이중 모드 탄소 나노점 센서로 빠르고 선택적인 과산화수소 검출

초록

과산화수소(H₂O₂)는 포도당/포도당 산화효소(GOD) 반응과 같은 산화효소 기반 효소 반응의 중요한 생성물이다. 따라서 생성된 H₂O₂ 탐지를 통해 다양한 탄수화물과 그 산화효소 검출을 달성하는 것은 매우 의미 있다. 본 연구에서는 형광 및 발색 출력을 모두 가진 새로운 이중 모드 나노센서로 활용될 수 있는 한 종류의 이중 방출 탄소 나노점(CDs)을 보고한다. 이중 모드 나노센서는 비장식 이중 방출 CDs만으로 구축되며, CD 용액에 다양한 농도의 H₂O₂ 첨가 시 현저한 형광 및 발색 변화가 관찰되어 H₂O₂ 육안 검출이 가능하다. 나노센서 메커니즘은 H₂O₂에서 유래한 하이드록실 라디칼 같은 외부 화학적 자극이 CD 표면 특성 변화와 응집을 일으켜 CD 방출과 흡수를 지배한다는 사실에 기인한다. 구축된 이중 모드 나노센서는 좋은 생체적합성과 H₂O₂에 대한 높은 선택성을 보이며, 0.05~0.5 M 선형 검출 범위와 14 mM 낮은 검출 한계를 허용한다.

배경

형광 탄소 나노점(CDs)은 좋은 생체적합성, 낮은 독성, 조절 가능한 광발광(PL), 높은 양자 수율 같은 독특한 물리화학적 특성으로 광범위한 연구 관심을 끌었다[1-9]. 이러한 특성 덕분에 CDs는 바이오이미징, 바이오센서, 발광 소자 등 다양한 분야에서 잠재적 응용을 찾았다[1-9]. 또한 상향/하향 변환 능력, 광깜빡임 부재, 유기 염료나 반도체 양자점(QDs) 대비 높은 광안정성 덕분에 형광 나노센서에 더 적합하다[10-19].

과산화수소(H₂O₂)는 살균 능력으로 의료 소독제로 널리 쓰이는 일반적인 산화제이다. 또한 포도당/포도당 산화효소(GOD) 반응 같은 산화효소 기반 효소 반응의 중요한 생성물이다. 따라서 H₂O₂ 탐지를 통한 감지 전략은 탄수화물과 그 산화효소 검출을 위한 유망한 접근법이 될 수 있다. 이 때문에 H₂O₂ 감지는 당뇨병 같은 탄수화물 대사 질환 모니터링에 사용될 수 있다. 현재 다양한 분석 방법을 이용해 H₂O₂ 측정 기반 포도당 센서가 개발되었으나, 기존 센서 시스템은 주로 전도도, 형광, 발색 변화 같은 단일 신호에 기반한다[20-22]. 최근 나노기술 발전, 특히 반도체 QDs나 신흥 탄소 기반 나노입자 같은 형광 나노입자 분야 발전으로 새로운 H₂O₂ 나노센서가 등장하였다. Lu 등은 CdTe QDs와 로다민을 결합한 이중 방출 마이크로하이브리드(DEMBs)를 개발하여 H₂O₂ 생성 모니터링을 통한 포도당 비율형 형광 감지를 구현하였다[20]. Zhang 등은 CDs 형광 소멸을 통한 H₂O₂에 선택적이고 민감하게 반응하는 형광 나노센서를 보고하였다[21,22]. 그러나 이러한 연구는 비싼 화학 성분과 중금속 오염 같은 반도체 기반 QDs 고유 결함을 필연적으로 동반한다. 또한 단일 신호 판독(형광 소멸 또는 색 변화) 기반 나노센서는 환경 요인 변동과 실험 조작 오류로 인해 분석 안정성이 낮을 수 있다. 위 고려사항을 바탕으로, H₂O₂ 농도 변화에 매우 민감한 형광과 용액 색을 가진 새로운 종류의 형광 CDs를 개발하고자 한다. 이러한 CDs 기반 이중 모드 나노센서는 CD 용액의 형광 및 발색 변화를 동시에 검사하여 H₂O₂를 뚜렷하고 민감하게 감지할 수 있으며, 이는 H₂O₂ 육안 검출 실현에 유리하다.

