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Atrazine의 고감도 검출을 위한 새로운 자기탄성 나노바이오센서

초록

여기에서 우리는 먼저 경쟁 면역 분석을 사용하는 아트라진의 고감도 검출을 위해 ME 재료 및 금 나노입자(AuNP)를 기반으로 하는 무선 자기탄성(ME) 나노바이오센서를 보고합니다. 시간에 따라 변하는 자기장에 대한 응답으로 ME 재료는 질량 부하에 의해 영향을 받을 수 있는 공진 주파수에서 세로 방향으로 진동합니다. ME 재료에 코팅된 AuNPs 층은 생체 적합성, 안정성 및 감도에 기여합니다. 아트라진 항체는 AuNPs 코팅된 ME 물질 표면에 단백질 A를 통해 고정화되어 나노바이오센서의 성능을 향상시켰다. AFM(Atomic Force Microscope) 분석을 통해 아트라진 항체의 고정화가 성공적임을 입증했습니다. 또한, 감도를 향상시키기 위해 아트라진-알부민 접합체(Atr-BSA)가 아트라진 항체와의 결합을 위해 아트라진과 경쟁하도록 유도하여 신호 반응을 증폭시켰다. 공명 주파수 이동은 1 ng/mL ~ 100 μg/mL 범위의 아트라진 농도 로그에 반비례하고 선형적으로 비례하며 감도는 3.43Hz/μg mL −1 입니다. 1ng/mL의 검출 한계는 미국 환경 보호국(EPA)에서 설정한 기준보다 훨씬 낮습니다. 실험 결과는 ME 나노바이오센서가 아트라진에 대해 강한 특이성과 안정성을 나타냄을 나타냈다. 이 연구는 아트라진의 신속하고 선택적이고 고감도 검출을 위한 새로운 편리한 방법을 제공하며, 이는 수질 모니터링 및 기타 환경 검출 분야에서의 응용에 의미가 있습니다.

소개

공업과 농업의 급속한 발전과 더불어 점점 더 많은 환경오염물질이 생태환경으로 방출되어[1] 관련 연구에 대한 우려가 만연하였다[2, 3]. 최근 몇 년 동안 농업 분야에서 품질과 수확량을 향상시키기 위해 제초제를 점점 더 많이 사용하고 있지만 많은 제초제가 수년 동안 물과 토양에 활성 상태로 남아 심각한 환경 오염을 일으킬 수 있습니다[4]. 제초제 오염은 물 또는 농산물의 생태학적 오염으로 인해 상당한 주목을 받았습니다[5]. 제초제 중 아트라진(2-클로로-4-에틸아미노-6-이소프로필아미노-1,3,5-트리아진)은 전 세계적으로 광엽식물 및 풀 잡초 방제에 가장 광범위하게 사용됩니다[6].

아트라진은 일부 다년생 잡초에 일정한 억제 효과가 있지만 환경 오염 물질로서 매우 독성이 있으며[7] 인간과 다른 동물 종에 건강 위험을 일으킬 수 있습니다[8]. 장기간 고농도의 아트라진 섭취는 암, 선천적 기형, 심장 및 간 손상과 같은 동물이나 인간의 건강을 손상시킬 수 있습니다[9, 10]. 미국, 유럽 연합, 일본은 모두 아트라진을 내분비 교란 물질 목록에 포함시켰습니다[11]. 미국에서는 환경 보호국(EPA)이 식수에서 아트라진의 허용 한도를 3μg/L(평생 건강 권고 수준)로 허용합니다[12]. 따라서 저농도에서 아트라진을 정확하게 정량할 필요가 있습니다.

LC와 질량 분석법 결합(LC-MS)[13], 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)[14], 질량 분석법과 결합된 가스 크로마토그래피(GC–MS)를 포함하여 아트라진 검출을 위해 많은 기존의 분석 기술이 개발되었습니다. )[15], 그러나 이러한 방법들도 고비용, 큰 기구의 필요성, 열악한 선택성 및 시간 소모적인 것과 같은 몇 가지 한계가 있다[16].

