기존 항암화학요법은 부작용이 심하고 종양세포의 다제내성이 빠르게 진화하기 때문에 한계가 있다. 이 문제를 해결하기 위해 C60 백혈병 세포에 최적화된 약물 전달을 위한 항암제 운반체로서의 풀러렌 기반 나노 크기 시스템.
여기에서는 C60의 물리화학적 특성과 항암 활성을 연구했습니다. 일반적으로 사용되는 항암제 독소루비신과 풀러렌 비공유 복합체. C60 -1:1 및 2:1 비율의 독소루비신 복합체는 UV/Vis 분광법, 동적 광산란 및 고성능 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분석법(HPLC-MS/MS)으로 특성화되었습니다. 얻은 분석 데이터는 140nm 복합체가 안정적이고 생물학적 응용에 사용할 수 있음을 나타냅니다. 백혈병 세포주(CCRF-CEM, Jurkat, THP1 및 Molt-16)에서, 나노복합체는 다양한 나노몰 농도에서 유리 약물과 비교하여 ≤ 3.5 더 높은 세포독성 잠재력을 나타냈다. 또한, 세포내 약물의 수준은 C60을 입증했습니다. 풀러렌 상당한 나노캐리어 기능.
이 연구의 결과는 C60 풀러렌 기반 전달 나노복합체는 백혈병 세포에 대한 독소루비신 효율의 최적화를 위한 잠재적 가치가 있습니다.
암 연구의 주요 노력은 암세포를 직접 제거하는 보다 강력하고 선택적인 방법을 찾는 데 있습니다. 이 작업은 나노생명공학을 통해 해결할 수 있습니다. 이 분야의 최근 진전은 탄소 나노구조에 대한 관심을 불러일으켰습니다. - C60 풀러렌[1]은 독특한 물리화학적 특성[2, 3], 생물학적 활성[4,5,6,7,8,9,10] 및 항산화 작용[11,12,13,14]을 나타낼 뿐만 아니라 암세포로 약물 전달을 위한 나노운반체 역할을 할 수 있는 상당한 잠재력[15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25](여기에서는 일관되게 "C60 ").
항암 안트라사이클린 화학요법 약물인 독소루비신(여기서는 일관되게 "Dox"로 약칭)은 생명을 위협하는 심장독성 및 기타 심각한 부작용으로 인해 보다 표적화된 나노전달의 첫 번째 후보 중 하나입니다[25, 26]. 암 세포에 대한 Dox 독성의 주요 메커니즘은 핵 DNA에 삽입된 후 토포이소머라제 활성, DNA 복제 및 복구를 억제하는 것입니다[26,27,28]. 그러나 심근 세포에 대한 Dox의 부작용은 주로 철 관련 활성 산소 종 형성과 같은 또 다른 메커니즘에 의해 결정되는 것으로 간주됩니다 [27, 28]. C60 조합 항산화 잠재력[2, 11, 13]과 약물 전달 능력[24, 25]은 나노구조를 항암 치료에 매우 매력적으로 만듭니다.
Dox와 나노구조의 복합화는 약물의 크기를 증가시켜 유기체에서의 체류를 개선하고 치료 활성을 연장시킵니다[29, 30]. 성공적인 항암제 전달을 위한 적용 가능한 나노시스템을 개발하기 위해 이전 연구는 안정성, 생체 적합성, 생체 분포 및 기능에 관한 측면에 중점을 두었습니다[29,30,31,32,33].
Dox와 C60의 결합 암세포의 수동적 표적화는 공유 결합[15,16,17, 23] 또는 비공유 상호작용[18,19,20,21,22]에 의해 달성될 수 있습니다. C60 복합체 2개의 아미드 결합 Dox 분자로 인간 유방암 MCF-7 세포에 대해 자유 약물과 동일한 세포독성을 나타냈다[16]. Dox가 C60에 바인딩되었을 때 carbamate linker를 통해 항종양 효능에는 변화가 없었지만 쥐 종양 모델에서는 전신 독성이 없었다[17]. 하나 또는 두 개의 Dox 분자가 페길화된 C60에 고정된 경우 우레탄 형태의 결합을 통해 입자가 결합된 복합체는 MCF-7 세포에 대한 지연된 항증식 효과까지 나타내었다[23].
