인간 암 탐지를 위한 이중 표적 자기 나노입자

초록

악성 종양은 인간의 생명에 대한 주요 위협이며 높은 림프관 밀도는 종종 전이성 종양과 관련이 있습니다. 림프관 내피 히알루로난 수용체 1(LYVE-1) 및 포도플라닌과 같은 림프계를 표적으로 하는 분자의 발견으로 종양 전이에서 림프관 내피 세포(LEC)의 역할을 결정하기 위한 많은 연구가 수행되었습니다. 그러나 비특이성 및 높은 비용과 같은 단점으로 인해 연구 및 진단 응용 프로그램이 제한됩니다. 이 연구에서 Fe₃ O₄ Fe₃를 활성화하여 코어-쉘(core-shell) 형태의 자성 나노입자인 @KCTS를 제조했습니다. O₄ 카르보디이미드와 α-케토글루타레이트 키토산(KCTS)을 교차 연결합니다. 그런 다음 LYVE-1 및 Podoplanin 항체가 이러한 자성 나노 입자의 표면에 통합되었으며 결과적으로 이중 표적 자성 나노 프로브가 개발되었습니다. 이 연구의 실험 테스트에서 종양 조직에서 추출한 고순도 LEC를 사용하는 이중 표적 자기 나노프로브가 성공적으로 개발되었음을 보여줌으로써 이중 모드 영상을 사용한 조기 임상 진단은 물론 대장암 치료에 LEC를 임상 적용할 수 있는 기반을 제공했습니다.

소개

악성 종양은 인간의 건강에 큰 위협이 됩니다[1]. 이전 연구에서는 종양 미세 환경이 종양 관련 전이와 같은 종양의 생물학적 특성에 영향을 미치는 것으로 나타났습니다[2, 3]. 그러나 잠재적인 메커니즘, 특히 림프 내피 세포(LEC)가 종양 전이를 촉진하는 과정은 아직 명확하지 않습니다[4]. 따라서 림프관을 표적으로 하는 종양에 대한 진단 전략을 설계하는 것이 필요합니다. 림프관 특이적 마커, 특히 LEC를 혈관 내피와 구별하는 마커의 부족은 LEC 기능에 대한 연구를 제한합니다. 최근에는 림프관 내피 히알루로난 수용체 1(LYVE-1)[5, 6], 포도플라닌[7], 혈관 내피 성장 인자 수용체 3(VEGFR-3)[8], Prox와 같은 LEC 특이적 마커가 있습니다. -1이 확인되었습니다[9]. 이것은 특히 종양 진단을 위해 종양 내림프관을 표적으로 함으로써 종양 림프관에 대한 연구를 가속화했습니다. 또한 면역자기 비드를 이용하여 종양 내림프 내피 세포를 분류함으로써 종양 전이 기전에 대한 연구를 가능하게 하였다[10]. 그러나 분자 병리학에서 사용되는 다른 많은 마커와 유사하게 LEC 관련 분자 마커 중 어느 것도 LEC에 완전히 특이적이지 않습니다. Prox-1은 핵에서 일시적으로 발현되기 때문에[11] 임상 적용에는 적합하지 않습니다. VEGFR-3은 LEC에서 발현되지만 혈관 상피에서도 발현되기 때문에 암에서 림프계 특이성이 부족하다[8]. LYVE-1은 LEC뿐만 아니라 정상 간 정현파, 비장 내피, 높은 내피 정맥, 활성화된 조직 대식세포에서 특이적으로 발현되지만 혈관 상피에서는 발현되지 않는다[7]. 포도플라닌은 혈관 상피 세포에서 발현되지 않지만 LEC에 대한 특이적 마커입니다[7, 12].

자성 산화철, 나노금, 양자점, 리포솜, 산화티타늄은 생체적합성이 높고 비표면적이 크며 다른 생물학적 기능 분자와의 변형이 용이하여 암 진단 및 치료에 널리 사용된다[13, 14]. 위의 특성 외에도 자성 산화철(Fe₃ O₄ )은 크기 분포가 좁고 분산성이 좋으며 상자성이 높으며 크기를 제어할 수 있어 자기공명영상에 적합하다[15]. 그 중 항체로 코팅된 초상자성 산화철은 세포 분리, 인식 및 종양의 조기 진단에 널리 사용되어 왔다[16, 17]. 키토산 표면은 천연 고분자 물질로서 수산기와 아미노기가 풍부하고 생체적합성, 혈액적합성, 안전성, 미생물 분해성 등의 우수한 특성으로 인해 널리 사용되어 왔다[18]. 따라서 키토산 또는 키토산 유도체와 자성 Fe₃의 조합 O₄ 자성 비드가 서로 뭉쳐 자성 유체를 형성하는 것을 방지할 수 있기 때문에 생물학적 응용에 더 도움이 됩니다. 이러한 이유로 더 나은 분산 성능을 생성합니다.