무선 질량 감지 플랫폼으로서 ME 재료로 만든 자기탄성(ME) 센서는 저비용, 고감도, 더 작은 크기 및 사용 용이성이라는 중요한 이점으로 인해 다양한 응용 분야를 위해 널리 개발되었습니다[17, 18]. 현재 ME 센서는 일반적으로 Metglas 2826 MB(Fe40 Ni384 B18 ) [19]. 외부에서 인가된 교번 및 정적 자기장 하에서 ME 재료는 공진 주파수에서 세로 방향으로 진동하여[20] 직접적인 물리적 연결 없이 픽업 코일에 의해 무선으로 감지될 수 있는 자속 밀도를 생성합니다[21]. 식에 따르면 (1) [22], 기본 공진 주파수 f 0 재료 길이 L에 따라 다름 , 밀도 ρ , 탄성 계수 E , 및 푸아송 비 v .

$$ {f}_0=\frac{1}{2L}\sqrt{\frac{E}{\rho \left(1-{v}^2\right)}} $$ (1)

작은 추가 질량 부하 ∆m 질량 M의 ME 재료 표면에 증착 (∆m ) 공진 주파수의 이동을 유발합니다(∆f ), 이는 식에 의해 주어진다. (2) [23].

$$ \frac{\Delta f}{\Delta m}=-\frac{f_0}{2M} $$ (2)

ME 재료의 위의 고유한 특성에 기초하여 ME 재료의 공진 주파수는 추가 질량 부하가 증가함에 따라 감소합니다. 따라서 감지막을 이용한 기능화를 통해 ME 재료는 응력/압력[24], 온도/습도[25], 이산화탄소[26], 내독소 [27], Salmonella typhimurium/Bacillus anthracis 포자 [28] 및 대장균 O157:H7 [29]. 그러나 우리가 아는 한 ME 재료는 아트라진 검출에 적용되지 않았습니다.

본 연구에서는 우수한 특성과 장점을 활용하여 직접 경쟁 면역 측정법을 기반으로 ppb 수준의 아트라진 검출을 위해 ME 물질을 기판으로, 금 나노 입자(AuNPs)를 코팅층으로 사용하는 무선 ME 나노 바이오센서를 먼저 제안했습니다. 절차. 공유 무작위 항체 고정화와 비교하여 공유 지향 전략은 나노 바이오 센서의 감도를 향상시키는 데 더 유리합니다. 단백질 A는 항체의 Fc 면역글로불린 영역과 특이적으로 결합하는 흥미로운 대안이기 때문에 아트라진 항체의 지향성 고정에 사용되어 가장 높은 고정 밀도를 제공하여 더 나은 항원 결합 효율을 나타내고 나노바이오센서의 성능을 향상시킵니다. [31]. 아트라진에 대한 직접적인 경쟁 면역분석은 AuNPs 코팅된 ME 물질 표면에 공유적으로 변형된 단백질 A에 대한 아트라진 항체의 방향성 고정화에 의해 구성되었으며, 아트라진 항체와 아트라진-알부민 접합체(Atr-BSA) 및 아트라진의 경쟁 반응이 뒤따랐습니다. Atr-BSA는 신호 응답을 증폭하도록 유도되어 나노 바이오 센서의 감도를 크게 증가시킵니다. ME 나노바이오센서의 효율성을 평가하여 미량의 아트라진 검출을 위한 새로운 ME 나노바이오센서가 성공적으로 개발되었음을 입증했습니다.

자료 및 방법

자료

아트라진 항체, 아트라진-알부민 접합체 항원(Atr-BSA), 아트라진 및 단백질 A는 EastCoast Bio(미국 메인주)에서 구입했습니다. Simazine, prometryn 및 디클로로디페닐트리클로로에탄(DDT)은 Chengdu Huaxia Chemical Reagent Co., Ltd.에서 입수했습니다. Cysteamine, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드 염산염(EDC), N -hydroxysulfosuccinimide(NHS), 소 혈청 알부민(BSA, 99%) 및 인산염 완충 식염수(PBS 완충액, pH =7.4)는 Sigma-Aldrich Corporation(Saint Louis, MO, USA)에서 구입했습니다.

