인간 혈액 응고 결함의 효과적인 검출을 위한 금 나노입자 기능화에서 ELISA 및 서로 맞물린 전극 표면의 보완

결과 및 토론

PS ELISA 표면에서의 전처리

폴리스티렌(PS) ELISA 표면에 단백질 또는 항체를 효과적으로 고정하면 표적-프로브 상호작용의 검출 한계가 분명히 향상됩니다. ELISA 플레이트에 단백질 또는 항체 부착을 위해 다양한 고정화 방법이 사용되었습니다. 이 작업에서 우리는 단백질 또는 항체 고정을 위해 GNP를 사용하여 화학적으로 변형된 ELISA 표면을 도입했습니다. 우리는 중요하다고 널리 보고된 factor IX(FIX)와 같은 중요한 응고 인자 중 하나를 사용하기를 원했습니다[32,33,34,35,36]. 그림 1은 폴리스티렌 ELISA 표면에 단백질 고정화의 개략도를 보여줍니다. 먼저, ELISA 표면은 1% KOH에 의해 활성화되었습니다. KOH 전처리가 없을 경우 PS 표면에 결합되는 APTES 분자의 수는 최소화됩니다. 이것은 고분자에 APTES의 초기 흡착을 촉진하는 극성 및 수소 결합 수용기가 없기 때문입니다[11]. KOH 처리 후 GNP를 포착하기 위해 APTES의 적절한 농도에 의해 표면이 아민으로 개질되었습니다.

한나라당 특징

더 진행하기 전에 광학, 형태 및 크기 분포 측정을 통해 수신된 GNP(15 nm)를 특성화했습니다. 그림 2a는 GNP의 UV-Vis 분광광도법 분석을 표시하며, 이는 분명히 550 nm에서 피크 최대값을 나타냅니다. 투과 전자 현미경 관찰은 GNP의 크기가 ~ 15 nm이고 모양이 양호함을 보여줍니다(그림 2b 및 삽입). 푸리에 변환 적외선 분광 분석은 파수 500에서 4000 cm ^-1 까지 수행되었습니다. (그림 2c). 1650 cm ⁻¹ 에서 명백한 단일 피크 APTES의 부착을 나타내는 아민 그룹에 대한 피크의 존재와 함께 또 다른 작은 피크와 함께 금에 대해 주목되었습니다. 체적 분포 및 제타 전위 분석에 의해 추가 지원이 제공되었습니다. 이 분석을 바탕으로 부피 분포는 크기 분포에 약간의 변화가 있음을 나타내며(그림 2d) 제타 전위는 - 6.9로 본 연구에 사용된 GNP의 안정성을 나타냅니다(그림 2e).

금 나노 입자의 특성. 최적의 크기 15 nm로 수행. 아 UV-Vis 분광광도법 분석. 550 nm에서 두드러진 단일 피크가 발견되었습니다. ㄴ 투과전자현미경 관찰. 그림 삽입은 확대된 이미지를 보여줍니다. 스케일 바가 표시됩니다. ㄷ 푸리에 변환 적외선 분광 분석. 금과 NH₂에 대한 겉보기 피크 위치 표시됩니다. d GNP의 부피 분포 분석. 얻어진 분포가 표시됩니다. 이 제타 전위 분석. 값은 − 6.9