본 연구에서는 시트르산, 요소, N,N-디메틸포름아마이드(DMF)를 각각 탄소원, 질소원, 반응 용매로 사용하여 용매열법으로 새로운 유형의 CDs를 합성하는 간편하고 편리한 방법을 개발하였다. 이 CDs는 가시광선 아래 어두운 붉은 용액 색을 띠며 365 nm 자외선 램프 아래 청색과 녹색 형광 방출을 보인다. 형광과 용액 색은 H₂O₂ 농도 변화에 매우 민감하다. 따라서 이러한 CDs 기반 이중 모드 나노센서는 CD 용액의 형광 및 발색 변화를 동시에 검사하여 H₂O₂를 뚜렷하고 민감하게 감지할 수 있으며, 육안 검출 실현에 유리하다. 고가 장비 도입 없이 이러한 CDs 기반 이중 모드 나노센서를 구축하였다. 이 감지 시스템은 잠재적 조작 오류를 효과적으로 방지하고 측정 신뢰도를 현저히 향상시킬 수 있다. 또한 CD 기반 나노센서는 좋은 생체적합성과 높은 수용성 덕분에 혈당 검출에 in vivo와 in vitro 모두에서 유망하다.

방법

CDs 합성

CDs는 시트르산을 탄소원, 요소를 질소원, DMF를 공반응물로 하는 용매열법으로 제조하였다. 전형적 실험에서 시트르산(1 g)과 요소(2 g)를 10 mL DMF에 녹였다. 용액을 25 mL 폴리(테트라플루오로에틸렌) 라이닝 오토클레이브에 옮기고 160 °C에서 4시간 가열하였다. 반응 후 오토클레이브를 자연 냉각하여 실온으로 내렸다. 어두운 붉은 용액을 얻었다. 반응 용액 5 mL를 다량 에탄올 25 mL에 첨가하여 CDs를 침전시키고 7500 rpm으로 30분 원심분리하였다. 침전물을 투석하여 순수 CDs를 얻었다. 제조된 CDs를 수집하고 60 °C, <1 Pa 진공 건조 오븐에서 12시간 건조하였다. 이후 CDs를 탈염수에 재용해하여 0.75 mg mL⁻¹ CD 용액을 제조하여 추가 연구에 사용하였다. 이후 H₂O₂ 처리된 CDs도 동일한 방법으로 수집 및 건조하여 표면 형태와 구조적 특성 분석에 사용하였다.

측정

CDs 표면 형태는 고분해능 투과 전자 현미경(HRTEM, JEOL JSM-IT100)으로 분석하였다. CDs 구조적 특성은 X선 회절계(XRD, PA National X'Pert Pro)와 마이크로 라만 분광기(Renishaw RM 2000)로 수행하였다. CDs 흡수 스펙트럼은 Hitachi U-3900 UV-Vis-NIR 분광광도계로 측정하였다. CDs 형광 스펙트럼은 분광광도계(Hitachi F-7000)로 측정하였다. CDs 형광 양자 수율은 교정된 적분 구가 장착된 Horiba FL-322 분광기로 얻었다. CDs 형광 감쇠 곡선도 Horiba FL-322로 405 nm NanoLED를 사용하여 450 nm와 500 nm 방출을 모니터링하며 측정하였다. CDs 푸리에 변환 적외선 스펙트럼(FTIR)은 Bio-Rad Excalibur 분광기(Bruker Vector 22)로 기록하였다. X선 광전자 분광법(XPS)은 Mg 여기원을 사용한 ESCALAB MK II X선 광전자 분광계로 기록하였다.

