환경 변화에 따른 세균 미세 구획 쉘 단백질의 자가 조립 안정성 및 가변성

방법

샘플 준비

Haliangium ocraceum에서 정제된 BMC-H 단백질(Hoch_5815) Kerfeld 박사(로렌스 버클리 국립 연구소)가 친절하게 제공했습니다. 완충액 교환의 경우 샘플을 ~ 80 mg mL ⁻¹ 로 보관하십시오. 트리스 완충액(50 mM Tris-HCl, pH 7.8, 100 mM KCl, 10 mM MgCl₂ ) 0.5 mg mL ⁻¹ 로 희석했습니다. AFM 이미징 전에 원하는 버퍼를 사용합니다(추가 파일 1:그림 S1). 대조 완충액은 50mM Tris-HCl(pH 7.8) 및 10 mM MgCl₂입니다. .

원자력 현미경

운모 및 AFM 이미징에서 샘플 흡수를 위해 원하는 버퍼를 사용했습니다. 운모에서 5분 흡수 후 Hoch_5815를 원하는 완충액으로 헹구어 고정된 단백질을 제거한 다음 AFM을 사용하여 이미지화했습니다(추가 파일 1:그림 S1). HS-AFM 이미지는 ULTRA Speed ​​2.8 μm 스캐너와 Ultra-Short Cantilever USC-0.3 MHz 프로브(NanoWorld)가 장착된 JPK NanoWizard ULTRA 속도 원자현미경을 사용하여 AC 모드의 솔루션에서 30 또는 40 Hz에서 캡처되었습니다. AFM 이미징 동안 ~ 100 피코뉴턴의 최소 하중을 적용하여 단백질 어셈블리의 교란을 줄였습니다[12, 32,33,34,35,36].

이미지 처리 및 분석

이미지 분석은 처음에 JPK SPM 데이터 처리(JPK)를 사용하여 수행되었습니다. HS-AFM 이미지 분석은 앞서 설명한 대로 Image SXM(http://www.ImageSXM.org.uk)에서 사용자 정의 매크로를 사용하여 수행되었습니다[12]. Hoch_5815 패치의 크기를 분석하기 위해 30 Hz 스캔 속도에서 캡처된 512 × 512 픽셀의 이미지를 평면화하여 XY 기울기와 Z 임계값을 제거한 다음 단백질이 아닌 단백질을 표시하기 위해 이진 변환을 수행했습니다. 입자 분석을 사용하여 이러한 이진 이미지에서 단백질의 표면적을 계산했습니다. 개별 패치와 인접 패치를 식별하기 위해 패치는> 3픽셀(~ 2 nm)로 구분된 개체로 정의되었습니다. 초기 테스트에서는 더 많은 수의 픽셀이 설정되면 인접한 패치가 단일 연속 패치로 계산될 수 있는 반면 더 작은 픽셀 수를 사용하면 패치의 개별 헥사머 사이의 간격이 패치 간의 경계로 잘못 계산될 수 있음을 보여주었습니다. 단백질 역학을 분석하기 위해 40Hz 스캐닝 속도로 캡처된 256 × 256 픽셀의 이미지 시리즈를 분석하여 프레임당 약 6.4 s의 시간 해상도를 제공했습니다. 차이 AFM 이미지를 표시하기 위해 시리즈의 이전 이미지에서 이진 이미지를 뺍니다. 차이 이미지의 입자 분석을 사용하여 조립 및 분해된 단백질의 면적을 계산했습니다. 동적 비율을 계산하는 데 사용되는 방정식은 다음과 같습니다.

여기서 N 는 임계값 차이 이미지의 흰색 픽셀과 검은색 픽셀의 합을 해당 축척의 단일 헥사머에 해당하는 픽셀 수로 나눈 값을 나타냅니다(추가 파일 1:그림 S3, 그림 S5). 데이터는 평균 ± 표준편차(SD)로 표시됩니다. 지정된 대로 다변수 ANOVA 또는 양방향 ANOVA를 사용하여 통계 분석을 수행했습니다.

결과

우리는 점액박테리움 Haliangium ocraceum의 BMC-H 단백질(Hoch_5815)을 사용했습니다. , Escherichia coli에서 표현된 6중 대칭을 갖는 6량체로 특징지어집니다[12]. Hoch_5815 헥사머는 20면체 BMC 아키텍처의 기본 구조 구성 요소를 나타내는 두 번째 시간 척도에서 단일 레이어 시트를 형성하기 위해 자가 조립될 수 있습니다(그림 1a). HS-AFM 이미징을 사용하면 시트 조각의 동적 조립 및 조직적 유연성을 시각화할 수 있고(그림 1b) 개발된 이미징 분석을 사용하여 패치 크기와 BMC-H 단백질의 동적 속도를 정량적으로 추정할 수 있습니다("방법" 섹션 참조).

pH 변화에 대한 반응

우리는 Hoch_5815의 자가 조립 능력의 전반적인 지표로 패치 크기의 변화를 측정했습니다. 패치 크기는 pH가 3에서 10으로 증가함에 따라 증가합니다(그림 2a, 추가 파일 1:그림 S2, 표 S1). 이는 높은 pH가 낮은 pH 조건보다 Hoch_5815 단백질의 자가 조립에 더 유리함을 시사합니다. 이것은 pH 6에서 불용성인 것으로 밝혀진 RmmH 단백질의 조립 거동과 다소 구별되며, pH 8에서는 정렬된 나노튜브 배열을 형성하고 pH 10에서는 분해되는 경향이 있습니다[13]. 또한 HOCH_5815 자체 조립의 높은 수준의 구조적 변동성을 관찰했습니다(그림 2a, 추가 파일 1:그림 S2에서 큰 SD로 표시됨).