ME 나노바이오센서 제작

ME 나노센서 플랫폼의 준비

Metglas 합금 2826(Fe40)으로 구성된 ME 소재 리본 Ni384 B18 )는 Honeywell Corporation(미국 뉴저지주 모리스타운)에서 구입하여 컴퓨터 제어 레이저 절단기를 사용하여 5mm × 1mm × 0.028mm로 절단했습니다. 유기 필름과 파편을 제거하기 위해 ME 리본을 각각 10분 동안 아세톤과 에탄올로 초음파 세척하고 탈이온수로 헹군 다음 질소 기류에서 건조했습니다(그림 1a). AuNP와 리본 표면 사이의 접착력을 향상시키기 위해 ME 리본 표면의 양면에 ~ 100nm 두께의 크롬 나노 입자 층이 스퍼터링되었습니다. 그 후 크롬 코팅된 ME 리본 표면의 양면에 AuNP를 스퍼터링하여 생체 적합성을 개선하고 리본을 산화 및 부식으로부터 보호했습니다. 그림 1의 주사전자현미경(SEM) 이미지는 ME 리본에 코팅된 AuNPs가 구형 크기임을 보여주었다. AuNP와 -SH는 Au-S 결합을 쉽게 형성할 수 있습니다. AuNPs는 저렴한 가격, 비부식성, 생체 적합성 및 무독성이라는 매력적인 이점 외에도 [32] 화학적 또는 생체 인식 요소 수정을 위한 우수한 인터페이스를 제공할 수 있습니다[33, 34]. 그 후, ME 리본을 200°C의 진공 오븐에서 2시간 동안 어닐링하여 잔류 내부 응력을 완화하고 ME 리본에 AuNPs 층의 접착을 촉진했습니다. 그런 다음 ME 나노센서 플랫폼이 완성되어 아트라진 항체 고정화 준비가 되었습니다(그림 1b).

<그림>

ME 나노바이오센서 기능화 절차의 개략도:(a ) 베어 ME 리본; (b ) AuNPs 코팅; ( ) SAM 층; (d ) 단백질 A 고정화; ( ) 항체 변형; (f ) BSA 차단; ( ) 아트라진 및 Atr-BSA가 항체와 경쟁적으로 결합됨; AuNPs 코팅된 나노센서 표면의 SEM 이미지

아트라진 항체 고정

AuNPs 코팅된 나노센서 플랫폼을 각각 5분 동안 아세톤, 이소프로판올, 탈이온수 및 에탄올로 초음파 세척하고 질소 기류 하에서 건조시켰다. 그런 다음, 나노 센서 플랫폼을 실온에서 12시간 동안 시스테아민 용액(10mM)에 침지하여 자기 조립 단층(SAM)을 얻었다(그림 1c). 단백질 A(1 mg/mL)는 실온에서 30분 동안 4 mg/mL EDC-4 mg/mL NHS로 활성화되었습니다. 그 후, 활성화된 단백질 A를 37°C에서 30분 동안 SAM 변형 나노센서에서 배양하고 PBS 완충액으로 헹구었습니다(그림 1d). 그런 다음 나노 센서 플랫폼을 아트라진 항체와 함께 50분 동안 배양하고 PBS 완충액으로 세척했습니다(그림 1e). 비특이적 흡착을 방지하기 위해 아트라진 항체가 코팅된 나노센서를 0.5% BSA로 30분 동안 추가로 처리한 다음 PBS 버퍼로 세척하여 결합되지 않은 BSA를 제거하고 질소 기류 하에서 건조시켰다. 마지막으로, ME 나노바이오센서는 아트라진 검출을 위해 제작되었습니다(그림 1f).

신호 측정

ME 나노바이오센서의 공진 주파수는 그림 2와 같이 벡터 네트워크 분석기(AV3620A, 41st Institute of CETC, Qingdao, China)와 함께 바이알에 감긴 픽업 코일을 이용하여 측정하였다. 자기장, 픽업 코일과 연결된 네트워크 분석기는 S11에서 작동되었습니다. 스위프된 주파수 신호를 코일에 제공하기 위한 모드이며 코일에서 반사된 신호를 모니터링할 수 있습니다. 또한, 공명 거동을 향상시키기 위해 막대 자석에 의해 생성된 정적 자기장이 적용되었습니다. 나노바이오센서는 테스트할 30μL 샘플 용액이 들어 있는 바이알에 수직 및 무선으로(측정 시스템과의 와이어 연결 없이) 삽입되었습니다. 모든 실험은 PBS(0.1 M, pH 7.4) 용매 시스템에서 실온(25 ± 2 °C)에서 수행되었습니다. 나노바이오센서의 공진 주파수는 S11 5분마다 모니터링 및 기록되는 매개변수입니다.

