본 논문에서는 NHBP(amino-terminated hyperbranched polymer)에 의한 환원 GO를 통해 친수성 환원그래핀옥사이드(rGO)를 제조하는 간단한 방법을 제안하였으며, 제조된 NrGO는 우수한 분산성, 근적외선(NIR) 흡광도, 광열흡수율을 나타낼 수 있다. 변환 능력과 안정성. 그런 다음, 독소루비신 염산염(DOX)을 NrGO와 접합시켜 약물 로딩 시스템을 제조하고 pH/광열 이중 반응성 약물 전달 거동을 특성화하였다. 산성 환경이나 근적외선 레이저 조사에서 약물 방출 속도가 향상되어 종양 조직에서 항종양 약물의 방출을 제어하는 데 도움이 됩니다. 뿐만 아니라 in vitro 세포 실험에서 NrGO가 생체적합성이 우수하고 종양 억제 부분에서 DOX@NrGO가 처리하지 않은 대조군에 비해 효과적인 화학-광열 시너지 요법을 받아 억제율이 월등히 높았다. 방출된 DOX의 단일 화학요법보다 높습니다. 따라서 준비된 DOX@NrGO는 종양 치료에서 큰 잠재력을 얻었고 다른 생물 의학 응용 분야에서 탁월한 후보를 얻었습니다.
근적외선(NIR) 조사하의 광열 요법(PTT)은 부작용이 적고 침습성이 적기 때문에 종양 억제에 대한 관심이 높아지고 있습니다[1]. 근적외선(700~1100nm)은 건강한 조직이나 세포에 손상을 주지 않으면서 많은 흡수 없이 신체 조직 깊숙이 침투합니다[2, 3]. 따라서 NIR 레이저 조사에서 광열 작용제는 광열 변환 능력을 통해 주입 위치의 온도를 높일 수 있습니다. 또한, 적용된 광열제는 우수한 생체적합성, 광열변환 효능 및 안정성이 요구된다.
최근 몇 년간의 연구를 통해 PTT 제제로서 귀금속(gold nanorods[4], gold nanoplate[5]), 반도체 나노물질(CuS[6], MoS2 [7], FeS[8]), 유기물(폴리도파민[9], 폴리피롤 나노입자[10]), 탄소나노물질(탄소나노튜브[11], 탄소나노입자[12], 그래핀[13]). 유망한 탄소나노물질의 일종으로 그래핀은 특수한 2차원 나노시트로 인해 PTT법을 통한 종양 억제에 널리 사용되었으며, 이는 초고비표면적과 높은 약물 로딩 효율을 얻을 수 있는 잠재력이 크다[14, 15]. 그러나 우레아, 히드라진 수화물 등의 일반적인 방법으로 제조된 환원그래핀옥사이드(rGO), 열수공정은 항상 높은 소수성을 나타내어 신체 조직의 물 현상에 적용하는데 유리하지 않다[16].
이 경우, 우리는 친수성 rGO를 제조하기 위해 환원 능력이 있는 수용성 고분자를 사용하는 새로운 아이디어를 제안했습니다. 우리의 이전 연구에서 우리는 아미노 말단 하이퍼브랜치 폴리머(NHBP)를 합성하고 이를 사용하여 금속 산화물 나노 입자를 처리하고 HBP로 변형된 은 나노 입자와 같은 명백한 응집 없이 높은 친수성을 갖는 금속 나노구를 제조하고 안티에 응용을 시도했습니다. -박테리아 분야 [17, 18].
종양 억제 능력을 향상시키기 위해 일반적으로 항종양 약물을 광열 작용제에 로딩하여 약물 로딩 시스템을 제작한다[19]. 한편, 광열 작용제는 NIR 레이저 조사에서 PTT 효과를 나타낼 수 있습니다. 반면에 온도를 높이면 분자 이동 속도가 향상되어 약물 전달 속도가 빨라질 수 있습니다. 따라서 약물이 탑재된 광열치료제는 종양 억제에 화학-광열 시너지 치료 효과를 발휘할 수 있다[20, 21]. 여기에서는 아미노 말단 HBP를 사용하여 친수성 rGO(NrGO, 그림 1)를 제조하고 물리화학적 특성과 광열 능력을 특성화했습니다. 이후 NrGO에 항종양제(doxorubicin, DOX)를 첨가한 후, 다른 조건에서의 약물 전달 거동과 종양 억제 효능을 시험관 내에서 시험하였다.