Hoch_5815의 자가 조립에 대한 환경 pH의 영향. 아 AFM에 의해 결정된 Hoch_5815의 개별 패치의 평균 표면적(n =50) (추가 파일 1:그림 S2). ㄴ HS-AFM(n =50). *p <0.05, ns 중요하지 않음(다변량 ANOVA)

쉘 시트에서 Hoch_5815 단백질의 자가 조립에 대한 AFM 영상은 쉘 시트의 형성이 6량체의 조립 및 분해의 조합에 기인한다는 것을 밝혀냈습니다[12]. Hoch_5815 단백질-단백질 상호작용의 안정성을 조사하기 위해 다양한 pH(추가 파일 1:표 S2)에서 Hoch_5815 자가 조립 역학 및 동적 이벤트의 속도를 추가로 조사했습니다. 자가 조립 역학의 비율은 pH 7에서 가장 높고 산성 및 알칼리성 조건 모두에서 감소합니다(그림 2b, 추가 파일 1:그림 S3). 특히 pH 7에서 pH 6으로 산성 조건에서 급격히 감소하고 그림 2b와 같이 pH 4와 pH 3 사이에서 상대적으로 일정하게 나타납니다.

pH는 hexamer-hexamer 계면에 위치한 아미노산 잔기의 정전기적 특성에 큰 영향을 미칠 가능성이 있습니다. 산성 조건에서 관찰된 감소된 역학과 더 작은 크기의 쉘 패치는 Hoch_5815가 감소된 자가 조립 능력을 갖고 있음을 보여줍니다. 알칼리성 조건에서 관찰된 감소된 역학 및 더 큰 크기의 쉘 패치는 안정적인 6량체-헥사머 상호 작용을 시사하는 반면 Hoch_5815 6량체의 증가된 역학은 중성 pH 조건에서 유연한 6량체-헥사머 상호 작용을 의미합니다.

염류 농도 변화에 대한 대응

또한 버퍼의 염 농도가 Hoch_5815 조립에 영향을 미치는지 확인했습니다. MgCl₂의 낮은 농도(100–200 mM)에서 , CaCl₂ 및 KCl, Hoch_5815 단백질은 더 높은 농도(300–500 mM)에서 조립된 것보다 상대적으로 작은 패치를 형성합니다(그림 3a, 추가 파일 1:그림 S4). 500 mM에서 이중 또는 다중 레이어 Hoch_5815 시트를 관찰했습니다(추가 파일 1:그림 S4). 이러한 관찰은 더 높은 이온 강도가 탄소 동화를 위한 카르복시솜의 껍질 단백질인 CcmK에 의해 보다 광범위하고 잘 정렬된 2D 결정의 형성을 촉진할 수 있다는 이전의 발견과 일치합니다[37]. 그러나 RmmH에 의해 형성된 고도로 정렬된 나노튜브는 NaCl 농도가 50에서 500 mM으로 증가할 때 분해되었으며[13], 이는 쉘 6량체에 의한 평평한 시트 및 관 모양의 형성을 매개하는 잠재적으로 다른 메커니즘을 나타냅니다.

Hoch_5815의 자가 조립에 대한 염 농도의 영향. 아 100–500 mM CaCl₂ 범위에서 AFM으로 측정한 평균 패치 면적 , MgCl₂ , 및 KCl(n =50). 염 농도의 증가는 패치 크기를 증가시켰습니다. 패치 면적의 상당한 변화가 200과 300 mM 사이에서 관찰되었습니다(***p <0.001, *p <0.05, ns 유의하지 않음, 양방향 ANOVA). ㄴ 100–500 mM CaCl₂ 범위에서 고속 AFM 이미지 시리즈에서 결정된 동적 이벤트의 평균 비율 , MgCl₂ , 및 KCl(n =50). 염 농도의 100 mM 변화는 동적 이벤트의 비율에 상당한 변화를 가져왔습니다(***p <0.001, *p <0.05, ns 유의하지 않음, 양방향 ANOVA)

또한 MgCl₂의 변화로 인한 Hoch_5815 자가조립의 변형 및 KCl 농도는 비교적 유사합니다. 대조적으로, 패치 크기의 변화는 CaCl₂일 때 가장 두드러집니다(최대 3000배 증가). 농도가 200에서 300 mM으로 증가했으며(그림 3a), Hoch_5815 자가 조립의 CaCl₂에 대한 더 높은 감도를 나타냅니다. MgCl₂보다 또는 KCl.

