여기에서 우리는 먼저 경쟁 면역 분석을 사용하는 아트라진의 고감도 검출을 위해 ME 재료 및 금 나노입자(AuNP)를 기반으로 하는 무선 자기탄성(ME) 나노바이오센서를 보고합니다. 시간에 따라 변하는 자기장에 대한 응답으로 ME 재료는 질량 부하에 의해 영향을 받을 수 있는 공진 주파수에서 세로 방향으로 진동합니다. ME 재료에 코팅된 AuNPs 층은 생체 적합성, 안정성 및 감도에 기여합니다. 아트라진 항체는 AuNPs 코팅된 ME 물질 표면에 단백질 A를 통해 고정화되어 나노바이오센서의 성능을 향상시켰다. AFM(Atomic Force Microscope) 분석을 통해 아트라진 항체의 고정화가 성공적임을 입증했습니다. 또한, 감도를 향상시키기 위해 아트라진-알부민 접합체(Atr-BSA)가 아트라진 항체와의 결합을 위해 아트라진과 경쟁하도록 유도하여 신호 반응을 증폭시켰다. 공명 주파수 이동은 1 ng/mL ~ 100 μg/mL 범위의 아트라진 농도 로그에 반비례하고 선형적으로 비례하며 감도는 3.43Hz/μg mL
−1
입니다. 1ng/mL의 검출 한계는 미국 환경 보호국(EPA)에서 설정한 기준보다 훨씬 낮습니다. 실험 결과는 ME 나노바이오센서가 아트라진에 대해 강한 특이성과 안정성을 나타냄을 나타냈다. 이 연구는 아트라진의 신속하고 선택적이고 고감도 검출을 위한 새로운 편리한 방법을 제공하며, 이는 수질 모니터링 및 기타 환경 검출 분야에서의 응용에 의미가 있습니다.
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소개
공업과 농업의 급속한 발전과 더불어 점점 더 많은 환경오염물질이 생태환경으로 방출되어[1] 관련 연구에 대한 우려가 만연하였다[2, 3]. 최근 몇 년 동안 농업 분야에서 품질과 수확량을 향상시키기 위해 제초제를 점점 더 많이 사용하고 있지만 많은 제초제가 수년 동안 물과 토양에 활성 상태로 남아 심각한 환경 오염을 일으킬 수 있습니다[4]. 제초제 오염은 물 또는 농산물의 생태학적 오염으로 인해 상당한 주목을 받았습니다[5]. 제초제 중 아트라진(2-클로로-4-에틸아미노-6-이소프로필아미노-1,3,5-트리아진)은 전 세계적으로 광엽식물 및 풀 잡초 방제에 가장 광범위하게 사용됩니다[6].
아트라진은 일부 다년생 잡초에 일정한 억제 효과가 있지만 환경 오염 물질로서 매우 독성이 있으며[7] 인간과 다른 동물 종에 건강 위험을 일으킬 수 있습니다[8]. 장기간 고농도의 아트라진 섭취는 암, 선천적 기형, 심장 및 간 손상과 같은 동물이나 인간의 건강을 손상시킬 수 있습니다[9, 10]. 미국, 유럽 연합, 일본은 모두 아트라진을 내분비 교란 물질 목록에 포함시켰습니다[11]. 미국에서는 환경 보호국(EPA)이 식수에서 아트라진의 허용 한도를 3μg/L(평생 건강 권고 수준)로 허용합니다[12]. 따라서 저농도에서 아트라진을 정확하게 정량할 필요가 있습니다.
LC와 질량 분석법 결합(LC-MS)[13], 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)[14], 질량 분석법과 결합된 가스 크로마토그래피(GC–MS)를 포함하여 아트라진 검출을 위해 많은 기존의 분석 기술이 개발되었습니다. )[15], 그러나 이러한 방법들도 고비용, 큰 기구의 필요성, 열악한 선택성 및 시간 소모적인 것과 같은 몇 가지 한계가 있다[16].
무선 질량 감지 플랫폼으로서 ME 재료로 만든 자기탄성(ME) 센서는 저비용, 고감도, 더 작은 크기 및 사용 용이성이라는 중요한 이점으로 인해 다양한 응용 분야를 위해 널리 개발되었습니다[17, 18]. 현재 ME 센서는 일반적으로 Metglas 2826 MB(Fe40 Ni38 월4 B18 ) [19]. 외부에서 인가된 교번 및 정적 자기장 하에서 ME 재료는 공진 주파수에서 세로 방향으로 진동하여[20] 직접적인 물리적 연결 없이 픽업 코일에 의해 무선으로 감지될 수 있는 자속 밀도를 생성합니다[21]. 식에 따르면 (1) [22], 기본 공진 주파수 f0 재료 길이 L에 따라 다름 , 밀도 ρ , 탄성 계수 E , 및 푸아송 비 v .