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DOX@NrGO의 준비 및 화학 광열 요법의 개략도
그래핀 옥사이드(GO, 두께 0.8~1.2nm, 너비 0.5~5μm)는 XFNANO Co., Ltd.에서 공급했습니다. DOX는 HuaFeng United Technology Co., Ltd.에서 구입했습니다. Dulbecco의 변형 이글 배지(DMEM), 태아 소 혈청(FBS), 트립신, 페니실린(100U/ml) 및 스트렙토마이신(100μg/ml)은 모두 Thermo Fisher Scientific Inc.에서 구입했습니다. 메틸 티아졸릴 테트라졸륨(MTT), 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI) ) 및 propidium iodide(PI)는 Beyotime Biotechnology Co., Ltd.에서 구입했습니다. 다른 모든 시약은 추가 정제 없이 Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.에서 구입했습니다.
아미노 말단 하이퍼브랜치 폴리머는 우리의 이전 작업으로 합성되었습니다[16]. 테트라에틸렌펜타민(94ml, 0.5mol)을 질소 가스 보호 및 자기 교반 장치가 장착된 250ml 3구 둥근 바닥 유리 플라스크에 첨가했습니다. 반응 혼합물을 가열 자석 교반기로 교반하고 빙욕으로 냉각시키면서 메탄올(100ml) 중의 메틸 아크릴레이트(43ml, 0.5mol) 용액을 플라스크에 적가하였다. 그런 다음, 혼합물을 빙조에서 제거하고 실온에서 추가로 4시간 동안 교반되도록 두었다. 혼합물을 자동 회전 진공 증발을 위해 가지 모양의 플라스크에 옮기고 오일 배스를 사용하여 온도를 150°C까지 올린 다음 중량 평균 분자량이 약 7759인 황색의 점성 HBP 스케일이 얻어질 때까지 4시간 동안 방치했습니다. .
먼저 GO를 탈이온수에 분산시키고 적절한 HBP(GO와 NHBP의 중량비는 1:10, 1:20, 1:30)와 10분 동안 초음파 혼합하여 교반하고 90°C에서 1시간 동안 반응시켰다. 그런 다음, 결과물(NrGO-10, NrGO-20, NrGO-30으로 표시)을 원심분리하고 탈이온수로 3회 세척했습니다.
제조된 NrGO 현탁액을 DOX 용액에 중량비 1:1로 분산시키고 실온에서 24시간 동안 교반하였다. 그런 다음, 복합 용액을 원심분리하고 세척하여 DOX@NrGO를 수집했습니다.
표면 형태는 투과 전자 현미경(TEM, JEM-2100, JEOL, Japan)을 통해 특성화되었습니다. 푸리에 변환 적외선(FTIR, Nicolet iS10, Thermo Scientific, America) 분광법은 GO와 NrGO 사이의 화학 성분 변화를 설명하기 위해 수행되었습니다. 모든 스펙트럼은 400~4000cm −1 파장 범위에서 측정되었습니다. 해상도 4cm −1 . 표면전위와 입자크기는 Zeta potential-particle size analyzer(NanoBrook 90plus Zeta, Brookhaven, USA)를 통해 조사하였다. NIR 영역에서 NrGO의 흡수는 파장 범위가 400~900nm이고 분해능이 1cm −1 인 UV-vis(Evolution 300, Thermo Fisher, USA)로 연구되었습니다. .
