용매 없는 폴레이트 기능화 나노니들을 이용한 10-하이드록시캄포테신의 표적 전달

초록

소수성 항암제의 기존 나노입자 제형은 흔히 유기 용매에 의존하여 잔류 독성에 대한 우려를 낳습니다. 본 연구에서는 유기 용매를 완전히 배제한 친환경 합성법으로 폴레이트 변형 10-하이드록시캄포테신(HCPT) 나노니들(HFNDs)을 제조하여, 높은 약물 적재량(70.2%)과 강력한 표적 능력을 동시에 달성했습니다. 체외 실험에서 HFNDs는 비표적 키토산-HCPT 나노니들에 비해 HeLa 세포에서 우수한 세포 흡수를 보였으며, MTT 분석 결과 동일 HCPT 용량에서 향상된 세포독성을 확인했습니다. 생체 내 영상 촬영은 HFNDs의 종양 선택적 축적을 입증했고, HeLa 이종이식 모델에서의 치료 연구는 최소한의 전신 독성으로 뚜렷한 종양 억제 효과를 보여주었습니다. 이 용매 없는 접근법은 안전하고 효율적인 화학요법 전달 및 영상 진단을 위한 유망한 플랫폼을 제시합니다.

배경

지난 20년간 기존 화학요법의 약동학적 한계를 극복하기 위해 나노입자 기반 전달 시스템 연구가 집중되어 왔습니다. 이는 연장된 순환 시간, 능동적 표적화, 다중 모달 영상 능력을 제공합니다[1, 2]. 최근 입자 형태의 중요성이 부각되면서, 높은 종횡비 나노구조가 세포 내재화와 종양 침투를 향상시킨다는 보고가 있습니다[10, 26]. 그러나 대부분의 전략이 여전히 소수성 약물 용해에 유기 용매를 의존하여, 체내 축적 시 안전성 위험을 초래하는 잔류 용매 문제를 안고 있습니다[27]. 본 연구는 HCPT 적재 폴레이트 변형 나노니들을 완전히 친환경적인 용매 없는 방법으로 개발함으로써, 높은 약물 적재량, 표적 전달, 영상 진단 잠재력을 결합하여 이 공백을 해소합니다.

방법

재료

모든 시약은 분석등급으로 그대로 사용했습니다. 탈염수를 전 과정에 사용했습니다. 폴산(FA)은 Bio Basic Inc.에서, HCPT(>99% 순도)는 Lishizhen Pharmaceutical Co.에서, 키토산(Mw=70 kDa, 90% 탈아세틸화)은 Zhejiang Aoxing에서, NHS와 EDC는 Sigma-Aldrich에서 구입했습니다.

FA-키토산 접합체 합성

FA(10 mg), 키토산(20 mg), EDC(4 mg), NHS(4 mg)을 2 mL PBS(pH 5.5)에 넣고 실온에서 12시간 교반했습니다. 혼합물을 pH 10 완충액으로 투석하여 과량의 FA를 제거한 후 원심분리(5,000 rpm)하고 24시간 동결건조하여 CS-FA 분말을 얻었습니다.

HFNDs 제조

HCPT(10 µg)를 200 µL 0.1 M NaOH에 용해(용액 A)하고, CS-FA(10 µg)를 200 µL 0.1 M HCl에 용해(용액 B)했습니다. 용액 A와 B를 1 mL 순수에 30초간 격렬히 교반하며 적가한 후, 초음파 처리(200 W, 빙욕) 6분간 수행했습니다. 현탁액을 원심분리(10,000 rpm, 5분)하고 24시간 동결건조했습니다. 비교를 위해 용액 B에서 CS-FA 대신 키토산만 사용하여 비표적 나노니들(NDs)을 제조했습니다.

특성 분석

SEM(UV-70, 15 kV)으로 형태를 관찰했습니다. 입자 크기와 제타 전위는 Malvern Zetasizer Nano-ZS로 측정했습니다. XRD(X'pert PRO)로 결정성을 평가했습니다. FA 함량은 281 nm에서 UV 분광법으로, HCPT 적재량은 383 nm에서 형광 분광법으로 정량했습니다. 적재 효율과 포집 효율은 아래 식 (1)-(4)로 계산했습니다.

