를 측정합니다. 입자 형태는 AFM에 의해 추가로 확인되었습니다(그림 2c). 입자는 원형이었고 운모 표면에 평평한 물체로 존재했습니다.
FLNP는 약 ~ 16% w 활성 약물 로딩으로 두 약물(5-FU의 경우 92.5% 및 LY의 경우 86%)에 대해 높은 포획 효율을 나타냈습니다. /와 . FLNP로부터의 5-FU 및 LY의 시험관내 방출 거동은 인산완충식염수(pH 7.4)에서 관찰되었다. FLNP의 두 성분은 pH 7.4 조건에서 통제된 방식으로 방출되었습니다. 예를 들어 5-FU의 ~ 30% 및 LY의 ~ 40%가 24시간이 끝날 때까지 리포솜에서 방출됩니다. 약물의 방출은 90시간까지 계속되었으며 5-FU의 ~ 60% 및 LV의 ~ 5%가 방출되었습니다(그림 3). 방출 속도는 NP 시스템에서 약물의 느린 확산을 나타내는 90시간까지 24시간 후 크게 감소했습니다. 약물의 이러한 제어 방출은 암 표적화 적용에 유익할 것입니다. 또한, 중성 조건에서 약물의 느린 방출은 정상 조직에 대한 부작용이 적다는 것을 나타냅니다. LY가 5-FU에 비해 상대적으로 더 빨리 방출된다는 점은 주목할 가치가 있습니다. LY가 암세포를 5-FU에 더 민감하게 만들어 종양 조직에서 세포독성 효과를 강화하므로 유익한 상황이 될 것입니다.
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인산완충식염수(PBS, pH 7.4)에서 FLNP로부터 5-FU 및 LY의 방출 프로필. 방출된 약물의 양은 HPLC 분석으로 정량화되었습니다.
FLNP의 세포하 패턴을 결정하기 위해 공초점 레이저 주사 현미경(CLSM)을 수행했습니다. 로다민 B는 ESCC에서 NP의 세포내 흡수를 추적하기 위한 형광 프로브로 사용되었습니다. 보이는 바와 같이(그림 4), 핵 주변의 세포질에서 강한 적색 형광 신호가 관찰되어 전형적인 엔도사이토시스 매개 세포 흡수를 나타냅니다. 수용체 매개 세포 흡수는 산성 환경에서 약물의 점진적 방출을 허용합니다. 입자의 나노크기는 NP 시스템의 용이한 내재화를 가능하게 하였다. 결과는 약물이 단순한 확산이 아닌 특정 경로를 통해 암세포에 진입했음을 분명히 보여주었다. 세포 흡수는 FACS에 의해 추가로 모니터링되었습니다. 보시는 바와 같이 배양 1시간 후에 NP의 흡수가 현저하게 관찰되었으며 배양 시간(2시간)이 증가함에 따라 세포 흡수가 증가했습니다. NP의 더 많은 세포 흡수는 캡슐화된 항암제의 세포 내 농도를 증가시켜 ESCC에서 치료 효능을 더욱 증가시킬 것입니다.
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아 FLNP와 2시간 배양 후 HT-29 암세포의 공초점 레이저 주사 현미경(CLSM) 이미지. 핵은 DAPI로 염색하고 Rhodamine B를 형광 프로브로 사용했습니다. ㄴ 다양한 시점에 대한 배양 시 FLNP의 유세포 분석기 분석
개별 제형의 세포독성 효과는 MTT 분석에 의해 연구되었습니다(그림 5). 도시된 바와 같이, 자유 약물 및 조합 NP는 ESCC에서 전형적인 농도 의존적 세포독성 효과를 나타냈다. 5-FU는 암세포에서 LY에 비해 상대적으로 더 높은 항암 효과를 나타냈다. 5-FU와 LY의 조합은 개별 약물에 비해 더 높은 세포독성 효과를 나타냈다. 가장 중요한 것은 FLNP가 무료 칵테일 조합에 비해 암세포에서 훨씬 더 높은 항암 효과를 나타냈다는 것입니다. 5-FU, LY, 5-FU + LY 및 FLNP의 IC50 값은 각각 2.68μg/ml, 5.98μg/ml, 1.54μg/ml 및 0.58μg/ml였습니다. 이것은 LY가 암세포의 자가포식을 억제하여 5-FU에 더 잘 반응하도록 할 수 있다는 사실에 기인할 수 있습니다. FLNP는 통제된 방식으로 더 프로그램된 약물 방출로 인해 무료 칵테일 조합보다 더 효과적이었습니다. FLNP에서 LY의 더 빠른 방출은 자가포식 억제를 유도하여 5-FU에 대한 암세포의 민감도를 향상시켜 더 많은 세포 사멸을 초래합니다[19]. 암세포에 들어간 후 5-FU는 fluorouridine monophosphate(FUMP)를 통해 fluorouridine triphosphate(FUTP)로 전환되거나 두 가지 다른 경로를 통해 fluorodeoxyuridine triphosphate(FdUTP)로 대사되는 것으로 보고되었습니다. FdUTP는 thymidylate synthase(TS)의 기질로 작용하여 nucleotide 합성을 차단합니다. 5-FU 대사 산물은 TS의 뉴클레오티드 결합 부위에 결합하여 뉴클레오티드 합성을 억제합니다. 이 주기는 DNA 합성을 방해하고 암 세포 사멸을 증가시키는 데옥시티미딘 삼인산(dTTP)의 고갈로 이어집니다[20, 21].