종양 연구에서 종양의 림프관 검출은 항체로 직접 표지하거나 항체를 자기 비드와 결합하여 림프 내피 세포를 분류하는 것을 기반으로 합니다. 여기에서 종양 내 림프관을 보다 정확하게 표적화하기 위해 다중 표적 나노프로브, 즉 림프 내피 세포에 대한 2개의 고도로 특이적인 항체, 항-Lyve-1 항체 및 항-포드플라닌 항체를 설계했습니다. 이들 항체는 키토산으로 코팅된 사산화철 나노입자에 결합되었다. 다른 나노프로브와 비교할 때, 두 개의 항체를 포함하는 이 연구에서 설계된 나노프로브는 림프관 검출에 더 정확하므로 분리된 림프 내피 세포가 더 순수합니다.

본 연구에서는 인간 암세포에서 LEC를 빠르게 농축 및 분리하기 위해 항-LYVE-1 항체 및 항-포드플라닌 항체에 대해 상대적으로 특이성이 높은 리간드를 사용하여 키토산으로 코팅된 초상자성 나노입자와의 결합을 촉진하여 자성체를 제조하였다. LEC를 선택하기 위한 비드. 또한 프로브가 고형 종양의 바이모달 진단이 가능한 것으로 확인되었습니다.

재료 및 방법

세포주 및 세포 배양 조건

ATCC 세포 은행에서 구입한 결장암 세포주(HT29)를 10% 소태아혈청(미국 뉴욕주 그랜드아일랜드 소재의 Gibco)이 포함된 Dulbecco의 변형된 Eagle 배지(DMEM)에서 37°C에서 배양했습니다. Gibco, Grand Island, NY, USA), 100U/mL 페니실린 및 100μg/mL 스트렙토마이신, 5% CO₂ 미만 .

실험 동물 모델

40마리의 NOD/SCID 암컷 마우스(4~6주령)를 Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Company(중국 베이징)에서 구입했습니다. 대수기에서 성장한 HT29 세포를 PBS(phosphate-buffered saline)로 3회 세척하였다. 트립신으로 소화한 후 세포를 1000rpm에서 5분 동안 원심분리했습니다. 그런 다음 세포를 PBS에 재현탁하고 세포 농도를 2 × 10⁷ 로 조정했습니다. /mL. 각 마우스에 200μL의 세포 현탁액을 주입했습니다. 모든 실험 프로토콜은 Guangxi Medical University(광시, 중국)의 동물 윤리 위원회의 승인을 받았습니다.

Fe의 준비 및 특성화₃ O₄ @KCTS-LECs-이중항체 자기 나노프로브

키토산(Xi'an Ruixi Biotechnology)은 α-케토글루타르산으로 카르복실화되어 표면에 CO-기가 풍부한 α-케토글루타레이트 카르복시메틸 키토산(KCTS)을 얻습니다[19]. Fe₃ O₄ (Xi'an Ruixi Biotechnology)를 코어로 사용하고 KCTS를 기본 골격 구조로 설정했습니다. Fe₃ 활성화 후 O₄ 카르보디이미드, Fe₃를 포함하는 나노입자 O₄ @KCTS는 KCTS-COOH와 surface-OH의 공유 결합을 결합하여 형성되었습니다. 선택된 LEC 항체는 인간 LYVE-1 APC-접합 항체(R&D Systems®, 카탈로그 번호 FAB20892A) 및 항-포도플라닌 항체(FITC)(Abcam, 카탈로그 번호 ab205333)에 특이적으로 있었습니다. 이 항체는 카르복실화된 Fe₃에 공유적으로 가교되었습니다. O₄ 활성화된 EDC/NHS를 사용하는 @KCTS. 결과적으로, Fe₃로 지칭되는 LEC 이중 항체로 변형된 자기 나노프로브 O₄ @KCTS-LECs-이중항체 자기 나노프로브(0.1mg/mL)를 얻었다. 이중 항체가 결합된 나노입자는 4°C의 어둠 속에서 보존되었습니다.

준비된 Fe₃의 형태 및 크기 분포 O₄ @KCTS-LECs-이중항체 자성 나노입자는 투과전자현미경(TEM; H-7650, Japan)을 이용하여 평가하였다. Fe₃의 입자 크기(크기), 제타 전위 및 입자 분산 지수(PDI) O₄ @KCTS-이중항체는 동적광산란(DLS; PRO3000, Japan)을 이용하여 측정하였고, 형광분광광도계(FL-7000, Perkin Elmer, USA)를 이용하여 광발광을 측정하였다.