C60의 다방향족 표면과 방향족 Dox 분자의 비공유 착물화용 , π-π 스태킹 효과가 원인입니다. 선구적인 시도에서 Evstigneev et al. [19] C60의 간단하고 빠른 방법을 보여주었다. 물 [19] 및 생리학적 용액 [20]에서 Dox와의 비공유 착화. 제안된 나노시스템은 시험관 내에서 다양한 인간 종양 세포주 및 생체 내 마우스 루이스 폐 암종에 대해 자유 약물에 비해 더 높은 독성을 갖는 것으로 나타났습니다[21, 22]. 또 다른 접근법에서는 항균 효과와 생체 내 영상화에 대한 적용 가능성이 나타났습니다[18].
제시된 연구의 목적은 C60의 물리화학적 특성을 평가하는 것입니다. -Dox 복합체는 구성 요소의 비공유 상호 작용, 세포 내 축적 및 인간 백혈병 세포주에 대한 세포 독성 가능성 후에 형성됩니다.
RPMI 1640 액체 배지, 인산완충식염수(PBS), 소태아혈청(FBS), 페니실린/스트렙토마이신 및 L-글루타민은 Biochrom(독일 베를린)에서 구입했습니다. 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐 테트라졸륨 브로마이드(MTT) 및 Hoechst 33342는 Sigma-Aldrich Co.(St-Louis, USA)에서 입수했습니다. Carl Roth GmbH + Co. KG(Karlsruhe, Germany)의 디메틸설폭사이드(DMSO), 염화나트륨, 아세토니트릴, 포름산 및 트리판 블루를 사용했습니다.
깨끗한 C60 콜로이드 수용액은 C60에 의해 제조되었습니다. Ritter et al.에서 설명한 대로 연속 초음파 초음파 처리를 사용하여 톨루엔에서 물로 옮깁니다. [34] 획득한 C60 물 콜로이드 용액은 최종 농도가 150 μg/ml이고 순도, 안정성 및 균질성이 99%이고 평균 나노입자 크기가 100 nm입니다[34, 35].
Dox("Doxorubicin-TEVA", Pharmachemie B.V., Utrecht, Netherlands)를 150 μg/ml의 초기 농도로 생리학적 용액에 용해시켰다.
A C60 - Dox 복합체는 프로토콜[20]에 따라 제조되었습니다. 간단히 말해서 C60 및 Dox 용액을 1:1 또는 2:1 중량비로 혼합하였다. 혼합물을 초음파 분산기에서 30분 동안 처리하고 실온에서 24시간 동안 자기 교반하였다. 두 C60의 최종 농도 C60의 Dox -Dox 1:1 복합체는 75 μg/ml였습니다. C60의 최종 농도 C60의 Dox -Dox 2:1 복합체는 각각 100 μg/ml 및 50 μg/ml였습니다. 결합되지 않은 약물은 Pur-A-LyzerTM Midi 1000 Dialysis Kit Sigma-Aldrich Co.(St. Louis, USA)로 세척되었습니다. 복합체의 안정성(ζ-potential value)과 크기 분포(유체역학적 직경)[20, 36,37,38,39]는 생리식염수 용액에 6개월 보관 후에도 실질적으로 변화가 없는 것으로 체계적으로 확인되었습니다. C60의 작업 농도 - 탐침에 있는 Dox 복합체는 0.1–100 μM 범위의 Dox 등가 농도에 따라 제시하여 동일한 농도에서 복합체의 효과와 유리 약물의 효과를 비교하기 위해 의도적으로 제시했습니다.