CD 나노센서 구축

H₂O₂ 검출을 위해 PBS 완충액(pH = 7.4, 25 °C)에서 H₂O₂ 존재 하 CDs 형광 및 흡수 스펙트럼을 조사하였다. 전형적 실험에서 다양한 양의 H₂O₂를 증류수와 먼저 혼합한 후, 0.75 mg mL⁻¹ CD 용액 20 μL를 다양한 농도(0, 0.05, 0.1, 0.15, 0.25, 0.5, 1.0, 2.0 M)의 H₂O₂ 용액 4 mL에 주입하였다. CDs 첨가 후 사진, 형광, 흡수 스펙트럼을 촬영하였다.

CD 기반 나노센서 선택성도 평가하였다. CD 용액(20 μL, 3.75 μg mL⁻¹)을 다양한 양이온과 산화제(4 mL, 0.1 M)와 혼합하고 1분간 흔들었다. 마지막으로 CDs를 H₂O₂ 용액에 첨가한 후 UV-Vis 흡수 및 형광 스펙트럼을 기록하였다.

결과 및 논의

CDs 특성 분석

제조된 CDs 형태는 투과 전자 현미경(TEM)으로 측정하였다. 그림 1a에서 볼 수 있듯 CDs는 2.5~6.5 nm 균일한 크기 범위로 잘 분산되어 있으며 평균 직경 약 5 nm이다(추가 파일 1: Figure S1b). 또한 HRTEM 이미지(그림 1a 인셋)는 0.21 nm 회절 무늬를 보여주며 흑연 (100)면과 일치한다. CDs XRD 패턴(그림 1b)은 약 23.4°에서 넓은 피크를 보이며, 흑연 유사 탄소 구조를 가진 고도로 무질서한 탄소 원자에 해당한다. CDs 라만 스펙트럼(그림 1c)은 두 밴드를 나타낸다: D 밴드(약 1347 cm⁻¹, sp³ 혼성화 탄소의 불완전성과 무질서로 인한 진동), G 밴드(약 1577 cm⁻¹, 2차원 육방정계 구조에서 sp² 혼성화 탄소의 E_2g 진동 모드 관련). CDs FTIR 스펙트럼(그림 1d)은 3100~3600 cm⁻¹ O-H/N-H 광대역 진동 흡수 밴드, 약 1690~1610 cm⁻¹ C=O/C=C 신축 진동, 약 1350~1390 cm⁻¹ N-O 신축 진동을 보인다. 위 데이터는 CDs 표면에 일부 작용기가 존재할 수 있으며, 이 작용기들이 수용액에서 CDs의 높은 친수성과 안정성에 중요한 역할을 할 수 있음을 시사한다.

CD 기반 나노센서의 H₂O₂에 대한 형광 거동은 그림 1e에 나타난 CD 수용액에서 측정되었다. 단일 파장 365 nm 여기에서 CD 용액은 비대칭 방출 스펙트럼을 보이며, 450 nm와 500 nm 중심의 이중 방출 형광 밴드로 피팅될 수 있다(각각 청색과 녹색 형광 밴드에 해당). CD 용액에 H₂O₂ 혼합 시 청색 밴드 강도 감소가 녹색 밴드보다 더 크다. 따라서 H₂O₂ 첨가 후 CDs 여기-방출 매트릭스 결과에서 CDs 최강 방출이 450 nm에서 500 nm로 이동한다(추가 파일 1: Figure S2). 결과적으로 365 nm 자외선 조명 하 CD 용액 형광 색이 청색에서 녹색으로 변한다(그림 1e 인셋). 또한 H₂O₂ 첨가 후 CD 용액은 어두운 붉은색에서 녹색으로 발색 변화를 동시에 겪는다(그림 1f 인셋). 이 색 변화는 H₂O₂ 첨가로 인한 약 555 nm와 595 nm 흡수 밴드 강도 변화에 기인한다(그림 1f). 종합하면 이 결과들은 CDs가 H₂O₂ 검출용 이중 모드 나노센서로 사용될 수 있음을 확인한다.