면역조직화학 및 면역형광

냉동 조직 절편을 준비하고 얼음 아세톤에 10분 동안 넣은 다음 PBS 용액에 10분 동안 담가두었습니다. 1% BSA로 차단하고 PBS로 3회 세척한 후 섹션을 인간 LYVE-1 APC 접합 항체 및 항-포도플라닌 항체(FITC)와 함께 4°C에서 30분 동안 인큐베이션했습니다. 배양 후, 절편을 PBS 용액에 3회 담근 후 4',6-diamidino-2-phenylindole(DAPI) 염색 용액을 종양 조직에 첨가하여 조직을 완전히 덮었다. 섹션을 실온에서 5분 동안 다시 인큐베이션했습니다. 이후 PBS로 3회 세척한 후, 절편이 완전히 건조되면 항형광 소광제를 첨가하였다. 마지막으로 섹션을 커버 유리에 장착하고 공초점 현미경(Nikon DS-Ri1; Nikon, Tokyo, Japan)으로 관찰했습니다.

포르말린에 보존된 결장암 조직은 이 연구를 위해 파라핀 포매되었습니다. HT29 암 이종이식편의 왁스 제거된 섹션을 3% 과산화수소로 차단하고 5% 정상 혈청에서 차단하고 항-LYVE-1 항체(Abcam, ab10278, UK)와 함께 4°C에서 밤새 인큐베이션했습니다. 다음으로, 양고추냉이 퍼옥시다제-접합 슈퍼스트렙타비딘의 표지 시약 내 비오틴 표지 이차 항체 염소 항토끼 IgG H&L(HRP)(ab205718)을 30분 동안 배양하였다. 색상은 3,3'-diaminobenzidine(DAB) 용액을 이용하여 측정하였습니다.

세포 정화

종양의 평균 부피는 약 1.5 × 1 × 1 cm³ 였습니다. . 종양을 제거하기 전에 마우스를 75% 에탄올에 3~5분 동안 담가 소독했습니다. 소독된 마우스 피부를 깨끗한 벤치에서 멸균 가위와 멸균 집게로 절단했습니다. 종양 조직을 조심스럽게 절제하고 PBS가 들어 있는 페트리 접시에 놓았다. 담근 종양 조직을 안과용 가위로 절단하고 멸균 플레이트에 놓았다. 파쇄된 조직을 저온 살균된 튜브를 사용하여 50mL 원심분리 튜브에 피펫으로 옮겼습니다. 그런 다음 3배 부피의 콜라게나제 I을 튜브에 첨가하고 10분 동안 볼텍싱하여 콜라게나제 I-종양 조직 혼합물을 얻었다. 그런 다음 혼합물을 37°C 수조에 20분 동안 두었고 이를 5회 반복했습니다. 소화가 끝나면 콜라게나제 I을 완전 배지를 추가하여 중단하고 혼합물을 2분 동안 방치했습니다. 300g에서 10분 동안 원심분리한 후, 종양을 PBS로 2회 세척한 다음 10mL PBS에 재현탁하고 공극 크기가 75μm(200메쉬)인 체를 통해 천천히 여과했습니다. 여과된 세포를 계수하고 2개의 15mL 원심분리 튜브에 평균을 내고 PBS에 재현탁한 다음 300g에서 10분 동안 원심분리한 다음 3회 세척했습니다. (1) MACS 자기 비드 분류 방법:세척된 세포를 100μL 완충액에 재현탁했습니다. PBS pH 7.2, 0.5% BSA 및 2mM EDTA를 포함하는 용액은 MACS BSA 스톡 용액(Cat. No. 130-091-376)을 auto MACS™ 헹굼 용액(Cat. No. 130)으로 1:20으로 희석하여 제조했습니다. -091-222). 다음으로, 10μL 인간 LYVE-1 APC-접합 항체를 첨가한 다음 암실에서 4°C에서 15분 동안 인큐베이션했습니다. 마지막으로 2mL 완충용액으로 3회 세척했습니다. 원심분리 후, 80μL 완충액을 첨가하여 세포를 재현탁시키고, 20μL의 항-APC 플루오레세인 자기 비드 용액을 첨가하였다. 혼합물을 15분 동안 배양하고 3회 세척한 다음 원심분리하고 300μL의 완충용액과 잘 혼합했습니다. 마지막으로, 컬럼의 양성 세포는 3mL 완충 용액으로 빠르게 녹다운되었습니다. 생성된 세포를 6-웰 플레이트에서 배양하였다. (2) Fe₃ O₄ @KCTS-LECs-이중 항체 자성 나노입자 분류 방법:세척된 세포를 Fe₃와 혼합된 200μL 완충액에 재현탁했습니다. O₄ @KCTS-LECs-이중 항체 자성 나노입자, 어두운 곳에서 4°C에서 20분 동안 배양한 다음 4mL 완충액으로 3회 세척하고 원심분리하고 160μL 완충액에 재현탁합니다. 마지막으로 자석을 이용하여 세포를 용출시키고 6-well plate에서 배양하였다.