GNP를 포착하기 위한 아민 표면의 준비 및 최적화

APTES의 양은 PS 표면에 GNP 또는 항체의 고정화에 큰 영향을 미칩니다. 일반적으로 고도로 밀집된 APTES 분자는 위양성 결과를 생성할 가능성이 있습니다. APTES는 여러 센서 표면에 항체를 고정시키기 위해 1~2%로 사용되었기 때문에 여기에서는 무수 에탄올에서 준비된 1.25~5% APTES를 적정했습니다. 다음으로 우리의 목표는 APTES 수정 표면에 GNP를 고정시키는 것이었습니다. 더 많은 수의 GNP가 군집 효과를 생성할 가능성이 있으므로 적절한 희석을 최적화하기 위해 APTES 수정 표면에서 15nm의 25, 50 또는 100%를 갖는 GNP를 테스트했습니다. 이러한 변형된 표면에서 250 nM의 FIX가 FIX 항체로 검출되었습니다. 그림 2a 및 b에서 볼 수 있듯이 1.25% APTES는 모든 GNP 희석(25, 50 및 100%)에서 더 적은 광학 흡광도(OD)를 나타내는 반면, 2.5 및 5% APTES는 50 및 100% 모두에서 더 높은 흡광도를 나타냅니다. 한나라당. 동시에 APTES 및 GNP 농도가 증가함에 따라 신호 대 잡음비가 개선되었습니다(그림 3a, b). 50% APTES와 100% GNP는 비특이적 결합을 보였고, 50%와 100% GNP와 2.5% APTES는 유사한 흡광도를 보였다. 이렇게 얻은 값을 기반으로 추가 실험을 위해 2.5% APTES 및 25% GNP 희석을 선택했습니다.

APTES 및 GNP의 양 결정. 세 가지 다른 농도(1.25, 2.5, 5%)의 APTES와 세 가지 GNP(25, 50, 100%) 희석액을 사용했습니다. 아 기질을 추가한 후 FIX의 시각적 감지. FIX가 없는 제어 레인이 포함되었습니다. ㄴ 최적의 APTES 레벨의 그래픽 표현. 2.5% APTES 및 25% GNP가 최적인 것으로 밝혀졌습니다.

잠재적 GNP 규모 결정

APTES 및 GNP 희석 최적화 후, 우리는 다음으로 적절한 GNP 크기를 평가했습니다. 표면적이 단백질 고정화에 중요한 역할을 하기 때문에 여기에서는 10, 15 및 80 nm를 포함하여 세 가지 크기의 GNP를 고정화하려고 했습니다. 크기가 다른 GNP는 단백질을 끌어당기는 표면적과 전하가 다르며 APTES로 변형된 표면의 결합 능력도 다릅니다. 도 4a에 도시된 바와 같이, 250 nM FIX가 10, 15 및 80 nm GNP로 변형된 ELISA 표면으로 검출되었다. 15 및 80 nm GNP는 250 nM의 FIX 검출에 대해 0.4(OD)와 거의 동일한 흡광도를 나타내지만 10nm 크기의 GNP는 0.34 OD에 불과한 것으로 나타났습니다. 이 실험에서 우리는 15 또는 80 nm GNP가 추가 실험에 적합함을 확인했으며 15 nm GNP로 계속 진행했습니다.

아 GNP의 이상적인 크기를 결정합니다. 10, 15, 80 nm 중에서 15와 80 nm는 비슷한 결과를 보였다. FIX로 검출 한계를 결정하기 위해 15나노미터가 사용되었습니다. ㄴ FIX 검출을 위한 대조 실험. 세 가지 다른 대조군 실험(C1 - FIX 항체 없음, C2 - 항-마우스 IgG 없음, C3 - FIX 없음)을 수행했습니다. 어떤 대조군 실험에서도 유의미한 신호가 발견되지 않았습니다. 그림 삽입은 시각적 결과를 표시합니다.