<사진>

무선 ME 나노바이오센서 측정 시스템의 개략도

결과 및 토론

나노바이오센서 표면 형태의 특성화

아트라진 항체의 고정화 효과를 알아보기 위해 나노바이오센서 표면을 원자간력현미경(AFM, ND-100, Park System, Korea)으로 관찰하였다. AuNPs 코팅된 나노바이오센서와 항체 변형 나노바이오센서 표면의 AFM 이미지는 각각 그림 3a, b에 나와 있습니다. 증가된 표면 거칠기는 공유적으로 고정된 아트라진 항체의 결과임이 분명합니다. AFM 단면 지형에 대한 포괄적인 분석은 AuNPs 코팅된 나노바이오센서가 13.421 nm의 높이 변화를 가짐을 보여줍니다. 그러나 항체 변형 후 값은 28.425 nm로 증가했습니다. 항체 분자의 직경이 약 15 nm인 것으로 잘 알려져 있는 바와 같이, 아트라진 항체의 고정화에 성공하였다는 결론은 명백하다.

<그림>

(a의 AFM 이미지 ) AuNP 코팅 및 (b ) 항체 변형 나노바이오센서 표면

아트라진 항체 농도 최적화

항체의 고정화 농도는 나노바이오센서의 감도에 중요한 영향을 미친다. 따라서 서로 다른 고정화 농도의 아트라진 항체(25μg/mL, 50μg/mL, 75μg/mL, 100μg/mL)를 사용하여 나노바이오센서의 공명 주파수 응답을 평가할 필요가 있었습니다. 그림 4에서 공명 주파수 이동이 50μg/mL에서 최대에 도달했음을 알 수 있습니다. 아트라진 항체의 농도가 75μg/mL까지 올라가면 입체장애와 정전기적 반발로 인해 반응이 떨어지기 시작했다[35]. 즉, 50㎍/mL 아트라진 항체는 비교적 포화된 고정화를 달성할 수 있다. 따라서 50 μg/mL는 고정화를 위한 아트라진 항체의 최적 농도였습니다.

<그림>

다양한 고정화 농도의 아트라진 항체에 대한 ME 나노바이오센서의 주파수 응답(0 μg/mL, 25 μg/mL, 50 μg/mL, 75 μg/mL, 100 μg/mL)

Atr–BSA 농도 최적화

면역 반응에서 아트라진과 Atr-BSA는 나노바이오센서 표면에서 제한된 수의 아트라진 항체 부위를 놓고 경쟁했다. 따라서 고정화를 위한 최적의 아트라진 항체 농도에서 Atr-BSA의 작업 농도는 중요한 인자로서 나노바이오센서의 감도에 영향을 미친다. 다양한 농도(20μg/mL, 40μg/mL, 60μg/mL, 80μg/mL)의 Atr-BSA에 대한 ME 나노바이오센서의 공명 주파수 응답을 결정하여 최적화 프로세스를 조사했습니다. 도 5에 나타낸 바와 같이, 최대 반응은 40㎍/mL에서 관찰되었다. 따라서 40 μg/mL Atr–BSA가 다음 측정에 사용되었습니다.