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유리 5-FU, LY, 5-FU + LY 및 FLNP와 함께 배양 시 HT-29 암세포의 세포 생존율. 세포 생존율은 MTT 분석에 의해 결정되었습니다.
제형의 세포자멸사 효과는 Annexin-V/PI 염색법으로 평가하였다(Fig. 6a, b). 이를 통해 개인 및 복합 약물 시스템의 세포자멸사 효과를 결정할 수 있습니다. MTT 분석과 일치하게, 5-FU(~ 20%)는 LY(~ 12%)에 비해 암세포의 더 큰 세포자멸사를 초래한 반면, 5-FU + LY 조합은 더 큰 세포자멸사 세포사를 유도했습니다(~ 30%). 다른 그룹과 비교하여 FLNP는 암세포의 더 큰 세포자멸사(~ 48%)를 유도하여 수용체 매개 세포 흡수가 항암제의 세포 내 농도를 크게 증가시켜 치료 효과가 더 높음을 시사합니다. FLNP의 더 높은 항암 효과에 대한 중요한 이유는 주로 LY가 종양 세포를 민감하게 하고 5-FU가 강력한 세포 독성 효과를 유도하는 캡슐화된 약물의 순차적 방출에 기인합니다. 항암 요법은 주변 정상 세포를 손상시키지 않으면서 암세포에서 세포자멸사를 유도함으로써 작동합니다. FLNP의 감지할 수 있는 세포 사멸 활성은 주로 세포 내 이입 흡수를 통한 세포 내 나노 입자의 더 높은 축적과 세포 내 환경에서의 약물의 순차적 방출에 기인하여 상승적 치료 효과를 가져왔습니다. 자가포식 억제제(LY)의 조기 방출은 암세포의 보호 기전을 파괴하고 이후 5-FU는 암세포에서 더 강력한 방식으로 작용할 것으로 예상됩니다.
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각각 유리 5-FU, LY, 5-FU + LY 및 FLNP와 함께 배양 시 HT-29 암세포의 세포 사멸의 대표적인 유세포 분석 결과. 왼쪽 아래, 살아있는 세포; 오른쪽 아래, 초기 세포사멸 세포; 우측 상단, 후기 세포사멸 세포; 및 왼쪽 상단, 괴사 세포
제형의 작용 메커니즘은 웨스턴 블롯 분석에 의해 결정됩니다(그림 7). 각 제형에 노출되었을 때 pro-apoptotic 및 anti-apoptosis 단백질 수준의 발현은 그림 8에 나와 있습니다. p53은 중요한 세포 주기 조절자 중 하나이며 이의 하향 조절은 암세포의 생존 증가와 관련이 있습니다. 제형은 ESCC 세포에 대한 현저한 효과를 나타내는 p53의 발현 수준을 유의하게 하향조절함을 알 수 있다. DNA 손상은 세포 사멸의 특징으로 간주되는 PARP-1의 절단을 초래하는 카스파제 캐스케이드의 활성화를 초래한다고 보고되었습니다[22, 23]. 우리의 결과는 5-FU와 LY가 개별적으로 caspase-3와 PARP의 발현을 증가시키는 반면, 예상대로 FLNP는 우수한 항암 효과를 나타내는 이러한 단백질 마커의 현저한 발현을 유도한다는 것을 분명히 보여주었습니다. 일관되게, FLNP는 항-세포사멸 단백질(Bcl-2)의 발현을 유의하게 하향조절하여 ESCC에서 치료 효능을 향상시키는 효율성을 나타냅니다.
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유리 5-FU, LY, 5-FU + LY 및 FLNP와 함께 배양한 HT-29 암세포의 웨스턴 블롯 분석. 절단된 caspase-3, PARP, Bcl-2 및 p53의 웨스턴 블롯 분석이 결정되었습니다.