무오염 및 고성능 확인을 위한 실험 전략

GNP로 수정된 ELISA 표면에서 FIX를 감지하기 전에 "재료 및 방법" 섹션에 설명된 대로 세 가지 종류의 제어 실험을 수행했습니다. 도 4b에 도시된 바와 같이, 대조군 실험 1, 2 및 3(C1, C2 및 C3)에 대한 웰에서 유의한 흡광도를 관찰할 수 없었다. 특정 실험(S)에서 더 높은 수준의 흡광도는 명백한 색상 변화와 명확하게 연관됩니다. C1의 경우 FIX 항체를 추가하지 않았으며 이는 FIX 항체가 FIX와 특이적으로 상호작용함을 확인합니다(in S). C2에서 항-마우스 IgG가 없는 경우 관찰 가능한 신호가 발견되지 않았으며, 이는 FIX와 항체에 이어 항-마우스 IgG의 적절한 상호작용을 위한 추가 고정을 제공합니다. C3에서는 FIX가 없으면 유의한 흡광도를 측정할 수 없습니다. 이러한 결과로부터 ELISA 표면에서 FIX와 그 항체의 적절한 상호작용은 비특이적 결합 없이 확인되었다.

GNP 지원 ELISA 대 기존 ELISA:민감도 측정

대조 실험을 수행한 후 GNP로 수정된 표면으로 FIX를 검출하고 그 결과를 기존의 ELISA 방법과 비교했습니다. 우리는 FIX의 검출을 위해 세 가지 다른 실험을 수행했습니다. 먼저 APTES로 변형된 표면에 GNP를 고정화한 다음 정전기적 상호작용을 통해 FIX를 GNP 표면에 부착시켰다. 정전기적 상호작용으로 인해 대부분의 단백질은 GNP 표면에 결합할 가능성이 있습니다. 그런 식으로 ELISA PS 표면에 FIX를 고정할 수 있습니다. 단백질 고정화는 또한 아미노산과 GNP에서 발생하는 전하에 따라 달라집니다. Gopinathet al. [37]은 GNP 표면에 FIX의 강한 결합을 증명했으며, 높은 염분 조건에서도 안정하다는 것을 발견했습니다. 두 번째 방법에서 GNP와 단백질은 아민화된 ELISA PS 표면에 고정되기 전에 먼저 사전 혼합되었습니다. 단백질 분자가 용액 상태에서 GNP 표면에 결합할 가능성이 더 높기 때문에 이러한 방식으로 더 많은 단백질이 결합할 수 있을 것으로 예상했다. 그런 다음 미리 혼합된 용액을 APTES-개질된 아민 표면에 고정화했습니다. 이들 방법을 기존의 ELISA 방법과 비교하였다. Fig. 5a에서 보는 바와 같이 FIX 농도를 0에서 200 nM으로 적정하였을 때 기존의 ELISA(방법 1)에서는 6 nM의 검출한계를 보였다. APTES-GNP-FIX 방식(방식 2)은 검출한계가 200pM으로 기존 ELISA에 비해 30배 이상 높은 감도를 보인다. 감도 향상은 ELISA PS 플레이트에 고정된 많은 수의 항원의 적절한 방향을 통해 달성되며 궁극적으로 더 많은 항체가 상호 작용할 것입니다. 이 연구에서 금 나노입자는 ELISA 플레이트의 아민 변형을 통해 더 많은 항원을 고정시키는 데 사용되었습니다. 기존의 ELISA에서 항원은 ELISA 플레이트에 직접 고정되어 표면에 결합하는 분자의 수가 적고 현재의 금 나노입자 매개 전략에 비해 감도가 감소합니다. 또한, 국부적 표면 플라즈몬 공명은 GNP에 대한 연구에서 밝혀진 바와 같이 감도를 더욱 향상시킵니다. GNP와 FIX를 premix하면 예상대로 검출 한계가 크게 개선되어 기존 ELISA보다 60배 높은 감도인 100pM 수준에 도달했습니다. 그림 5a에서 볼 수 있듯이 단백질 고정을 위해 GNP를 사용할 때 GNP 표면에 미리 혼합된 단백질과 직접 고정된 단백질 모두에서 최대 흡광도가 ~ 0.6에 도달했지만 기존의 ELISA로 발견된 흡광도는 ~ 0.4입니다. FIX의 유사한 농도(200 nM). 다른 농도의 경우에도 방법 3은 기존 ELISA에 비해 흡광도 차이가 높았고, 이 역시 방법 2에 비해 상당히 높았다. 기존 ELISA의 경우 25 nM, 3 nM에서 가시광선 검출이 나타났다. 방법 2에서. 방법 3을 사용하면 더 높은 흡광도로 인해 FIX의 200pM에서 색상 변화를 눈으로 볼 수 있었습니다(그림 5a). 방법 3에서 흡광도는 25 nM에서 포화되었습니다. FIX의 200pM에서 색상 변화를 시각화할 수 있었기 때문에 검출 한계를 평가하고 더 낮은 농도의 FIX를 사용하여 적정했습니다. GNP와 FIX를 미리 혼합했을 때 검출 한계가 100pM에 도달했음이 분명했습니다(그림 5b).