다른 방법으로 분류된 세포의 면역형광

다른 분류 방법으로 분류된 세포는 5 × 10⁴ 의 세포 농도로 조정되었습니다. /mL를 PBS로 넣고 12-well plate에 고르게 퍼뜨립니다. 1 밀리리터의 세포 현탁액을 각 웰에 첨가한 다음 5% CO₂에서 24시간 동안 37 °C에서 배양했습니다. 주변. 그런 다음 오래된 배지를 버리고 세포를 PBS 용액으로 3회 세척했습니다. 그런 다음 각 웰에 200μL의 4% 파라포름알데히드를 첨가하고 세포를 실온에서 10분 동안 유지했습니다. 그 다음, 세포를 PBS 용액으로 3회 세척하고, 인간 LYVE-1 APC-접합 항체 및 항-포도플라닌 항체(FITC)를 첨가하였다. 암실에서 4°C에서 2시간 동안 배양한 후 세포를 3회 세척했습니다. 또한, 각 웰에 50μL DAPI를 첨가하고 실온에서 10분 동안 배양하여 핵을 파란색으로 염색한 후 PBS로 3회 세척했습니다. 마지막으로 슬라이드 중앙에 형광소광제를 떨어뜨리고 세포가 덮인 면을 슬라이드 유리 위에 올려놓고 레이저 주사 공초점 현미경으로 관찰했다.

다른 방법으로 분류된 세포의 유세포 분석

다양한 방법으로 분류된 세포를 200μL 결합 완충액(10mM HEPES/NaOH pH 7.4, 140mM NaCl, 2.5mM CaCl)에서 인간 LYVE-1 APC-접합 항체 및 항-포도플라닌 항체(FITC) 항체로 재현탁했습니다. , 그리고 어두운 곳에서 4°C에서 1시간 동안 배양한 다음 PBS로 3번 세척했습니다. 세포를 유세포 분석기(BD Accury6; Becton Dickinson, San Jose, CA, USA)로 검출 및 분석한 다음 FlowJo 소프트웨어(Tree Star Inc., Ashland, OR, USA)로 분석했습니다.

LEC 활동 감지

다른 방법으로 분류된 대수 성장기 세포를 수집하고, 소화하고, 계수했습니다. 세포 농도를 2 × 10⁵ 으로 조정했습니다. 세포/mL 및 50μL의 이러한 세포를 Matrigel 코팅 μ-슬라이드 플레이트의 각 웰에 첨가하고 5% CO₂에서 배양했습니다. 37°C에서 6시간 동안 인큐베이터 배지를 분리하고 저온 살균 점적기로 버리고 1μg/mL 칼세인 AM(Invitrogen, 카탈로그 번호 c3099)을 함유하는 PBS 용액을 첨가했습니다. 그런 다음 세포를 암실에서 1시간 동안 실온에서 배양하고 PBS로 세척하고 현미경(Nikon, Japan)으로 사진을 찍었습니다. 이후 1 × 10⁵ 세포를 20μg/mL의 DiI-ac-LDL(Molecular Probes, Invitrogen)을 포함하는 500μL 완전 배지와 혼합한 다음 4시간 동안 37°C의 24웰 플레이트에 접종했습니다. 오래된 배양액을 제거하고 세포를 PBS로 3회 세척하였다. 그런 다음 50μL의 DAPI 용액을 각 웰에 첨가하고 실온에서 10분 동안 배양하여 핵을 파란색으로 염색했습니다. PBS로 세 번 세척한 후 최종적으로 현미경으로 이미지화되었습니다.

생체 내 MR 및 형광 이미징

종양이 Fe₃의 표적이 되었는지 여부를 결정하기 위해 다음 단계를 따랐습니다. O₄ @KCTS-LECs-동물의 이중항체 자성 나노입자. 결장암의 NOD/SCID 마우스 피하 이종이식 모델은 자기 공명 또는 형광 스캐닝에 사용되었습니다. T2 강조 영상은 3.0T MRI 스캐너(Discovery 750, gE, Germany)를 사용하여 시야(80 × 80 mm), 에코 시간(69 ms), 층 두께(2.0 mm)를 포함하는 특정 조건에서 수행되었습니다. , 40mm 직경의 마우스 볼륨 코일이 있습니다. NOD/SCID 마우스는 두 그룹(n =3); 실험군과 수용체 차단군. 모든 마우스에 Fe₃를 주입했습니다. O₄ 꼬리 정맥을 통한 @KCTS-LECs-이중 항체(0.5mmol/kg) 자기 나노 입자. 각 마우스는 주사 전, 주사 후 0.5 h, 12h 및 24h의 4가지 특정 시점에서 스캔되었습니다. 수용체 차단 그룹에서 각 마우스에 Anti-LYVE-1 항체(Abeam, ab10278, UK)와 항포도플라닌 항체(Abcam, ab10288, UK)를 주사한 후 Fe₃를 주사했습니다. O₄ @KCTS-LECs-이중항체. MRI 스캔은 동일한 4개의 시점에서 수행되었습니다. 작은 동물의 생체 내 이미징 시스템(Bruker, USA)을 사용하여 형광 이미지를 촬영했습니다. 그룹핑, 약물 주입 및 스캔 시점은 위에서 언급한 바와 같습니다.