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동물 모델에 대한 생체 내 항종양 효능 연구. 5-FU, LY, 5-FU + LY 및 FLNP가 없는 제형을 각각 종양 마우스에 투여하고 20일 동안 효능을 연구했습니다
마우스에 각각의 제형을 주사하고 20일까지 종양 부피를 기록했습니다. 보이는 바와 같이(그림 8), 대조군은 18일까지 모든 시점에서 종양 부피의 꾸준한 증가를 보였습니다. 대조군과 비교하여 자유 약물은 종양의 성장을 제어했습니다. 그러나 만족스럽지 않았습니다. 두 약물의 칵테일 혼합물은 종양 부피를 조절하는 데 개별 약물보다 상대적으로 더 효과적이었습니다. 중요하게는, FLNP가 유의하게 나타났습니다(p <0.05; 피 <0.0001) 다른 그룹과 비교하여 더 높은 항종양 효능. 최종 종양 부피는 ~ 500mm 3 였습니다. ~ 1400mm 3 에 비해 처리되지 않은 쥐의 경우. 종양 모델에서 유의하게 더 높은 항종양 효과는 향상된 투과 및 체류 효과로 인해 종양 조직에 축적될 수 있는 나노크기의 입자에 기인한다. 종양 조직에서 약물의 제어 방출 또한 더 높은 효능에 기여했습니다[24].
결론적으로, 5-플루오로우라실(5-FU) 및 LY294002(LY)가 로딩된 PEG화된 나노리포좀은 식도 편평 세포 암종(ESCC)을 표적화하기 위해 성공적으로 준비되었습니다. FLNP는 산성 환경에서 약물의 점진적인 방출을 허용하는 수용체 매개 세포 흡수를 보여주었습니다. 5-FU와 LY의 조합은 개별 약물에 비해 더 높은 세포독성 효과를 나타냈다. 가장 중요한 것은 FLNP가 무료 칵테일 조합에 비해 암세포에서 훨씬 더 높은 항암 효과를 나타냈다는 것입니다. FLNP에서 LY가 더 빨리 방출되면 자가포식이 억제되어 5-FU에 대한 암세포의 민감도가 향상되어 더 많은 세포 사멸이 발생합니다. 일관되게, FLNP는 다른 그룹에 비해 암세포의 더 큰 세포자멸사(~ 48%)를 유도했습니다. Western blot 분석은 5-FU와 LY가 개별적으로 caspase-3와 PARP의 발현을 증가시키는 반면, 예상대로 FLNP는 뛰어난 항암 효과를 나타내는 이들 단백질 마커의 현저한 발현을 유도했음을 분명히 보여주었습니다. 우리는 단일 나노운반체로부터 자가포식 억제제와 화학요법 약물의 프로그램된 방출이 ESCC에서 항암 요법의 전망을 증가시킬 것이라고 믿습니다. 다양한 편평 세포 암종에 대한 광범위한 연구와 직교 모델 및 환자 유래 이종이식(PDX) 모델의 개발이 향후 조사의 주제가 될 것입니다.
5-Fluorouracil
Enhanced permeation and retention effect
Esophageal squamous cell carcinoma
5-FU and LY-loaded lipid nanoparticles
나노물질
초록 폴리(락트산-코-글리콜산)(PLGA) 기반 나노의약품의 임상 번역은 부분적으로는 식세포에 의한 비특이적 식세포 작용으로 인한 낮은 전달 효율로 인해 제한적입니다. 암세포와 면역 세포 사이의 나노입자 상호작용을 이해하는 것은 여전히 어려운 일입니다. 이 연구에서는 단일 배양 또는 공동 배양 시스템에서 단핵구/대식세포가 있거나 없는 후두 암종 세포에 대한 형광 PLGA 입자(100 nm, 500 nm 및 1 µm)의 세포 내재화에 대한 정량적 조사가 먼저 수행되었습니다. 5~20µg/mL 농도의 PLGA 입자는 500nm 및
초록 파킨슨병(PD)은 중뇌에서 도파민성 뉴런의 점진적인 소실을 특징으로 하며, 줄기 세포 이식 방법은 치료를 위한 유망한 전략을 제공합니다. 이러한 연구에서 생체 내 이식된 세포의 생물학적 행동을 추적하는 것은 줄기 세포 기능에 대한 기본 이해와 임상 효과 평가에 필수적입니다. 본 연구에서 우리는 열분해 방법과 2단계 개질을 통해 폴리아크릴산(PAA)과 메톡시폴리에틸렌글리콜아민(PEG)으로 코팅된 새로운 초소형 초상자성 산화철 나노입자를 개발했습니다. USPIO-PAA/PEG NP는 TEM 및 FTIR에서 볼 수 있듯이 10.0