ME 재료의 위의 고유한 특성에 기초하여 ME 재료의 공진 주파수는 추가 질량 부하가 증가함에 따라 감소합니다. 따라서 감지막을 이용한 기능화를 통해 ME 재료는 응력/압력[24], 온도/습도[25], 이산화탄소[26], 내독소 [27], Salmonella typhimurium/Bacillus anthracis 포자 [28] 및 대장균 O157:H7 [29]. 그러나 우리가 아는 한 ME 재료는 아트라진 검출에 적용되지 않았습니다.
본 연구에서는 우수한 특성과 장점을 활용하여 직접 경쟁 면역 측정법을 기반으로 ppb 수준의 아트라진 검출을 위해 ME 물질을 기판으로, 금 나노 입자(AuNPs)를 코팅층으로 사용하는 무선 ME 나노 바이오센서를 먼저 제안했습니다. 절차. 공유 무작위 항체 고정화와 비교하여 공유 지향 전략은 나노 바이오 센서의 감도를 향상시키는 데 더 유리합니다. 단백질 A는 항체의 Fc 면역글로불린 영역과 특이적으로 결합하는 흥미로운 대안이기 때문에 아트라진 항체의 지향성 고정에 사용되어 가장 높은 고정 밀도를 제공하여 더 나은 항원 결합 효율을 나타내고 나노바이오센서의 성능을 향상시킵니다. [31]. 아트라진에 대한 직접적인 경쟁 면역분석은 AuNPs 코팅된 ME 물질 표면에 공유적으로 변형된 단백질 A에 대한 아트라진 항체의 방향성 고정화에 의해 구성되었으며, 아트라진 항체와 아트라진-알부민 접합체(Atr-BSA) 및 아트라진의 경쟁 반응이 뒤따랐습니다. Atr-BSA는 신호 응답을 증폭하도록 유도되어 나노 바이오 센서의 감도를 크게 증가시킵니다. ME 나노바이오센서의 효율성을 평가하여 미량의 아트라진 검출을 위한 새로운 ME 나노바이오센서가 성공적으로 개발되었음을 입증했습니다.
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자료 및 방법
자료
아트라진 항체, 아트라진-알부민 접합체 항원(Atr-BSA), 아트라진 및 단백질 A는 EastCoast Bio(미국 메인주)에서 구입했습니다. Simazine, prometryn 및 디클로로디페닐트리클로로에탄(DDT)은 Chengdu Huaxia Chemical Reagent Co., Ltd.에서 입수했습니다. Cysteamine, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드 염산염(EDC), N -hydroxysulfosuccinimide(NHS), 소 혈청 알부민(BSA, 99%) 및 인산염 완충 식염수(PBS 완충액, pH =7.4)는 Sigma-Aldrich Corporation(Saint Louis, MO, USA)에서 구입했습니다.
ME 나노바이오센서 제작
ME 나노센서 플랫폼의 준비
Metglas 합금 2826(Fe40)으로 구성된 ME 소재 리본 Ni38 월4 B18 )는 Honeywell Corporation(미국 뉴저지주 모리스타운)에서 구입하여 컴퓨터 제어 레이저 절단기를 사용하여 5mm × 1mm × 0.028mm로 절단했습니다. 유기 필름과 파편을 제거하기 위해 ME 리본을 각각 10분 동안 아세톤과 에탄올로 초음파 세척하고 탈이온수로 헹군 다음 질소 기류에서 건조했습니다(그림 1a). AuNP와 리본 표면 사이의 접착력을 향상시키기 위해 ME 리본 표면의 양면에 ~ 100nm 두께의 크롬 나노 입자 층이 스퍼터링되었습니다. 그 후 크롬 코팅된 ME 리본 표면의 양면에 AuNP를 스퍼터링하여 생체 적합성을 개선하고 리본을 산화 및 부식으로부터 보호했습니다. 그림 1의 주사전자현미경(SEM) 이미지는 ME 리본에 코팅된 AuNPs가 구형 크기임을 보여주었다. AuNP와 -SH는 Au-S 결합을 쉽게 형성할 수 있습니다. AuNPs는 저렴한 가격, 비부식성, 생체 적합성 및 무독성이라는 매력적인 이점 외에도 [32] 화학적 또는 생체 인식 요소 수정을 위한 우수한 인터페이스를 제공할 수 있습니다[33, 34]. 그 후, ME 리본을 200°C의 진공 오븐에서 2시간 동안 어닐링하여 잔류 내부 응력을 완화하고 ME 리본에 AuNPs 층의 접착을 촉진했습니다. 그런 다음 ME 나노센서 플랫폼이 완성되어 아트라진 항체 고정화 준비가 되었습니다(그림 1b).