Fe의 독성₃ O₄ @KCTS-LECs-이중항체 자기 나노프로브

Fe₃의 독성 O₄ @KCTS-LECs-LEC에 대한 이중 항체 자기 나노프로브는 CCK-8 분석에 의해 평가되었습니다. 세포(100μL 배지, 2 × 10⁵ /mL)을 5% CO₂를 포함하는 인간화 분위기에서 37°C의 96웰 플레이트에서 밤새 배양했습니다. , Fe₃ 처리 O₄ @KCTS-LECs-이중항체 자기 나노프로브(0.1, 0.5, 1.0, 2.0 mg/mL)를 동일한 조건에서 24시간 또는 48시간 동안 인큐베이션 후 10μL CCK-8 용액을 각 웰에 첨가한 후 2시간 동안 다시 인큐베이션했습니다. 광학 밀도(OD)는 ELISA 마이크로플레이트 리더(Thermo Scientific, USA)로 450nm에서 측정되었습니다.

Fe₃의 독성 평가 O₄ @KCTS-LECs-이중 항체 자기 나노프로브 생체 내, NOD/SCID 암컷 마우스에 200μL PBS(대조군) 또는 Fe₃의 단일 꼬리 정맥 주사를 받았습니다. O₄ @KCTS-LECs-이중 항체 자기 나노프로브(2mg/mL)(n =그룹당 동물 3마리). 1주 후 마우스를 희생시키고 주요 조직(심장, 폐, 간, 비장, 신장)의 절편을 채취하여 10% 포름알데히드 용액에 담그고 탈수하고 파라핀을 포매했습니다. 파라핀화된 섹션(두께 4μm)을 절단하고 헤마톡실린-에오신으로 염색했습니다.

날짜 분석

데이터 분석에는 SPSS 16.0 통계 소프트웨어를 사용했습니다. 측정 데이터는 x ± s로 표현하였으며, 집단간 비교는 분산분석, 카운트 데이터의 비교는 카이제곱검정으로 하였다. 피 <0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다.

<섹션 데이터-제목="결과">

결과

인간 암 검출을 위한 이중 표적 자기 나노입자의 원리

이 연구에서는 Scheme 1, Fe₃에서 볼 수 있듯이 O₄ Fe₃를 활성화하여 코어-쉘(core-shell) 형태의 자성 나노입자인 @KCTS를 제조했습니다. O₄ 카르보디이미드와 α-케토글루타레이트 키토산(KCTS)을 교차 연결합니다. 그런 다음 LYVE-1 및 포도플라닌 항체를 이러한 자성 나노입자의 표면에 추가하여 이중 표적 자성 나노프로브를 형성했습니다. 이 프로브를 꼬리 정맥을 통해 마우스 모델에 주입하여 T2 강조 MR 영상 및 형광 영상으로 종양을 진단했습니다. 절제 후 종양을 단일 세포로 으깬 다음 프로브와 함께 배양하여 더 높은 순도의 림프구 내피 세포를 자석으로 식별하여 종양 전이의 메커니즘을 탐색했습니다. 결과는 종양 조직에서 고순도 LEC를 제공하는 이중 표적 자기 나노프로브가 성공적으로 개발되어 대장암에서 LEC의 임상 적용과 결장직장암의 이중 모드 영상화를 통한 조기 임상 진단의 기초를 제공함을 입증했습니다.

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Fe₃의 개략도 O₄ @KCTS-LECs-이중항체 자성나노입자

Fe의 특성₃ O₄ @KCTS-LECs-이중항체 자기나노입자

TEM 이미지(그림 1a)는 Fe₃ O₄ 구형으로 불규칙하고 입자 사이에 덩어리가 있습니다. Fe₃일 때 O₄ KCTS에 의해 변형되었으며(그림 1b), 입자는 규칙적인 구형 또는 타원형이며 입자가 균일하게 분산되어 있습니다. 그림 1c와 같이 Fe₃ O₄ @KCTS-LECs-이중항체 자성 나노입자는 Fe₃ 표면에 음전하를 띤 항체로 변형되었습니다. O₄ @KCTS는 음전하를 부여하여 나노 입자 간의 정전기 반발을 증가시킵니다. Fe₃ O₄ @KCTS-LECs-이중항체 자성 나노입자는 구형이고 균일하며 입자 응집이 없고 손상되지 않았다. 평균 직경은 91.28 ± 2.31nm이고 PDI는 0.207 ± 0.015입니다(그림 1d). 그림은 나노 입자의 크기 분포가 좁고 물에 잘 분산되었음을 보여줍니다. 음으로 대전된 표면은 − 32.8 ± 1.51mV의 제타 전위를 가지며 절대값은 - 30 이상으로 재료의 안정성이 양호함을 나타냅니다(그림 1e).