C60의 질량 분석 -크로마토그래피 분리 후 Dox 복합체는 Nexera 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 시스템에 결합된 전자분무 이온화(ESI) 소스(Shimadzu, 교토, 일본)가 장착된 직렬 사중극자 질량 분석기 LCMS-8040으로 달성되었습니다. 후자는 아세토니트릴의 등용매 이동상과 0.1% 포름산 수용액(80:20, v /v ) 0.3 ml/min의 유속. 크로마토그래피 역상 조건 및 최적화된 MS/MS 매개변수가 표 1에 나와 있습니다. 식별 및 정량화를 위해 Dox의 분자 이온이 선택되었습니다. HPLC-ESI-MS/MS 분석은 최고의 감도와 측정 정확도를 제공하는 다중 반응 모니터링(MRM) 방식을 사용하여 양성 모드에서 수행되었습니다. MS/MS 최적화 후 전구체 및 특징적인 생성물 이온을 포함하는 고유한 MRM 전이가 획득되어 추가 식별 및 정량화에 사용되었습니다. 양성자화된 Dox([M + H] + , 544.2 m/z)는 130.2 및 361.1 m/z의 가장 풍부한 단편 이온을 갖는 전구체 이온으로 사용되었습니다.
데이터 처리를 위해 소프트웨어 LabSolutions HPLC-MS/MS(Shimadzu, Kyoto, Japan)를 사용했습니다. 다른 매개변수는 자동으로 조정되었습니다.
0.005에서 5 μM까지의 Dox 보정 표준은 1.85 mM 물 저장 용액에서 준비되었습니다. 표준은 4 °C의 암실에 보관되었습니다. 보정 곡선은 1/X로 표시되었습니다. 가중치, r 2 =0.99463. 검출 한계(LOD) 및 정량화(LOQ)는 LOD =3.3 × s에 따라 정의되었습니다. /기울기 및 LOQ =10 × s /기울기 각각, 여기서 s 회귀선의 표준편차입니다.
유리 Dox 및 C60의 흡광도 및 형광 스펙트럼 -Dox 복합체는 다음 매개변수에서 측정되었습니다. (1) 흡광도 - 파장 범위 400–550 nm, 파장 단계 크기 5 nm, 웰당 플래시 수 25; (2) 형광성 - λex =470 nm, 파장 범위 500–800 nm, 파장 단계 크기 2 nm, 웰당 플래시 수 25 마이크로플레이트 분광계 Tecan Infinite M200 Pro(Männedorf, Switzerland).
C60 -Dox 복합 크기 분포는 He-Ne 레이저(633 nm)가 장착된 Zetasizer Nano S(Malvern Instruments, UK)로 평가되었습니다. 데이터는 2θ의 산란 각도에서 후방 산란 방식으로 37 °C에서 기록되었습니다. =173°.
백혈병 기원 CCRF-CEM(ACC 240), Jurkat(ACC 282) 및 Molt-16(ACC 29)의 인간 암 T 세포주는 라이프니츠 연구소 DSMZ-독일 미생물 및 세포 배양 컬렉션(Deutsche Sammlung)에서 구입했습니다. von Mikroorganismen und Zellkulturen). THP1은 Dr. Sofia Cortes(New University of Lisbon, Portugal)가 친절하게 제공했습니다.
세포는 10% 소 태아 혈청, 1% 페니실린/스트렙토마이신 및 2 mM 글루타민이 보충된 RPMI 1640 배지에서 25 cm 2 를 사용하여 유지되었습니다. 5% CO2가 포함된 37 °C의 플라스크 가습 인큐베이터 Binder(Tuttlingen, Germany)에서. Roche Cedex XS Analyzer(Basel, Switzerland)를 사용하여 0.1% 트립판 블루 염색으로 생존 세포 수를 세었습니다.
10 4 세포/웰을 96웰 세포 배양 플레이트 Sarstedt(Nümbrecht, Germany)에서 24시간 동안 배양했습니다. 세포 배양 배지를 약물 보충 배지로 교체하였다. 세포는 다양한 농도의 유리 Dox 또는 C60 존재하에서 배양되었습니다. -독스 콤플렉스. 배양 24시간, 48시간 및 72시간 후, 세포 생존율은 MTT 감소 분석으로 결정되었습니다[40]. 간단히 말해서, 10 μl의 MTT 용액(PBS 중 5 mg/ml)을 각 웰에 첨가하고 세포를 37 °C에서 2 시간 동안 인큐베이션했습니다. 그런 다음 배양 배지를 100μl의 DMSO로 교체하고 마이크로플레이트 판독기 Tecan Infinite M200 Pro(Männedorf, Switzerland)를 사용하여 λ =570 nm에서 흡광도를 측정하여 디포르마잔 형성을 결정했습니다. 곡선 피팅 및 최대 억제 농도(IC50) 값의 계산은 전문 소프트웨어 GraphPad Prism 7(GraphPad Software Inc., USA)을 사용하여 수행되었습니다. 간단히 말해서, 개별 농도-효과 곡선은 비선형 회귀를 사용하여 세포 생존율 값의 상응하는 정규화된 백분율에 대해 시험된 화합물 농도의 대수를 피팅함으로써 생성되었습니다.