감지 메커니즘

감지 메커니즘 조사 위해 H₂O₂ 첨가 후 CDs 형태와 형광 특성도 분석하였다. 추가 파일 1: Figures S1a, S1c에 나타나듯 H₂O₂ 첨가는 30~60 nm 크기 범위의 CDs 응집을 유도한다. H₂O₂ 유도 CDs 응집은 정규화된 흡수 스펙트럼(추가 파일 1: Figure S3)에서도 드러나며, 가시광 영역에서 CDs 흡수 밴드가 555 nm에서 595 nm로 적색 편이된다[15]. 이에 따라 CD 용액 색이 어두운 붉은색에서 녹색으로 변하며, CDs 분산 상태가 응집 상태로 변한다. H₂O₂ 첨가 전후 CDs XRD 스펙트럼(그림 1b 및 추가 파일 1: Figure S4)은 거의 변하지 않아 CDs 결정 구조에 변화가 없음을 나타낸다.

H₂O₂ 첨가에 따른 제조 CDs 형광 변화를 형광 스펙트럼으로 조사하였다. 여기-방출 매트릭스는 H₂O₂ 첨가로 CDs 방출 중심이 450 nm에서 500 nm로 변화함을 보여준다(추가 파일 1: Figure S2). 그림 2a에 나타난 450 nm와 500 nm 방출에 대한 CDs 형광 감쇠 곡선은 단일 지수 감쇠 함수로 잘 피팅되며, 평균 수명은 각각 7.96 ns와 7.12 ns이다(365 nm 여기). 반면 H₂O₂ 처리 후 CDs 형광 감쇠 수명은 4.53 ns와 4.83 ns로 변한다(그림 2b 및 표 1). 한편 H₂O₂ 첨가 시 CDs PL 양자 수율(η_int)이 5.5%에서 4.6%로 변한다. 형광 수명과 PL 양자 수율 변화를 고려할 때, CDs와 H₂O₂ 간 전하 이동(CT)이 발생하여 CDs PL 스펙트럼 변화의 방아쇠가 될 수 있음을 결론지을 수 있다.

CDs FTIR과 XPS 스펙트럼을 측정하여 H₂O₂에 의한 화학적 조성 및 환경 변화 통찰을 얻었다. H₂O₂ 첨가 전후 CDs FTIR 스펙트럼(추가 파일 1: Figure S7)은 약 1350~1390 cm⁻¹ N-O 신축 진동이 H₂O₂ 첨가와 함께 증가함을 보여주며, 이는 XPS 스펙트럼 결과로도 확인된다. 전체 조사 XPS 스펙트럼(추가 파일 1: Figure S8)에서 H₂O₂ 처리 전후 CDs O/N 비율은 각각 1.57과 3.85로 나타났다. 증가된 O/N 비율은 CDs 내 N 결합 상태가 H₂O₂ 첨가와 함께 변할 수 있음을 보여주며, 이는 고분해능 N1s XPS 스펙트럼(그림 2c, d)과 일치한다. N1s XPS 스펙트럼 결과에서 CDs 내 흑연 N 함량이 H₂O₂ 첨가와 함께 증가함이 관찰된다. 또한 H₂O₂ 첨가 후 N1s 스펙트럼에서 407.3 eV에서 N-O 상태 추가 피크가 나타나 H₂O₂ 유입이 CDs 표면 상태 변화를 초래함을 명확히 보여준다. 모든 조사 결과는 CDs 표면 N 프레임이 H₂O₂ 첨가에 의해 변할 수 있음을 나타낸다.