<그림>

다양한 농도(20μg/mL, 40μg/mL, 60μg/mL, 80μg/mL)의 Atr-BSA에 대한 ME 나노바이오센서의 주파수 응답

아트라진 감지

그림 6은 15μL Atr-BSA(40μg/mL)와 15μL 아트라진(0ng/mL, 1ng/mL, 10ng)의 샘플 혼합물에서 측정된 ME 나노바이오센서의 실시간 주파수 응답을 보여줍니다. /mL, 100ng/mL, 1000ng/mL, 10μg/mL, 50μg/mL, 100μg/mL). 그림 1g와 같이 atrazine과 Atr-BSA는 nanobiosensor 표면에 고정된 항체와 경쟁적으로 결합하여 nanobiosensor 표면에 가해지는 질량 부하를 증가시켜 결과적으로 incubation에 따른 공명 주파수를 감소시킨다. 시각. 그림 6에서 정상 상태 응답은 일반적으로 약 50분에서 달성된다는 것이 분명합니다. Atr-BSA 농도와 아트라진 항체 부위의 수는 고정되어 있으므로 나노바이오센서에 결합된 Atr-BSA의 양은 용액 내 아트라진 농도에 반비례한다. Atr-BSA의 분자량은 atrazine의 분자량보다 큽니다. 따라서 나노바이오센서의 공명 주파수는 용액 내 아트라진 농도에 반비례하여 변화한다. 도 6에서 보는 바와 같이 아트라진 농도가 증가함에 따라 공명 주파수 이동의 속도와 크기가 감소하였으며, 아트라진 농도가 높을수록 공진 주파수 이동이 더 작게 유도될 수 있다. 그림 6 곡선 *은 검출 신호보다 훨씬 적은 약 48Hz인 Atr-BSA에 대한 블랭크 대조군 센서(아트라진 항체 고정화 없음)의 배경 응답을 나타내며, 이는 비특이적 흡착을 무시할 수 있음을 나타냅니다. 따라서 무선 ME 나노바이오센서의 공진 주파수 이동을 통해 아트라진 농도를 검출할 수 있으며, 이는 반비례 관계입니다.

<그림>

0 ~ 100μg/mL 범위의 다양한 아트라진 농도에서 실시간 주파수 응답. * Atr-BSA에 대한 블랭크 대조군 반응(아트라진 항체 고정화 없음)

처음 50분 동안 ME 나노바이오센서에서 아트라진을 검출하기 위한 표준 보정 곡선은 그림 7에 나와 있습니다. 각 농도에 대해 나노바이오센서 보정 실험은 동일한 조건에서 5회 수행되었습니다. 공명 주파수 이동은 1ng/mL에서 100μg/mL 범위의 아트라진 농도의 로그 값과 선형으로 나타나는 것으로 나타났으며, 이는 ∆f로 나타낼 수 있습니다. =54.717 log C 아트라진 − 442.45 (R 2 =0.971). 감도는 3.43Hz/μg mL로 계산됩니다. −1 . 그림 7에서 검출한계(LOD)가 1ng/mL임을 알 수 있으며, 이는 현재 사용 가능한 표준을 충족하는 US EPA에서 제공하는 아트라진의 허용 상한인 3μg/L보다 훨씬 낮습니다. 게다가, 검출 한계는 이전에 보고된 방법보다 분명히 낮습니다[36, 37]. 저비용, 무선, 고감도 나노바이오센서가 아트라진의 실시간 검출을 위해 성공적으로 구축되었음을 입증했습니다.

<그림>

보정 곡선:다양한 아트라진 농도의 함수로서 공명 주파수의 50분 이동

아트라진은 소분자이기 때문에 ME 나노바이오센서의 감도를 개선하기 위해 직접적인 경쟁 면역분석법이 사용되었습니다. 직접 경쟁 면역 분석에서 항체는 센서 표면에서 변형되고 신호 반응은 Atr-BSA 분자의 결합으로 인해 발생합니다. 반대로, 간접 경쟁 면역 분석에서 Atr-BSA는 센서 표면에 고정되고 반응은 항체 분자의 결합으로 인해 발생합니다. 문헌 연구[38]와 우리의 결과에 따르면, 직접 경쟁 면역 분석은 소분자 모니터링에 적합합니다. 간접 경쟁 면역 분석은 미량 농도의 분석 시료에 매우 민감합니다[39]. 간접 경쟁 면역 분석법은 감도가 더 높지만[40, 41], 작동이 복잡하고 반복적으로 신뢰할 수 있는 사용을 위해 구현하기 어려울 수 있습니다[36]. 그러나 직접 경쟁 면역 분석법은 매우 빠르고 사용이 간편하며 자체 포함되어 있어 추가 시약이 필요하지 않습니다[36]. 따라서 향후 개발을 위해서는 직접 경쟁 면역 분석이 가장 유망한 방법이 될 수 있습니다.