CCRF-CEM 세포를 2 × 10 5 의 세포 밀도로 6웰 플레이트 Sarstedt(Nümbrecht, Germany)에 접종했습니다. 세포/웰을 2 ml의 배양 배지에 넣고 24 시간 동안 배양합니다. 그런 다음, 세포를 1 μM 유리 Dox 또는 C60으로 처리했습니다. -1, 3, 6 h 동안 Dox 복합체를 만들고 PBS로 세척합니다. 시각화는 적색(λex =480 nm, λem =600 nm) 필터 및 각각의 획득 소프트웨어 Keyence BZ-II Viewer(오사카, 일본)
CCRF-CEM 셀(2 × 10 5 ) /well, 2 ml)를 6웰 플레이트에 접종하고 24시간 동안 배양한 다음 1 μM 유리 및 C60으로 처리했습니다. 바운드 독스. 1, 3, 6시간 인큐베이션 후, 세포를 수확하고 PBS로 세척하고 유세포 분석기 BD FACSJazz™(싱가포르)로 분석했습니다. 최소 2 × 10 4 샘플당 세포를 수집하고 BD FACS™ 소프트웨어(싱가포르)로 분석했습니다.
모든 실험은 최소 4번의 복제로 수행되었습니다. 데이터 분석은 GraphPad Prism 7(GraphPad Software Inc., USA)을 사용하여 수행하였다. 짝을 이루는 학생의 t 테스트가 수행되었습니다. 차이 값 p <0.05는 유의미한 것으로 간주되었습니다.
크로마토그래피 분리를 위해 분리 과정에서 소수성 C60 분자는 극성이 더 높은 Dox의 분자보다 훨씬 더 강하게 컬럼에 유지됩니다[41]. 극성 이동상을 사용한 용출은 분명히 복합체의 분해와 이동상에 더 높은 친화도를 갖고 질량 분석법으로 검출할 수 있는 유리 Dox의 방출을 야기해야 합니다.
용액에서 복합체의 존재를 확인하기 위해 1 μM Dox의 농도가 분석 분석에 최적으로 선택되었습니다. 등용매 유동 조건에서 C60이 있는 착물의 구성 요소로서 자유 Dox 및 Dox에 대한 체류 시간 각각 11.66과 9.44 min으로 달랐습니다(그림 1). 또한, 복합체에서 방출된 Dox의 크로마토그래피 피크는 더 넓고 관찰된 "피크 테일링"이 있었습니다. 검출된 머무름 시간의 이동 및 다양한 선택 모양은 C60의 분해를 나타냅니다. - C18 컬럼에 대해 더 높은 친화도를 갖는 컬럼 풀러렌 분자의 Dox 접합체. 따라서 나노구조는 활성 결합 부위의 일부를 차지하며 Dox가 해당 부위에 제대로 결합하는 것을 방해하여 분리 과정에 영향을 미칩니다. 그 결과 유리 약물과 비교하여 복합체에서 방출된 Dox에 대한 피크 경계 및 테일링뿐만 아니라 더 짧은 머무름(Dox가 컬럼을 통과하는 데 필요한 시간 감소)이 발생합니다. Lie et al.에 의해 매우 유사한 현상이 관찰되었습니다. [42] C60의 크로마토그래피 분리 중 풀루란과의 비공유 착물. C60의 존재에서 분명히 지적된 자유 Dox와 복합체에서 방출된 크로마토그램의 차이점 - 솔루션의 Dox 복합체.