이전 보고에 따르면 CDs 방출 밴드는 N-도핑 라디칼과 요소기 같은 표면 상태와 관련된다[5,9,12,23-25]. 한편 이러한 표면 상태는 외부 물리적·화학적 자극에 민감하다. 위 광물리적 및 표면 환경 분석을 바탕으로 H₂O₂ 도입에 따른 형광 변화 메커니즘을 제안한다(그림 3). 제조된 CDs 가장자리 상태는 짝지어진 피롤릭 N 그룹으로 구성된다. 이 유형 N 상태는 대부분 높은 에너지 준위에 국소화될 수 있다. 따라서 여기 전자는 높은 준위 표면 N 상태로 비복사적으로 이완한 후 바닥 상태로 복사 전이하며 450 nm 부근 형광 방출 밴드를 동반한다. 대조적으로 H₂O₂와 CDs 간 동적 소멸로 인한 전하 이동(CT)이 발생하여 CDs 형광 강도가 약간 감소한다(이전 보고와 유사)[26-29]. 그렇지 않으면 H₂O₂에서 유래한 하이드록실 라디칼 영향으로 고에너지 형광 라디칼(관련 N 상태)이 낮은 에너지 N-O 상태로 변환될 수 있다. 따라서 여기 전자는 대부분 낮은 에너지 N-O 상태에서 바닥 상태로 복사 전이하며 500 nm 녹색 방출 밴드를 동반하고, 이는 450 nm 형광 정적 소멸도 초래한다. 따라서 CDs 주요 방출 밴드는 청색 방출에서 녹색 방출로 변화할 수 있다.

CD 나노센서 평가

위 CDs 형광 및 발색 거동 바탕으로 CDs를 이용한 H₂O₂ 검출 나노센서를 개발하였다. 제안된 감지 시스템은 수용액 내 적절한 농도 CDs(3.75 μg mL⁻¹, 추가 파일 1: Figure S9)로 구성되며, CDs가 이 시스템에서 발색 및 형광 보고자로 이중 기능 수행한다.

CD 용액 기반 제안된 나노센싱 시스템은 그림 4에 나타나 있다. H₂O₂에 의한 형광 및 발색 변화는 육안으로 뚜렷이 시각화 가능하다(그림 4c, f), 자외선 및 자연광 조명 하 청색에서 녹색, 어두운 붉은색에서 녹색으로 일련의 눈에 띄는 색 변화를 관찰할 수 있다. 또한 H₂O₂ 첨가는 형광 및 흡수 스펙트럼으로 정량적으로 표현 가능하다(그림 4a, d). 그림 4a에서 H₂O₂ 농도 0~2 M 증가에 따라 450 nm와 500 nm 중심 형광 밴드가 점차 감소한다. 그러나 H₂O₂ 농도 증가는 450 nm(I₄₅₀)와 500 nm(I₅₀₀) 형광 강도 감소를 다르게 유도하며, 이는 CD 용액 형광 색 변화와 잘 일치한다(그림 4c). 따라서 500 nm 형광 강도와 450 nm 형광 강도 비율(I₅₀₀/I₄₅₀)을 H₂O₂ 농도 모니터링에 선택하였다(그림 4a, b). 낮은 비율은 청색 방출과 관련되며, 높은 I₅₀₀/I₄₅₀ 비율에서 녹색 형광을 육안으로 관찰할 수 있다. 이 수단에 의한 선형 검출 범위는 0.05~0.5 M이며 선형 상관관계 R² = 0.987이다. 유사하게 CD 용액에서 555 nm와 595 nm 흡수 밴드 불균등 감소로 발색 변화가 발생한다. 그림 4d에서 가시광 영역 흡수 강도는 감소하지만, H₂O₂ 농도 증가로 595 nm 흡수 감소가 555 nm보다 느려진다. 따라서 595 nm 흡수(A₅₉₅)와 555 nm 흡수(A₅₅₅) 비율도 H₂O₂ 농도 측정에 사용될 수 있다. A₅₉₅/A₅₅₅ 비율은 0.05~2 M에서 지수적으로 증가하며 지수 상관관계 R² = 0.999, 발색 변화는 0.05~0.25 M H₂O₂ 농도 범위와 잘 상관되며 선형 검출 한계(LOD) 14 mM이다(추가 파일 1: Figure S11 및 Table S1). 이중 모드 나노센서는 GOD 반응을 통한 H₂O₂ 농도가 혈장에서 밀리몰라(~10 mM) 수준[20]이므로 임상 및 의약 요구사항을 만족하는 적절한 감도를 가진다. 또한 이중 모드 나노센서는 내장 보정 기준을 가지므로 강도 변동 등 외부 요인 제거가 가능하여 측정 정확도 향상에 기여한다.