ME 나노바이오센서 특이성

그림 8과 같이 프로메트린, 시마진, DDT와 같은 다른 살충제에 대한 나노바이오센서의 반응을 결정하여 아트라진에 대한 ME 나노바이오센서 특이성을 조사했습니다. 비특이적 흡수에 의한 간섭, prometryn과 simazine에 대한 반응은 blank 용액과 유사한 반응 수준을 보인 DDT보다 약간 더 컸다. 그것은 prometryn과 simazine이 모두 triazine 살충제에 속하는 atrazine과 유사한 구조를 가지고 있기 때문일 수 있습니다. 그러나 DDT는 일종의 유기염소 살충제입니다. 결과는 아트라진이 나노바이오센서 표면에 고정된 항체와 효과적으로 인식되고 특이적으로 결합되었음을 나타내었다. 따라서 ME 나노바이오센서는 아트라진 검출에 대해 강한 특이성을 보였다.

<그림>

100μg/mL 농도에서 다른 간섭 물질에 대한 ME 나노바이오센서의 공명 주파수 응답

ME 나노바이오센서 안정성

그림 9는 아트라진 검출에 대한 ME 나노바이오센서의 안정성을 보여줍니다. 동일한 ME 나노바이오센서 중 6개를 준비하고 4°C에 보관했으며, 모든 센서는 6일까지 격일로 10ng/mL 아트라진에 대해 테스트되었습니다. 모든 단일 감지 주기는 50분 동안 하나의 나노바이오센서만 테스트했습니다. 나노바이오센서의 공명 주파수 응답은 거의 일정하게 유지되고 상대 표준 편차(RSD)는 1.8%로 계산된다는 것이 분명합니다. 결과는 ME 나노바이오센서가 아트라진 검출에 대해 우수한 안정성을 나타냄을 보여줍니다.

<그림>

ME 나노바이오센서에서 10ng/mL 아트라진의 안정성 측정

결론

ME 재료 및 AuNP를 기반으로 하는 무선 ME 나노바이오센서는 경쟁 면역분석을 사용하여 아트라진의 실시간 고감도 검출을 위해 성공적으로 개발되었습니다. 단백질 A를 통한 아트라진 항체의 지향성 고정화는 나노바이오센서의 성능을 향상시켰다. 중분자량의 Atr-BSA 및 아트라진은 나노바이오센서 표면의 아트라진 항체와 경쟁적으로 결합하여 신호 응답을 증폭하여 감도를 개선했습니다. 결합된 Atr-BSA에 의해 주로 유도된 공명 주파수 이동은 목표 아트라진 농도에 반비례합니다. 또한, atrazine 항체와 Atr-BSA의 작업 농도는 각각 50μg/mL 및 40μg/mL로 최적화되었습니다. 최적의 조건에서 ME 나노바이오센서는 1ng/mL ~ 100μg/mL의 아트라진에 대한 광범위한 선형 측정 범위와 3.43Hz/μg mL의 만족스러운 감도를 표시합니다. −1 법적 요건에 충분하고 보고된 다른 방법보다 낮은 1ng/mL의 검출 한계. AFM 이미지는 아트라진 항체가 지향성 방식으로 나노바이오센서 표면에 성공적으로 고정화되었음을 확인했습니다. 실험 결과는 ME 나노바이오센서가 아트라진에 대해 높은 특이성과 안정성을 가지고 있음을 보여줍니다. 검출 한계, 단순성, 일회용 속성 및 무선 특성에 대한 효과로부터 이 연구는 아트라진의 고감도 검출을 위한 새로운 방법을 제안했을 뿐만 아니라 다른 환경 오염 물질 검출 및 수질 모니터링에 대한 잠재적인 실용성을 나타냈습니다.

약어

AFM:

원자간력현미경

Atr–BSA:

아트라진-알부민 접합체 항원

AuNP:

금 나노 입자

BSA:

소 혈청 알부민

DDT:

디클로로디페닐트리클로로에탄

EDC:

1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드 염산염

저:

자기탄성

NHS:

아니 -히드록시술포숙신이미드

PBS:

인산염 완충 식염수

SAM:

자기 조립 단층

SEM:

주사 전자 현미경

미국 EPA:

미국 환경 보호국


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