<그림>
자유 Dox(1 μM), C60의 다중 반응 모니터링 크로마토그램 -Dox 1:1 및 C60 -Dox 2:1(1 μM Dox 등가 농도) 등용매 흐름(아세토니트릴, H2의 0.1% 포름산) 착물 O, 80:20, v :v ), 전구체 → 생성 이온 전이:544.2 → 130.2 및 361.1 m/z; 오 임의의 단위
Dox의 광학 특성은 방향족 고리와 케톤 그룹의 π-복합 시스템에서 전자 전이에 의해 결정됩니다[43]. Dox의 일반적인 흡수 스펙트럼은 λ <600 nm의 파장과 480 nm의 넓은 대역에 있습니다(그림 2a). 깨끗한 C60의 UV/Vis 흡수 스펙트럼 물 콜로이드 용액은 220, 265 및 350 nm에서 최대값을 갖는 3개의 전형적인 흡수 밴드와 가시 광선의 적색 영역까지 길고 작은 넓은 꼬리를 가지고 있습니다[34, 44]. 따라서 자유 C60의 각 제어 스펙트럼은 콤플렉스의 스펙트럼에서 제외되었습니다. 두 50μM 복합체에서 관찰된 흡수 스펙트럼은 유리 50 μM Dox의 흡수 스펙트럼과 유사했지만 30% 저변색 효과가 관찰되었으며(그림 2a) C60에 Dox 고정이 있음을 나타냅니다. π-π 스태킹 상호작용으로 인한 표면
<그림>
복합체의 광학적 특성화. 자유 Dox 및 C60의 광학 밀도 스펙트럼 -Dox 콤플렉스(a ). 자유 Dox 및 C60의 형광 방출 스펙트럼 - 3 ~ 50 μM(b)의 Dox 등가 농도의 Dox 복합체 ); 오 임의의 단위
Dox의 장파장 흡수 최대값(λ =480 nm)은 형광 추적을 위한 여기 파장으로 사용되었습니다. 형광 스펙트럼은 560, 594 및 638 nm에서 최대 594 nm 부근의 3개의 피크로 구성된 하나의 넓은 밴드를 나타냅니다(그림 2b)[43]. 반면 C60 이 스펙트럼 대역에서 검출 가능한 형광이 없습니다. C60 -Dox 복합체의 형광은 Dox 등가 농도가 3~50 μM인 일련의 희석액에서 추정되었습니다. 희석에 관계없이 Dox의 형광성(λex =480 nm, λem =594 nm) 복합체에서 C60 모이어티(그림 2b). 따라서, 3 μM Dox 등가 농도에서 두 복합체에서 Dox의 형광은 50%까지 소멸되는 것으로 나타났습니다. 관찰된 Dox 형광 소광은 C60의 강력한 전자 수용 능력에 기인합니다. [3] 비공유 Dox 착물에 대한 일반적인 분자내 여기 상태 에너지 전달 [18, 36, 45], 구성 요소의 공간적 근접성을 나타냅니다.
나노입자형 항암제의 크기와 안정성은 세포 배양 배지 조성, 이온 강도 및 단백질 농도에 따라 크게 좌우됩니다. 1μM C60의 평균 유체역학적 직경 - 생리식염수(0.9% NaCl)에서 Dox 1:1 및 2:1 복합체는 각각 135 ± 5 nm 및 134 ± 6 nm로 이전 조사의 데이터와 일치하는 것으로 밝혀졌습니다[20]. 세포 배양 배지의 안정성을 평가하려면 1-μM C60 -Dox 복합체는 10% FBS가 보충된 RPMI에서 72시간 동안 37°C에서 인큐베이션되었습니다. 이 배지의 입자 크기 분포 패턴(그림 3)은 단백질 함량이 높고 응집 가능성이 있기 때문입니다[46, 47].
<그림>
1μM С60의 유체역학적 크기(직경, nm) -0에서 10% FBS가 보충된 RPMI 세포 배양 배지의 Dox 복합체(a ) 및 72시간(b ) 인큐베이션. 모든 산란광 강도의 강도(%) 백분율
1 μM C60에 대한 동적 광산란 데이터 -FBS 보충 세포 배양에서 Dox 1:1 및 2:1 나노복합체의 유체역학적 직경 분포는 즉시 측정했을 때 크기가 138 ± 6 nm 및 139 ± 5 nm이고(그림 3a) 556 ± 146 ± 4 nm임을 보여주었습니다. 72 h 배양 후 nm(그림 3b).