나노센서의 H₂O₂ 선택성 평가를 위해 동일한 조건에서 Na⁺, K⁺, NH₄⁺, Ca²⁺, Zn²⁺, Fe²⁺ 등 일반적인 양이온으로 간섭 실험을 수행하였다. 그림 5a, b에서 CDs 형광 비율 I₅₀₀/I₄₅₀과 흡수 비율 A₅₉₅/A₅₅₅가 다양한 양이온 존재 하 조사되었다. Na⁺, K⁺, NH₄⁺, Ca²⁺, Zn²⁺, Fe²⁺ 존재 시 블랭크 시료 대비 형광 비율과 흡수 비율만 약간 변하여 이 양이온들이 H₂O₂ 검출에 거의 간섭하지 않음을 의미한다. 또한 HNO₃, KClO₃, FeCl₃, NaClO, K₂Cr₂O₇, KMnO₄ 등 다른 산화제 영향도 비교하였다(그림 5c, d 및 추가 파일 1: Figures S12, S13). K₂Cr₂O₇과 KMnO₄를 제외한 이들 산화제 첨가 시 형광 색이 청색에서 녹색으로 변하였다. 따라서 형광 변화를 통해 K₂Cr₂O₇과 KMnO₄ 간섭을 배제할 수 있다. 또한 흡수 비율 A₅₉₅/A₅₅₅ 결과를 통해 HNO₃, KClO₃, FeCl₃, NaClO 등 다른 산화제 영향도 쉽게 배제할 수 있다. 따라서 본 논문에서 입증된 이중 모드 나노센서는 두 독립적 검출법 시너지 효과로 인해 높은 선택성을 가질 것으로 기대된다[30-33]. 또한 H₂O₂ 첨가 시 형광 변화 반응 시간을 측정하였으며, H₂O₂ 주입 후 형광 감소 후 약 3.3초에 안정됨을 확인하였다(추가 파일 1: Figure S14).

A549 세포 생존율을 표준 CCK-8 분석법으로 측정하여 CDs 세포독성 평가하였다. 그림 6에서 볼 수 있듯 500 μg mL⁻¹ 높은 CDs 농도에서도 48시간 배양 후 A549 세포 생존율 약 80%를 얻었다. GraphPad Prism 5.0으로 계산한 50% 억제 농도(IC50)는 약 1106 μg mL⁻¹로, CDs가 높은 농도에서도 좋은 생체적합성과 매우 낮은 세포독성을 가짐을 추론할 수 있다. 또한 이전에 보고된 H₂O₂ 측정 나노센서 분석 성능과 비교하였다(추가 파일 1: Table S2). 생체적합성, 단순성, 가시화 측면에서 이 중 대부분과 비교 가능하거나 더 우수하다. CD 기반 이중 모드 나노센서가 H₂O₂ 검출에 좋은 선택성, 혈당과 같은 차수의 적절한 검출 한계(LOD = 14 mM), 높은 CDs 농도에서 매우 낮은 세포독성을 가지므로 혈당 검사 및 기타 임상 요구사항에 유망하다.

결론

결론적으로 H₂O₂ 도입 시 CD 용액 형광 및 발색 변화 기반 발색 및 형광 출력을 모두 가진 이중 모드 나노센서를 제안하였다. 나노센서는 단순하고 용이하여 H₂O₂ 육안 검출을 실현한다. 나노센서 메커니즘은 H₂O₂ 유래 하이드록실 라디칼 같은 외부 화학적 자극이 CD 표면 특성 변화와 응집을 일으켜 CD 방출과 흡수를 지배한다는 사실에 기인한다. 제안된 나노센서는 좋은 생체적합성, H₂O₂에 대한 높은 선택성, 0.05~0.5 M 선형 검출 범위, 약 14 mM 검출 한계를 보이며 이는 GOD 반응 생성 H₂O₂ 수준과 비교 가능하다. 본 논문 보고 전략이 혈당 검출용 신규 센서 개발에 유망한 접근법을 제공할 것으로 믿으며, 질병 진단과 환경 검사에 가치가 있을 것이다.