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자기 나노프로브의 특성화. 아 Fe₃의 투과전자현미경 사진 O₄ 나노프로브(스케일 바, 100 nm). ㄴ Fe₃의 투과전자현미경 사진 O₄ @KCTS nanoprobe(축척 막대, 100nm). ㄷ Fe₃의 투과전자현미경 사진 O₄ @KCTS-LECs-이중항체 자기 나노프로브(스케일 바, 100 nm). d 입도는 입도분석으로 측정하였으며, 프로브의 평균크기는 91.28 nm였다. 이 제타 전위는 약 − 32.8mv였습니다. 에 Fe₃ O₄ @KCTS-LECs-이중항체 나노프로브는 여기광에서 488 및 545의 방출 피크를 가집니다.

형광 분광기의 결과는 그림 1f에 나와 있습니다. 488 여기광 하에서 항-포도플라닌 항체(FITC) 및 545 여기광 하에서 항-LYVE-1 항체(APC)에서 뚜렷한 방출 피크가 관찰되었습니다. Fe₃에서 방출 피크의 존재 O₄ 488 및 545 여기에서 @KCTS-LECs-이중 항체 복합체는 물질이 성공적으로 결합되었음을 나타냅니다.

면역조직화학 및 면역형광

도 2a, b에 나타난 바와 같이 결장암 조직에서 LYVE-1의 발현이 관찰되었고 동결된 종양 조직에서 LYVE-1과 포도플라닌 항체의 발현이 관찰되었다. 이것은 소량의 림프 내피 세포가 결장암 조직에 존재함을 입증했습니다.

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대장암 조직에서 림프관의 발현. 아 조직 섹션의 확장된 혈관은 면역조직화학(척도 막대, 100μm)에 의해 내피 세포막의 LYVE-1에 대해 양성이었습니다. 오른쪽은 확대 사진입니다. ㄴ 조직 섹션의 확장된 혈관은 면역형광법(스케일 막대, 50μm)에 의해 밝혀진 바와 같이 내피 세포막의 LYVE-1 및 포도플라닌에 대해 양성이었습니다.

LEC의 분리 및 강화

면역형광 염색은 두 가지 다른 분류 방법으로 얻은 세포에 대해 수행되었습니다. LYVE-1 MicroBeads 자기 비드로 분류된 세포는 LYVE-1 단백질을 발현하지만 포도플라닌은 발현하지 않는 반면, Fe₃로 얻은 세포는 O₄ @KCTS-LECs-이중항체 자성 나노입자는 단백질 LYVE-1과 단백질 포도플라닌을 발현하였다(그림 3a). 또한, 다른 방법으로 분류된 세포의 유세포 분석 결과를 분석했습니다. 도 3b에 나타난 바와 같이, LYVE-1 MicroBeads 자기 비드에 의한 단백질 LYVE-1과 단백질 포도플라닌의 동시발현율은 71.2%인 반면, Fe3로 분류하여 얻은 두 마커의 동시발현율은 O₄ @KCTS-LECs-이중항체 자성나노입자는 88.9%였다. 두 개의 독립 표본 t 테스트 결과 두 그룹 간에 통계적으로 유의한 차이가 있음을 보여주었습니다(P <0.05) (그림 3c).

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림프 내피 세포의 순도 분석. 아 LYVE-1 Microbeads 및 Fe를 사용하여 분류된 분리된 인간 대장암 LEC에서 LYVE-1(빨간색) 및 포도플라닌(녹색)/핵[4,6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI, 파란색)]의 형광 현미경 사진 이중 색상 이미징 ₃ O₄ @KCTS-LECs-이중 항체(축척 막대, 100μm). ㄴ 유세포 분석에 의해 밝혀진 LYVE-1(APC) 및 포도플라닌(FITC)의 공동 발현. ㄷ 유세포 분석 결과, *P <0.05

두 가지 분류 방법으로 얻은 LEC의 생물학적 기능 비교

우리는 두 가지 다른 분류 방법으로 얻은 림프 내피 세포의 생물학적 특성을 추가로 비교했습니다. Matrigel 글루 튜브 테스트 결과는 그림 4a에 나와 있습니다. Fe₃로 정렬하여 얻은 세포 O₄ @KCTS-LECs-이중항체 자성 나노입자는 튜브 형성 능력이 더 강했습니다. 도 4b에 나타난 Dil-ac-LDL 내피 세포 흡수 분석 결과는 LYVE-1 MicroBeads 자기 비드로 분류된 세포에서 적색 형광이 관찰되었지만 Fe3 O₄ @KCTS-LECs-이중항체 자성 나노입자. 이 결과는 Fe₃ O₄ @KCTS-LECs-이중항체 자성나노입자는 순도가 높고 관형성능이 우수하며 내피세포 식균작용이 있어 종양 내 림프내피세포 연구에 적합함을 알 수 있다.