광열 특성은 근적외선 레이저 장치(SFOLT Co., Ltd., Shanghai, China)와 열전대 온도계(DT-8891E, Shenzhen Everbest Machinery Industry Co., Ltd., 중국)를 사용하여 측정하였다. NrGO의 광열 특성은 808nm 레이저 조사에서 측정되었습니다. 레이저의 스폿 영역은 약 0.25cm 2 입니다. , 그리고 시험된 시료 현탁액의 온도 변화를 실시간으로 모니터링하였다. 여기에서 대조군으로 순수와 GO 현탁액을 적용하였다:(1) 0.2 ml 순수, GO 및 NrGO(NrGO-10, NrGO-20, NrGO-30) 현탁액을 0.25 ml Eppendorf 튜브에 넣은 후 NIR 레이저는 1W/cm 2 의 출력 밀도로 조사되었습니다. 5분 동안 (2) 농도가 다른 0.2 ml NrGO-30 현탁액(100, 200, 300 μg/ml)을 조사했습니다(1 W/cm 2 ) 5분 동안 (3) 0.2ml NrGO-30 현탁액(200μg/ml)에 다른 전력 밀도(1, 1.5 및 2W/cm 2 )를 조사했습니다. ) 5분 동안 (4) 0.2 ml NrGO-30(200 μg/ml) 현탁액을 조사했습니다(1 W/cm 2 ) 세 번의 켜기/끄기 주기
수집된 DOX@NrGO를 약물 전달 거동을 조사하기 위해 다른 처리에 대해 세 그룹으로 나누었습니다. (1) 대조군으로 표시된 pH =7.4인 PBS 용액에 분산; (2) pH =4.0인 PBS 용액에 분산(산 그룹으로 표시); (3) pH =.4인 PBS 용액에 분산시키고 NIR 그룹으로 표시된 NIR 레이저로 조사합니다. 위의 세 그룹(각 그룹은 세 개의 평행선으로 설정)을 컷오프 분자량 8000의 투석백(5ml)에 넣은 다음 해당 PBS 용액 20ml가 담긴 원심분리관에 넣었습니다. 그 후, 모든 튜브를 100rpm의 37°C 진탕기에 넣고, 약물 방출 분석을 위해 미리 정해진 시점에 각 튜브의 PBS 용액 10ml를 빼내고, 상응하는 새로운 PBS의 동일한 부피를 다시 첨가하였다. 또한, 근적외선군은 소정의 시점마다 5분 동안 근적외선을 조사한 것으로 처리하였다. 회수한 모든 용액을 UV-vis 분광광도계로 분석하여 약물 전달 프로필을 얻었습니다.
종양 세포(HeLa)에 대한 NrGO의 세포독성을 MTT 분석으로 조사하였다. 간단히 말해서, HeLa 세포는 96웰 플레이트에 5 × 10 3 의 밀도로 시드되었습니다. 웰당 세포를 배양하고 웰의 80%가 덮일 때까지 인큐베이션을 유지했습니다. 그런 다음 기존 배지를 NrGO(3.125, 6.25, 12.5, 25, 50μg/ml)가 있는 새 배지로 교체하고 NrGO가 없는 배지를 대조군으로 설정했습니다. 24시간 및 48시간 동안 배양한 후 MTT 분석을 사용하여 Eq. (1):
$$ \mathrm{Cell}\kern0.17em \mathrm{생존력}\left(\%\right)=\frac{{\mathrm{OD}}_{\mathrm{샘플}}}{{\mathrm{OD }}_{\mathrm{컨트롤}}}\times 100\% $$ (1)여기서 OD샘플 및 OD컨트롤 농도를 다르게 하고 대조군에서 NrGO를 처리한 세포의 측정된 흡광도를 나타냅니다.
그런 다음 NIR 조사에서 HeLa 세포를 DOX@NrGO(3.125, 6.25, 12.5, 25, 50μg/ml)로 처리하여 화학 광열 시너지 요법을 조사했습니다. DOX@NrGO로 4시간 동안 배양한 후 HeLa 세포에 NIR 레이저를 5분 동안 조사하고 20시간 동안 계속 배양했습니다. 이후 다시 MTT assay를 통해 세포생존율을 확인하였다. 세포 관찰을 위해 HeLa 세포를 각각 DAPI와 PI로 염색하고 CLSM과 형광 현미경으로 관찰했습니다.