검출된 최대 안정성(약 140 nm)은 C60의 추가 응집이 없음을 나타냅니다. - FBS가 보충된 세포 배양 배지에서 장기간 배양하는 동안 Dox 복합체는 시험관 내 연구에 대한 적합성을 확인했습니다.
다른 계통의 인간 백혈병 세포의 생존력은 C60의 존재 하에 인큐베이션 24시간, 48시간 및 72시간에서 MTT 테스트에 의해 추정되었습니다. -Dox 복합물 및 유리 Dox는 동일한 농도에서 별도로 분리됩니다. C60 복합체에 있는 것과 동일한 농도에서 단독으로 백혈병 세포 생존에 영향을 미치지 않았습니다(데이터는 표시되지 않음).
그림 4는 Dox 처리 시 백혈병 세포 생존력의 시간 및 농도 의존적 감소를 보여줍니다. 약물은 나노몰 범위에서 백혈병 세포에 대한 독성을 나타내는 것으로 나타났습니다. Dox에 대한 백혈병 세포의 감도는 Molt-16 ˃ THP1 ˃ Jurkat ˃ CCRF-CEM(덜 감도) 순서를 따르는 것으로 밝혀졌습니다.
<그림>
동일한 용량의 유리 Dox 또는 C60으로 처리된 CCRF-CEM, Jurkat, THP1 및 Molt16 백혈병 세포의 생존력 -24, 48 및 72 h에 대한 Dox 콤플렉스(*p 무료 Dox와 비교하여 ≤ 0.05, **p C60과 비교하여 ≤ 0.05 -Dox 1:1 컴플렉스, n =5)
100 nM Dox의 작용하에 CCRF-CEM 세포의 생존율은 대조군과 비교하여 각각 24, 48 및 72 시간에 84 ± 7, 50 ± 4 및 34 ± 7%로 감소했습니다. 100 nM Dox 독성 효과의 유사한 패턴이 Jurkat 세포에서 발견되었습니다. 100 nM Dox 세포로 처리한 후 THP1 세포의 생존율은 24, 48 및 72 h에서 각각 50 ± 4, 47 ± 5 및 13 ± 4%인 것으로 밝혀졌습니다. 72시간의 배양에서 CCRF-CEM, THP1 및 Jurkat 세포에 대한 절반 최대 억제 Dox 농도(IC50)는 각각 80 ± 9, 43 ± 5 및 38 ± 6 nM인 것으로 추정되었습니다. 이 데이터는 문헌 데이터[48, 49]에 해당합니다. Molt-16 세포는 모든 세포 배양 기간 내에서 1 ~ 25 nM 범위에서 독성 효과가 검출되었기 때문에 약물에 가장 민감한 것으로 나타났습니다. 5 nM Dox를 처리한 Molt-16 세포의 생존율은 대조군의 75 ± 4, 28 ± 4, 18 ± 4%로 24, 48, 72 h에서 각각 감소하였고 IC50 값은 72 이었다. 2.0 nM에 불과합니다. 약초 알칼로이드 치료를 받는 Jurkat 세포와 비교하여 10배 더 강력한 세포자멸사 유도를 갖는 Molt-16 세포의 유사한 높은 민감도는 이전에 Cai et al.에 의해 보고되었습니다. [50].
유리 Dox로 처리된 세포는 C60의 작용 하에 생존력을 평가하기 위한 대조군으로 사용되었습니다. - Dox는 약물의 등가 용량에서 복합물을 생성합니다. 무료 Dox 및 C60에 대한 IC50 값 - Dox 복합체는 각 시점과 세포주에 대해 계산되었으며 그림 4에 나열되어 있습니다.
C60 -Dox 복합체는 인간 백혈병 세포주에 대해 유리 Dox에 비해 더 높은 독성 잠재력을 보유했습니다(그림 4).