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LEC의 생물학적 기능 비교. 아 시험관 내 Calcein AM(녹색)에 의한 시험관 내 LEC 튜브 형성 능력 측정(스케일 막대, 50μm). ㄴ LYVE-1 Microbeads 및 Fe₃에 의해 분리된 LEC를 사용한 내피 세포 기능의 내피 세포 식세포 작용 분석(DiI 표지, 빨간색, DAPI, 파란색) O₄ @KCTS-LECs-이중항체(스케일바, 100μm)

생체 내 바이모달 이미징 분석

생체 내 이미징의 결과는 그림 5a에 나와 있습니다. Fe₃ 주입 전 종양에서 형광이 없는 것으로 나타났습니다. O₄ @KCTS-LECs-이중항체 자성 나노입자. 주입 후 종양의 형광이 증가하여 12시간에 피크에 도달했습니다. 그 후, 형광은 시간이 지남에 따라 점차적으로 감소하였다. 대조군 폐쇄군에서는 실험 내내 종양으로부터의 형광이 거의 없었다. 24시간 후, 물질은 두 그룹의 마우스 몸에서 완전히 대사된 것으로 관찰되었습니다. 유사하게, 그림 5b에 표시된 자기 공명 영상은 종양 영상이 점차 약화되어 12시간 후에 가장 약한 수준에 도달한 후 시간이 지남에 따라 점진적으로 회복되는 것으로 나타났습니다. 그러나 통제 폐쇄군에서 종양의 영상화력은 거의 변하지 않았다. Fe₃ O₄ @KCTS-LECs-이중항체 자성 나노입자는 생체 내에서 높은 종양 표적화 특성을 가졌습니다.

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NOD/SCID 마우스의 대장암 피하 이종이식 종양 모델의 형광 영상 및 MRI. 아 NOD/SCID 마우스를 마취하고 주입 전 및 주입 후 0.5시간, 12시간 및 24시간에 형광 이미징 시스템으로 영상화했습니다. ㄴ NOD/SCID 마우스를 마취하고 주사 전 및 주사 후 0.5시간, 12시간 및 24시간에 3.0T MRI 스캐너로 영상화했습니다.

자성 나노입자의 시험관 내 및 생체 내 독성

Fe₃로 분류된 LEC에서 자기 나노프로브의 시험관내 세포독성을 평가했습니다. O₄ @KCTS-LECs-이중항체 자성 나노입자. CCK-8 분석 결과, 다양한 농도의 자기 나노프로브와 함께 배양한 후 세포의 생존율이 높았다(Fig. 6a). 이것은 Fe₃ O₄ @KCTS-LECs-이중항체 자성나노입자는 세포독성이 최소입니다. 우리는 생체 내에서 자성 나노 입자의 독성을 추가로 평가했습니다. 암컷 NOD/SCID 마우스를 자기 나노프로브(magnetic nanoprobe)로 처리한 다음 헤마톡실린-에오신(hematoxylin-eosin)으로 염색한 후 주요 장기의 조직 절편을 조사했습니다. 도 6b에 나타난 바와 같이 괴사 또는 염증의 명백한 징후는 관찰되지 않았다. 이러한 결과는 자기 나노프로브가 생체 내에서 독성 효과를 일으키지 않음을 시사한다. 이러한 발견은 본 연구에서 설계된 자기 나노프로브가 동물 및 인간 조사에서 검출 프로브로 적용하기에 적합함을 나타낸다.

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Fe₃의 독성 O₄ @KCTS-LECs-이중항체 자기 나노프로브. 아 LEC를 다양한 농도의 자기 나노프로브와 함께 인큐베이션하고 24시간 및 48시간에 세포 생존율을 측정했습니다. ㄴ NOD/SCID 마우스에 PBS 또는 자기 나노프로브를 처리하고 주요 장기의 절편을 헤마톡실린-에오신으로 염색하고 광학 현미경(스케일 바, 100μm)으로 검사했습니다.

Discussion

It has long been know that transportation through the lymphatic system is an important pathway for tumor cell proliferation. However, compared with vascular endothelial cells (BECs) in blood vessels, LECs, as major components of lymphatic vessels, have not been fully studied. Identification of LECs markers will promote investigations on LECs and make it easier to distinguish them from BECs. LYVE-1 is a type I intact transmembrane glycoprotein receptor composed of 322 amino acid residues [20, 21], and it is presently considered to be the most specific lymphatic endothelial cells marker [22, 23]. Podoplanin is a type I transmembrane salivary mucin-like glycoprotein with a molecular weight of 38 kDa. Current research shows that podoplanin can distinguish lymphatic vessels and blood vessels very well [24, 25]. Therefore, it can be combined with other lymphatic markers to identify LECs. In this study, two antibodies were used to sort LECs, and the purity of the sorted cells was verified by immunofluorescence co-localization, flow double staining, and co-expression. The cells sorted by Fe₃ O₄ @KCTS-LECs-double antibody magnetic nanoparticles displayed similar biological characteristics with LECs, and had stronger tube-forming ability and better phagocytic ability.