NHBP와 반응한 후, GO 용액은 갈색에서 검은색으로 바뀌었고, 이는 GO가 성공적으로 rGO로 환원되고 물에 분산될 수 있음을 나타냅니다. 그림 2a, b에서 볼 수 있듯이 GO 및 NrGO-30의 TEM 이미지는 각각 나타 났지만 NrGO에서는 명백한 크리스피 또는 응집이 발견되지 않았으며 HBP 처리가 환원 반응에서 형태 변화를 일으키지 않음을 나타냅니다. 그림 3의 FT-IR 스펙트럼에 따르면 NrGO-30의 투과율 곡선은 NHBP의 투과율 곡선과 매우 유사했습니다. 특히 1725cm −1 에서 피크 환원 반응 후 GO의 가 소실되었으며, 이는 카르복실기로부터 C=O의 진동 흡수로 제안되었다[22]. 아미노 말단 NHBP의 분자 구조에 따르면 환원성 아미노기가 GO와 반응하여 1633cm -1 에서 새로운 FT-IR 피크가 생성되었습니다. , 이는 아미도 결합에서 C-N이어야 합니다. 제타 전위 결과는 그림 4에 나와 있으며, 분명히 모든 NrGO 샘플은 양전위이고 GO는 음전위였으며, 이는 GO의 카르복시기가 HBP의 아미노기와 반응했음을 나타냅니다. UV-vis-NIR 스펙트럼(그림 5)은 NrGO의 NIR 흡수를 설명하는 데 사용되었습니다. 다른 원료 비율을 가진 NrGO 샘플의 곡선은 NIR 영역에서 높은 흡수와 유사한 경향을 보여 PTT에서의 응용에 유리합니다. 반면, GO 및 HBP 용액은 NIR 영역에서 거의 흡수를 나타내지 않아 GO 및 NHBP로부터 광열 작용제의 성공적인 제조를 시사한다. 또한 NrGO의 nanosize도 측정되었으며(그림 6), NHBP 비율 상승에 따른 뚜렷한 변화를 보이지 않았습니다.
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GO의 TEM 이미지(a ) 및 NrGO(b ). 삽입된 사진은 농도가 1mg/ml인 시료 분산에 해당하는 광학 사진입니다.
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GO, NrGO 및 NHBP의 FT-IR 스펙트럼
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GO 및 NrGO 샘플의 제타 전위 테스트
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GO, HBP 및 NrGO 샘플의 UV-vis-NIR 스펙트럼
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NrGO 샘플의 나노크기 측정
얻어진 NrGO를 기반으로 808nm 레이저 조사에서 광열 특성을 조사했습니다. 그림 7과 같이 물, GO, NrGO의 가열곡선은 서로 다른 경향을 보였다. 순수한 물의 온도는 거의 성장을 보이지 않았으며 GO는 5°C 미만으로만 상승한 반면 NrGO는 40°C까지 개선되었으며 NrGO-20 및 NrGO-30은 45°C 이상까지 도달했습니다. NrGO는 NIR 레이저를 흡수하여 광열 거동을 유발할 수 있으며 HBP 비율을 높이면 광열 변환 효율이 향상되었습니다. 따라서 NrGO-30은 다음 조사를 완료하기 위해 선택되었습니다. Fig. 7b, c와 같이 NrGO 농도나 레이저 출력이 증가함에 따라 도달 온도가 올라가고 후자의 요인이 더 큰 영향을 미쳤다. 41–43°C는 정상 세포에 거의 부정적인 영향을 미치지 않으면서 종양 세포 억제에 적절한 것으로 입증되었습니다. 따라서 준비된 NrGO는 낮은 복용량과 레이저 분말에서 PTT의 요구 사항을 충족할 수 있습니다. 그런 다음 광열 안정성을 테스트하고 그림 7d에 표시했습니다. 3번의 on/off 주기 후에는 뚜렷한 차이가 없습니다. 따라서 NrGO는 NIR 영역에서 우수한 광열 특성을 얻었습니다. NIR 레이저 조사 전후의 NrGO의 흡수 안정성을 확인하기 위해 UV-vis 스펙트럼을 그림 8에 나타내었습니다. NIR 조사 후에도 곡선이 변하지 않았으며 NIR 조사가 NrGO의 흡수에 영향을 미치지 않음을 알 수 있습니다.