요약하면, 우리의 수많은 실험은 4개의 세포주에 대해 최대 3.5배까지 다양한 강화된 독성을 보여주었습니다. C60 -Dox 1:1 Complex는 2:1 Complex에 비해 높은 독성을 나타냅니다. 2:1 복합체의 덜 뚜렷한 효과(자유 Dox에 비해 ≥ 2.5배에서 IC50 감소)는 더 높은 농도의 C60 때문일 수 있습니다. 그 구성 요소로. 항산화 활성으로 인해 [11, 13] C60 초과 Dox 관련 산화 스트레스로부터 세포를 보호할 수 있습니다[27].
C60의 강화된 독성 효과의 잠재적 상관 관계를 조사하기 위해 - 보다 효과적인 세포내 약물 축적, 유리 Dox 및 C60의 세포 흡수를 갖는 Dox 복합체 -독스를 공부했습니다. Dox는 가시광선 영역에서 강한 흡수와 형광성을 가지고 있기 때문에[43, 45](그림 2), 비침습적 직접 형광 기반 기술로 Dox 복합체의 추적이 가능합니다. CCRF-CEM 세포는 1 μM Dox 또는 C60 존재하에서 배양되었습니다. - 약물 등가 농도의 Dox 복합체를 형광 현미경으로 검사하고 유세포 분석을 통해 1시간, 3시간 및 6시간 처리 후 축적된 약물의 세포 내 수준을 정량화합니다(그림 5). 각 샘플의 평균 형광 강도는 로그 FACS 히스토그램에서 각각의 Dox 적색 형광 신호 값(λex =488 nm, λem =585/29 nm)이며 표 2에 나와 있습니다. 처리되지 않은 세포의 자가형광은 음성 대조군으로 사용되었습니다(그림 5a).
<그림>
1 μM 유리 및 C60의 세포내 축적 복잡한 Dox. 유세포 분석(a ) 및 형광 현미경 이미지(b ) Dox 및 C60와 함께 배양된 CCRF-CEM 세포 -1, 3 및 6 h에 대해 1:1 및 2:1 비율의 Dox. 스케일 바 20 μM
1 μM Dox의 시간 의존적 축적은 형광 강도 향상에 의해 추정되었습니다(그림 5, 표 2). 형광 현미경 이미지는 C60 -Dox 복합체는 훨씬 더 밝은 세포 내 형광에 의해 입증된 바와 같이 유리 약물보다 더 빨리 내재화되었습니다(그림 5b). 1:1 C60로 처리된 CCRF-CEM 세포의 평균 형광 강도 -1 μM Dox 등가 농도에서 Dox 복합체는 1, 3 및 6 h에서 유리 Dox에 비해 각각 1.5, 1.7 및 2.2배 증가했습니다. 2:1 C60 -Dox 복합체는 6 h에서 1:1 복합체와 동일한 수준에 도달하는 지연된 세포내 약물 축적을 나타냈다(그림 5, 표 2).
얻어진 데이터는 Dox 착물이 C60 세포로의 진입을 촉진했지만 현지화에는 영향을 미치지 않았습니다. 연구된 세포를 DNA 결합 염료 Hoechst 33342로 대조 염색한 결과 Dox 신호와의 공동 국소화가 밝혀졌습니다(데이터는 표시되지 않음). 분명히 C60의 Dox 분자는 복합체와 자유 약물은 DNA 손상을 통한 항증식 효과를 반영하는 핵으로 들어갔다[26,27,28]. C60과의 복합체 형성 시 약물의 세포내 흡수 증가 약물 수송 촉진제로 기능하는 후자를 가리킨다. C60 나노구조는 수동 확산[51] 및/또는 세포내이입/음세포작용[52, 53]으로 인해 세포 원형질막을 이동하는 것으로 나타났지만 Dox와 같은 작은 분자는 수동 확산을 통해서만 투과할 수 있습니다. C60 구조는 endocytosis 동안 소포 형성의 주요 코트 구성 요소인 clathrine[54, 55]의 구조와 유사합니다. 따라서 C60 작은 방향족 분자의 운반체로 기능할 수 있습니다[56]. 반대로, 운반체와 화물 사이의 공유 결합은 약물 분자에 구조적 변화를 도입합니다. 결과적으로 축적 패턴과 세포 내 표적과의 상호 작용이 변경되어 약물 기능이 완전히 또는 부분적으로 손실됩니다. Liu et al. [15]는 C60 아미드 결합을 통해 결합된 두 개의 Dox 분자가 세포질에 주로 분포되어 있습니다.