Recently, immunomagnetic-based purification methods have been used to separate different cells from mixed cultures, while magnetic beads coated with LYVE-1 or podoplanin antibodies have been used to separate specific subpopulations from crude cells populations [10, 26]. These methods only purify the target subgroups from mixed cultures. It is likely that this not only leads to incomplete isolation of LECs, but also causes contamination of heterogeneous cells such as vascular endothelial cells. Furthermore, these methods are time-consuming and are costly. Previously, several specific lymphoid markers were reported, e.g., LECs were isolated from different tissues primarily by the means of collagenase treatment. However, during primary culture, collagenase treatment may produce a mixture of cells, including vascular endothelial cells and interstitial cells.

In this study, the Fe₃ O₄ @KCTS-LECs-diabody magnetic nano-double targeting probe was constructed using chitosan-coated ferroferric oxide which binds to highly specific target molecules LYVE-1 and podoplanin expressed on lymphatic endothelial cells. The electron microscope analysis showed that the probe had uniform appearance and good dispersibility. Zeta potential reflects the stability of a molecular probe. Highly positive or negative zeta potential values reflect high stability and low capacity to aggregate. It is generally believed that molecules with zeta potential greater than + 30 mV or less than − 30 mV have good stability. In this experiment, the probe had a zeta potential of − 32.8 ± 1.51 mV, which indicates that the probe had good stability.

Fe₃ O₄ is a magnetic nanoparticle oxide which has been widely used in modern medicine and biology because of its unique physical properties. It is particularly used in diagnosis systems based on magnetic resonance imaging and magnetic hyperthermia as well as in cell separation applications. The contrast agents used in MR imaging can be divided into paramagnetic iron oxide nanoparticles (T2-negative contrast agent) and Gd compounds (T1-positive contrast agent). Fe₃ O₄ nanoparticle resonance contrast agent is considered to be a R2-weighted, and its performance is often affected by some factors, such as (a) composition, (b) NP size, (c) surface coating, and (d) synergistic magnetic effect produced by multiple superparamagnetic Fe₃ O₄ NP centers in a small volume [27]. In addition, it can be used in sorting of target cells under the magnetic field effect, that is, after the target cells are combined with specific probes, the target cells are sorted by magnet adsorption. For example, the lymphatic endothelial cells sorted using the probe designed in this study had better tube forming ability and endothelial cell phagocytosis. The relaxation parameter R1 or R2 is typically used to measure the quality of the MRI contrast agent, which describes the ability of the contrast agent T1 or T2 relaxation time [28]. The current NP-based T1 contrast agents are associated with cell toxicity, generating the need for better alternatives. Fe₃ O₄ provides good biocompatibility compared to the above-described cerium-based materials [29]. In this study, we studied the in vitro and in vivo toxicity of the nano-probes modified by chitosan on the surface of Fe₃ O₄ . Our results showed that the probe was suitable for sorting of specific cells, and had low toxicity. It is therefore an ideal material that can be used for culturing of the sorted cells and further research on tumor metastasis through lymphatic vessels.

Here, specific target molecules such as peptides, antibodies, aptamers, etc. were attached to the surface of magnetic nanomaterials, thereby facilitating tumor diagnosis and treatment [30, 31]. This study successfully constructed the Fe₃ O₄ @KCTS-LECs-double antibody magnetic nano-double targeting probe. This probe could bind to specific target molecules, and hence can be used to separate lymphatic endothelial cells and MR/fluorescence imaging.

Conclusions

In summary, a dual targeting magnetic nanoparticle that can detect human cancer is presented in this study. The magnetic nanoparticle probe displays high biosafety and stability. The probe could bind to specific target molecules, thereby enabling sorting of lymphatic endothelial cells. The double antibody coating customized by incorporating self-made magnetic beads produced enabled separation of pure LECs, which reduced sorting time, improved cell activity, and reduced cost. These findings indicate that the magnetic nanoprobe designed in this study is suitable for application as a detection probe in animal and human investigations. This study provides a platform for studying the mechanisms of lymphatic metastasis and role of lymphatic endothelial cells in tumors. Moreover, the Fe₃ O₄ @KCTS-LECs-double antibody magnetic nanoparticles can be applied in fluorescence/MR molecular imaging in vivo, enabling clinical diagnosis of cancer.