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광열 특성 측정. 아 808nm 레이저 조사(1W/cm 2 )에서 물, GO 및 NrGO 샘플(200μg/ml)의 가열 곡선 ). ㄴ 808nm 레이저 조사(1W/cm 2 )에서 농도가 다른 NrGO-30의 가열 곡선 ). ㄷ 다양한 출력 밀도에서 808nm 레이저 조사에서 NrGO-30(200μg/ml)의 가열 곡선. d 3회(1W/cm 2 주기 조사에 대한 808nm 레이저 조사에서 NrGO-30(200μg/ml)의 온도 변화 곡선 )
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NIR 레이저 조사 전후의 NrGO의 UV-vis-NIR 스펙트럼
NrGO에 DOX를 로딩한 후 약물 전달 실험을 진행하였다. 종양 조직의 약산성 환경으로 인해 NIR 조사와 pH의 영향이 모두 연구되었습니다. 여기에서, pH 7.4 또는 4.0의 PBS를 각각 정상 또는 종양 조직을 모방하기 위해 적용하였다. 그림 9에서 볼 수 있듯이 낮은 pH와 근적외선 조사에서 약물 전달 속도가 분명히 가속화되었습니다. 한편, NrGO의 아미노기는 낮은 pH 값에서 이온화되고, DOX와 이온화된 아미노기 사이의 반발력은 낮은 pH 조건에서 개선되어 약물 전달을 가속화하고 pH 감도를 나타냈다. 게다가, 낮은 pH 조건에서 DOX의 우수한 용해도는 약물 전달 속도를 증가시킬 수 있습니다[23]. 한편, 근적외선 레이저 조사에서는 국부적인 온도가 상승하여 분자 운동 속도가 빨라졌다. 따라서 DOX@NrGO는 약물 전달 행동에서 pH/광열에 민감하여 종양 조직에서 약물 전달 속도를 제어하는 데 유리하고 화학-광열 시너지 요법을 발휘했습니다.
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다양한 조건에서 DOX@NrGO의 시험관 내 약물 방출 프로필
생체 적합성은 생체 재료의 기본 필수 속성입니다. 따라서, 상이한 농도를 갖는 NrGO의 세포독성은 MTT 분석을 통한 시험관내 실험 동안 초기에 시험되었다. 도 10a에서 보는 바와 같이, 24시간의 MTT 분석 결과는 NrGO 농도가 50μg/ml에 도달했을 때 세포 생존율이 80% 이상으로 유지되었음을 나타내었으며, 이는 NrGO가 생체 적합성이 우수하고 종양에서 유망한 생체 적합성 PTT 제제로 간주됨을 증명할 수 있습니다. 억제.
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아 24시간 및 48시간 동안 다른 농도에서 NrGO의 세포독성 시험. ㄴ 다른 치료에 의한 DOX@NrGO의 종양 세포 억제 조사
NrGO의 생체 적합성을 기반으로 DOX@NrGO의 종양 억제 효능을 시험관 내에서 연구했습니다. 광열 거동의 영향을 조사하기 위해 해당 종양 세포에 NIR 레이저를 0.5W/cm 2 의 출력 밀도로 5분 동안 조사했습니다. . 도 10b에 나타난 바와 같이 종양 세포를 DOX@NrGO로 24시간 처리한 경우 농도가 증가함에 따라 생존력이 분명히 감소하여 방출된 DOX가 종양 세포 증식을 억제할 수 있음을 보여주었습니다. 또한, NIR 조사도 적용했을 때 생존율이 훨씬 더 빠르게 감소하여 온도가 상승하고 DOX 방출 속도가 화학 광열 시너지 요법을 할 수 있음을 나타냅니다.
DAPI로 염색한 후, 세포는 공초점 레이저 스캐닝 현미경(CLSM)에서 관찰되었고, 핵은 파란색으로 염색되었으며, 다른 처리의 이미지는 각각 그림 11a-c에 표시되었습니다. NrGO로 배양된 세포는 배양 플레이트에 다량으로 과도하게 분포된(도 11a) 반면, DOX@NrGO 처리 시 그 수가 감소하여(도 11b), 방출된 DOX가 종양 증식을 억제할 수 있음을 나타내었다. 의미심장하게도 NIR 레이저 노출 영역의 종양 세포가 효율적으로 파괴되고 떨어져서 이미지에 어두운 영역이 생성되었습니다(그림 11c).