C60의 물리화학적 특성 -Dox 복합체는 1:1 및 2:1 비율의 성분 비율로 결정되었으며 인간 백혈병 세포 CCRF-CEM, Jurkat, Molt-16 및 THP1에 대한 독성을 추정했습니다.
HPLC-MS/MS 분석은 유리 Dox의 크로마토그램과 C60에서 방출된 크로마토그램의 분명한 차이를 보여주었습니다. -독스 콤플렉스. C60의 복소화 Dox로 C60에서 흡수성 저변색 효과 및 형광 소광으로 확인 -독스 콤플렉스. 우리는 C60의 크기를 - 140 nm 부근의 Dox 복합체는 단백질이 존재할 때 유지되었고 배지에서 장기간 배양되었습니다. 인간 백혈병 세포주에 대한 연구에 따르면 C60 -Dox 복합체는 동등한 농도의 유리 약물에 비해 더 높은 세포 독성을 나타냅니다. 세포 배양 72시간에서 1:1 및 2:1 복합체에 대한 IC50 값은 유리 약물에 대한 IC50과 비교하여 각각 3.5배 이하 및 2.5배 이하로 감소했습니다. C60을 사용한 복합화 백혈병 세포에 Dox 진입을 촉진했습니다. C60으로 6 h 동안 CCRF-CEM 세포 처리 -1 μM Dox 등가 농도의 Dox 복합체는 유리 Dox 처리에 비해 약물 세포 내 수준이 2.2배 증가했습니다.
결과는 C60의 기능을 확인합니다. 백혈병 세포에 대한 Dox 효율 최적화를 위한 나노운반체 및 응용의 관점. Dox는 많은 항종양 약물의 대표 또는 모델 물질일 뿐이므로 우리의 연구 결과가 다른 약물로 이전될 수 있을 것으로 기대합니다. 종양 세포로의 약물 흡수 및/또는 항종양 특성을 증가시키는 것은 새로운 치료 전략을 제시할 수 있습니다. 나노운반체와 약물의 복합화는 효과적인 투여율을 감소시켜 원치 않는 부작용을 약화시키는 역할을 할 수 있습니다.
C60 풀러렌
디메틸설폭사이드
독소루비신
전자분무 이온화
태아 소 혈청
고성능 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분석기
Half-maximal inhibitory concentration
Limit of detection
Limit of quantification
Multiple reactions monitoring
3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide
인산염 완충 식염수
나노물질
E3.series는 설계 및 개발 응용 프로그램의 발전을 전담하는 전기 엔지니어링 소프트웨어입니다. 업데이트 E3.Series 2015가 출시되었으며 새로운 도구와 기능은 제품 효율성에 대한 새로운 기반을 제공합니다. E3.series는 배선 및 제어 시스템, 유압 및 공압 설계를 위한 창 기반의 확장 가능하고 배우기 쉬운 시스템입니다. E3.series는 다음을 포함한 새로운 기능을 제공하는 2015 버전 업데이트를 출시했습니다. E3.series의 표준 E3.series 모듈에서 수많은 추가 기능 새로운 COM 호출
모든 기업이 경쟁 우위를 확보하기 위해 노력하는 인더스트리 4.0 시대에 제조업체가 고품질 제품을 적시에 제공하는 것이 그 어느 때보다 중요해졌습니다. 생산 병목 현상과 지연, 급증하는 생산 및 유지 관리 비용, 연장된 기계 가동 중지 시간은 도저히 용납할 수 없습니다. 그렇기 때문에 오늘날의 미래 지향적인 제조업체는 최신 리소스 모니터링 시스템을 사용하여 효율성을 높이는 새로운 방법을 개척하고 있습니다. 실제로 리소스 모니터링은 산업용 사물 인터넷(IIoT) 기술의 주요 사용 사례로 빠르게 자리잡고 있습니다. 따라서 공장의 리