$$\begin{aligned} \text{약물 적재량 \%} &= \frac{\text{HFNDs 내 HCPT 중량}}{\text{HFNDs 중량}}\times100\%\;(1)\\ \text{포집 효율 \%} &= \frac{\text{HFNDs 내 약물 중량}}{\text{투입 약물 중량}}\times100\%\;(2)\\ \text{접합체 내 FA \%} &= \frac{\text{접합체 내 FA 중량}}{\text{접합체 중량}}\times100\%\;(3)\\ \text{FA 적재량 \%} &= (1-\text{HCPT 적재량 \%})\times\text{접합체 내 FA \%}\times100\%\;(4) \end{aligned}$$

체외 약물 방출 연구

HFNDs를 10 mL PBS에 분산시키고 3 kDa MWCO 투석 주머니에 넣어 200 mL PBS(pH 7.4, 37°C, 100 rpm)에 담갔습니다. 48시간 동안 시료를 채취하여 형광 분광법으로 분석했습니다.

세포 공초점 영상

HeLa 세포를 배양 24시간 후 HFNDs에 8시간 노출시켰습니다. Leica 공초점 현미경으로 영상 촬영(HCPT 여기 382 nm, 방출 500-550 nm)했습니다.

형광 기반 세포 흡수 정량

NDs 또는 HFNDs(동일 HCPT 당량)와 6시간 배양 후 세포를 세척, 트립신/EDTA로 분해, 초음파 처리했습니다. HCPT 함량을 382 nm 형광으로 정량했습니다.

세포독성 분석

HeLa 세포를 96웰 플레이트에 배양 후 MTT 분석을 수행했습니다. 24시간 약물 노출 후 5 mg/mL MTT 20 µL를 4시간 첨가하고, 150 µL DMSO를 가한 후 570 nm에서 흡광도를 측정했습니다.

생체 분포

DiR 적재 NDs와 HFNDs를 HeLa 종양 보유 누드 마우스에 정맥 주사했습니다. Maestro 시스템으로 1, 4, 8, 12, 24시간 후 형광 영상을 촬영했습니다. 24시간에 종양과 주요 장기를 적출하여 생체 외 영상을 수행했습니다.

생체 내 종양 억제

종양 부피가 ~60 mm³에 도달했을 때, 생리식염수, 유리 HCPT, NDs, HFNDs(마우스당 HCPT 80 µg)를 3일 간격으로 정맥 주사했습니다. 종양 부피(0.5×L×W²)와 체중을 21일간 모니터링했습니다. 사후 종양 무게 측정과 H&E 염색으로 조직학적 분석을 수행했습니다.

통계 분석

양측 Student's t-검정으로 분석했으며, *p* < 0.05를 유의미로 판단했습니다(95% 신뢰도).

결과 및 고찰

FA-키토산 접합체 합성

FA는 EDC/NHS 매개 아미드화 반응으로 키토산에 공유 결합되었습니다(그림 1). FT-IR 스펙트럼(그림 2)에서 1,605 cm⁻¹의 뚜렷한 C=O 신축 진동이 나타나 아미드 결합 형성을 확인했습니다. UV 정량 결과 접합체 내 FA 적재량은 23.4 ± 2.5%였습니다.

CS-FA 접합체 합성 경로

FTIR 스펙트럼: (a) FA, (b) 키토산, (c) CS-FA

HFNDs 제조

HCPT의 난용성과 키토산의 산 용해성을 이용했습니다: HCPT를 NaOH에, CS-FA를 HCl에 용해시킨 후 두 용액을 중화시키면 두 물질 모두에 불량 용매가 되어 HCPT 침전과 동시에 CS-FA가 나노니들로 포집됩니다(그림 3a). 초음파 처리와 CS-FA의 입체 안정화 효과가 벌크 결정 성장을 억제하여 높은 종횡비의 나노니들을 생성했습니다(그림 3b-c). 실험 계획법(표 1)으로 HCPT:CS-FA 비율, 초음파 출력, pH, 농도를 최적화하여 원하는 형태를 얻었습니다.

a 친환경 합성 모식도; b, c HFNDs SEM 영상

SEM 분석(그림 4) 결과 과량 CS-FA는 입자 표면을 코팅했고, 부족 시 응집이 발생했습니다. 중성 pH가 나노니들 무결성 유지에 필수적이었고, 초음파 출력은 응집과 파편화에 영향을 주었습니다. 혼합 농도 증가 시 입자 크기가 감소함을 DLS로 확인했습니다(그림 4f). 최적화된 HFNDs는 평균 길이 ~800 nm, 폭 ~80 nm, 수동적 직경 104.3 ± 5.7 nm, 제타 전위 +16.3 ± 1.9 mV를 보였습니다. 2 wt% 분산액이 ≥2.5일간 안정했습니다.

a-f 다양한 조건에서의 SEM 영상; g 크기 분포; h 제타 전위

약물 적재량은 70.2 ± 3.1%, 포집 효율은 83.1%였습니다. 접합체의 FA 비율로부터 계산한 총 질량 대비 FA 비율은 7.0%였습니다.