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NrGO 처리 후 DAPI(파란색) 염색된 세포 핵의 CLSM 이미지(a ), DOX@NrGO(b ) 및 DOX@NrGO+NIR(c ). (× 400)
또한 PI를 적용하여 죽은 세포를 적색 형광으로 염색하는 저분자 염료의 일종인 화학 광열 시너지 처리 후 종양 세포 억제를 관찰했습니다. Fig. 12에서 보는 바와 같이, Fig. 12a에서 처리하지 않은 경우에는 거의 죽은 세포(이미지의 붉은 점)가 관찰되지 않았으나, 화학 광열 처리 후에는 노출 영역 밖의 종양 세포가 DOX 및 DOX의 손상을 입었다. 세포 생존력을 더욱 감소시키기 위한 고온(그림 12b). 위의 결과에 따르면 DOX@NrGO가 원하는 종양 치료제 후보로 판명되었습니다.
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다른 치료법으로 종양 세포의 PI 염색. 아 제어. ㄴ DOX@NrGO+NIR
요약하면, GO와 아미노 말단 HBP의 간단한 반응을 통해 새로운 친수성 NrGO가 설계되고 성공적으로 제조되었습니다. 다양한 특성화는 NrGO가 안정적이고 뛰어난 광열 특성을 얻은 것으로 나타났습니다. DOX 로딩 후, 약물 전달은 pH 및 광열 이중 반응 거동을 나타내었으며, 이는 낮은 pH 값 및 NIR 조사에서 가속화될 수 있습니다. 또한, 시험관내 세포독성 실험 결과, 제조된 그대로의 NrGO가 생체적합성이 양호한 것으로 나타났다. 그 이점으로 인해 화학 광열 시너지 요법을 기반으로 종양 세포를 효과적으로 억제할 수 있으며 항종양 약물이 탑재된 NrGO는 종양 요법에서 유망한 응용을 얻었습니다.
공초점 레이저 스캐닝 현미경
4',6-디아미디노-2-페닐인돌
독소루비신
DOX 로드 NrGO
푸리에 변환 적외선
산화 그래핀
하이퍼브랜치 폴리머
메틸 티아졸릴 테트라졸륨
아미노 말단 HBP
근적외선
아미노 말단 하이퍼브랜치 폴리머 환원 그래핀 옥사이드
요오드화 프로피듐
광열 요법
환원그래핀옥사이드
주사전자현미경
투과 전자 현미경
나노물질
초록 빠르고 통제할 수 없는 세포 성장이 합병증과 조직 기능 장애를 일으키는 질병인 암의 유병률 증가는 과학자와 의사의 심각하고 긴장된 우려 중 하나입니다. 오늘날 암 진단과 특히 그 효과적인 치료는 지난 세기 건강과 의학의 가장 큰 과제 중 하나로 여겨져 왔습니다. 약물 발견 및 전달의 상당한 발전에도 불구하고 일반적으로 건강한 조직 및 기관에 손상을 일으키는 많은 부작용과 부적절한 특이성 및 민감도가 약물 사용에 큰 장벽이 되어 왔습니다. 이들 치료제의 투여 기간과 양에 대한 제한도 도전적이다. 반면에, 화학 요법 및 방사선
특히 제품을 구성할 때 중요한 생산 부분이 여러 개 있지만, 제품이 완전히 조립되어 소비자에게 배송될 준비가 되는 라인의 마지막에 오는 중요한 프로세스도 있습니다. 제조업체가 픽 앤 플레이스 로봇 시스템으로 이러한 프로세스를 자동화하기로 선택하면 유리한 결정을 내렸음을 확신할 수 있습니다. 로봇 픽 앤 패커의 가장 큰 장점 중 하나는? 속도. 픽 앤 팩 로봇 시스템은 물체 또는 많은 물체를 집어 인간 작업자보다 훨씬 빠른 속도로 상자, 카톤, 트레이 또는 기타 유형의 컨테이너에 포장하여 생산 속도를 여러 번 향상시킵니다. 위에.