Hoch_5815 자체 조립의 동적 속도는 완충염 농도의 변화에도 영향을 받습니다. MgCl₂의 증가 , CaCl₂ , 또는 KCl 농도는 Hoch_5815 동적 속도의 감소를 초래할 수 있습니다(그림 3b, 추가 파일 1:그림 S5). 더 높은 염 농도에서 관찰된 패치 크기의 증가를 감안할 때(그림 3a), Hoch_5815 헥사머 사이의 측면 상호작용이 높은 염 농도에서 더 안정한 것으로 보입니다. CaCl₂의 변화 농도는 더 확연한 반응을 보였고 200과 300 mM 사이의 동적 이벤트 비율에 상당한 변화가 있었습니다(그림 3b). 반면 MgCl₂의 변화에 ​​대한 반응 및 KCl은 패치 크기의 변화와 일치하여 비교적 유사합니다(그림 3a). 흥미롭게도, 조립 이벤트 대 분해 이벤트의 가장 높은 비율은 MgCl₂의 400 mM에서 관찰되었습니다. , CaCl₂ 또는 KCl(추가 파일 1:표 S2). 이로 인해 400 mM 염에서 크고 안정적인 단일층 Hoch_5815 어셈블리가 형성되었습니다(추가 파일 1:그림 S4). 500 mM에서 관찰된 이중층 어셈블리도 안정적이며 헥사머 이동 속도가 낮습니다.

BMC-H 단백질 조립의 유연성

스캐닝 힘을 100pN으로 줄임으로써 BMC 단백질 어셈블리에 대한 AFM 팁 스캐닝의 영향을 최소화하고 개별 헥사머의 분자 분해능 AFM 이미지를 얻었습니다(그림 4). 조립 및 분해 이벤트 모두 동일한 보기에서 볼 수 있으며 팁 스캐닝 아티팩트 대신 BMC 쉘 조립의 동적 특성을 확인할 수 있습니다[12]. HS-AFM 영상은 또한 Hoch_5815 단백질 응집체의 가변성을 보여주었습니다. 10 mM MgCl₂만 존재하는 pH 7.5에서 샘플을 이미징할 때 놀랍게도, 우리는 두 번째 시간 척도에서 Hoch_5815 헥사머의 분해와 함께 섬유 유사 구조의 형성을 때때로 관찰했습니다(그림 4a). 이러한 섬유와 같은 구조는 쉘 헥사머에 의해 조립된 나노튜브 번들과 유사하게 병렬로 조밀하게 패킹될 수 있습니다[13,14,15,16]. 그러나 두 섬유 사이의 공간은 3.72 ± 0.31 nm(n =30)이고 평균 높이는 2.46 ± 0.22 nm(n)입니다. =30), Hoch_5815 6량체(3.45 ± 0.16 nm, n)에 의해 형성된 쉘 시트보다 작음 =25) (그림 4b–f). 이러한 섬유 구조는 이미징 중에 상당히 유연하고 동적이며 다양한 크기의 직선 또는 코일 구조를 표시할 수 있습니다. Hoch_5815 헥사머의 분해가 수반되는 섬유 구조의 외관과 단층 헥사머 시트와 비교하여 감소된 높이를 감안할 때 이러한 섬유 유사 구조는 헥사머에서 분해된 개별 Hoch_5815 펩티드에 의해 형성되는 것으로 추측됩니다(그림 4g). . 특정 완충 조건(예:낮은 이온 강도)에서 기질 흡수는 기질 표면에 Hoch_5815 펩타이드의 알파 나선 면이 부착되고 인접한 펩타이드와 펩타이드의 선형 결합으로 이어질 가능성이 있습니다. 6량체 내 상호 작용이 강할 가능성이 높다[5]. 껍질 단백질 응집의 변동성을 뒷받침하는 자세한 메커니즘은 더 자세히 설명해야 합니다.

HS-AFM에서 쉘 시트 어셈블리와 함께 섬유 구조의 형성 및 역학. 아 AFM 이미지 시리즈에서 볼 수 있듯이 Hoch_5815 헥사머로 구성된 쉘 시트의 분해 중 섬유 유사 구조의 모양. ㄴ 섬유 구조의 AFM 지형도. ㄷ 횡단면 분석(패널 b의 파선 ) 3.72 ± 0.31 nm(n =30) 인접한 섬유 구조 사이, 평균 높이는 2.46 ± 0.22 nm(n =30). d Hoch_5815 헥사머로 구성된 쉘 패치의 AFM 지형도. 이 횡단면 분석(패널 d의 파선 ) Hoch_5815 헥사머의 평균 높이는 3.45 ± 0.16 nm(n =25). 에 섬유와 같은 구조는 Hoch_5815 헥사머(*p <0.05, 양방향 ANOVA). 지 일련의 Hoch_5815 단량체를 나타내는 섬유와 같은 구조의 제안된 구성 및 형성