XRD 분석

XRD 패턴(그림 5)에서 HFNDs 내 HCPT는 결정성을 유지했고, 반결정성 키토산은 넓은 피크를 보였습니다. 반면 벌크 HCPT 결정(그림 6)은 막대 모양으로 10 µm 이상이었으며, 이는 CS-FA가 HCPT 성장 동역학을 조절함을 시사합니다.

XRD 패턴: (a) 키토산, (b) HCPT, (c) HFNDs

벌크 HCPT 결정 SEM 영상

체외 약물 방출 연구

유리 HCPT는 1시간 내 30%, 18시간에 거의 100% 방출되었습니다. 반면 HFNDs는 48시간 동안 현저히 느린 지속적 방출 프로파일을 보였습니다(그림 7). 이는 CS-FA 껍질의 확산 장벽 효과로, 치료 농도 유지와 피크 관련 독성 최소화에 이상적입니다.

PBS(pH 7.4, 37°C)에서의 체외 방출 프로파일: (a) 유리 HCPT; (b) HFNDs

세포 흡수

공초점 영상(그림 8)에서 HFNDs 처리 HeLa 세포가 비표적 NDs보다 강한 HCPT 형광을 보였으며, 이는 폴레이트 매개 흡수를 나타냅니다. 정량적 형광 분석(그림 9)에서도 HFNDs의 더 높은 내재화율을 확인하여 표적화 전략을 검증했습니다.

8시간 후 세포 내 HCPT 전달: (a) HFNDs; (b) NDs

8시간 후 HeLa 세포 형광 정량: (a) HFNDs; (b) NDs; *p* < 0.05

세포독성 분석

MTT 결과(그림 10)에서 HFNDs는 동일 HCPT 농도에서 유리 HCPT나 NDs보다 높은 세포 사멸을 유도했습니다. 이는 효율적인 수용체 매개 내재화와 지속적 세포 내 약물 방출의 이중 효과 덕분입니다.

24시간 후 세포 생존율: (a) 유리 HCPT; (b) NDs; (c) HFNDs; *p* < 0.05

생체 분포

생체 내 영상(그림 11a)에서 DiR-NDs는 종양 신호가 미미했으나, DiR-HFNDs는 시간 의존적 뚜렷한 축적을 보이며 12시간에 정점에 달했습니다. 생체 외 분석(그림 11b-c)에서 HFNDs의 더 높은 종양 형광이 확인되어 폴레이트 매개 종양 표적화가 성공했음을 입증했습니다.

a 분포 및 종양 축적; b 생체 외 형광; c 종양 내 DiR 강도; *p* < 0.05

생체 내 종양 억제

HFNDs가 가장 유의미한 종양 성장 억제를 보였으며, 최종 종양 무게가 유리 HCPT나 NDs보다 현저히 낮았습니다(그림 12c). 조직학(그림 12d)에서 HFNDs 처리 종양의 광범위한 괴사가 관찰되었습니다. 중요하게도 HFNDs는 체중 감소나 명백한 독성을 일으키지 않았으나, 유리 HCPT는 뚜렷한 부작용을 보였습니다(그림 12b). 이는 HFNDs가 강력한 항종양 활성과 우수한 안전성 프로파일을 겸비함을 보여줍니다.

생체 내 항종양 효능: (a) 종양 부피; (b) 체중; (c) 종양 무게; (d) H&E 조직학

결론

본 연구는 폴레이트 기능화 HCPT 나노니들을 제조하는 완전히 친환경적인 용매 없는 경로를 제시합니다. 이는 높은 약물 적재량, 표적 세포 흡수, 지속적 방출을 결합합니다. 체외 및 생체 내 데이터는 기존 제형 대비 우수한 항암 활성과 감소된 전신 독성을 확인시켜줍니다. 이 플랫폼은 환경 친화적 화학이 나노입자 기반 치료제의 발전에 어떻게 활용될 수 있는지 보여주는 모범 사례입니다.