아 GNP-modified ELISA에서 FIX의 감도와 기존 ELISA 비교. FIX를 0.2에서 200 nM으로 적정하였다. 기존 ELISA는 6 nM의 검출 한계를 나타냅니다. GNP-modified ELISA에서 신호는 200pM까지 관찰되었다. 그림 삽입은 시각적 결과를 표시합니다. ㄴ GNP 변형 ELISA 플레이트에서 FIX의 검출 한계. FIX를 25 pM에서 100 pM으로 적정하였다. 검출한계는 오후 100시로 밝혀졌다. 그림 삽입은 시각적 결과를 표시합니다.

인간 혈청 내 FIX 검출 및 스파이킹 FIX에 의한 향상

FIX가 응고 캐스케이드에서 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀졌기 때문에[38, 39], 검출 한계를 확인한 후 인간 혈청에서도 FIX를 검출했습니다. 이 분석을 위해 우리는 1:1280에서 1:20 희석 사이의 범위에서 인간 혈청을 적정했습니다. 희석된 혈청을 GNP와 미리 혼합하고 위에서 언급한 바와 같이 APTES-변형 ELISA 표면에 고정화했습니다. FIX가 125 pM FIX에 해당하는 1:640의 혈청 희석액에서 검출되었음을 알 수 있습니다(그림 6a). 건강한 인간 혈청에는 일반적으로 알부민 및 글로불린과 같은 다른 주요 단백질과 함께 약 87 nM FIX가 포함되어 있습니다. 우리의 전략으로 우리는 인간 혈청에서 125pM의 특정 검출 한계에 도달했으며 이는 혈액 응고 결함을 식별하는 데 유용합니다. 반면에, 인간 혈청의 1:640 희석액에 FIX를 1에서 8 nM으로 스파이크했을 때 FIX 농도와 함께 증가하는 흡광도 증가를 나타냈습니다(그림 6b).

아 인간 혈청에서 FIX의 검출. 인간 혈청을 1:20에서 1:1280으로 희석했습니다. FIX는 1:640으로 희석된 인간 혈청에서 검출되었습니다(내부 그림은 개략도를 나타냄). ㄴ 인간 혈청의 1:640 희석액에 FIX(0.125~8 nM)를 스파이킹합니다. FIX 농도가 증가함에 따라 흡광도가 증가했습니다. 그림 삽입은 시각적 결과를 표시합니다.

IDE 표면에서 GNP-FIX 감지:보완 분석

GNP-conjugated FIX가 검출 한계를 개선한 것으로 밝혀졌기 때문에 우리는 이러한 발견을 보완하기 위해 IDE 표면이 있는 전기화학 센서를 사용하여 유사한 전략을 적용했습니다. 우리는 FIX를 25에서 200pM(GNP와 혼합)으로 적정하고 아민 수정된 IDE 표면에 고정한 다음 FIX 항체로 검출했습니다. 도 7a에 도시된 바와 같이, FIX 농도가 증가함에 따라 전류 레벨도 기준선에서 동시에 증가하였다. FIX 수준은 200pM부터 포화되었고, 검출한계는 25pM인 것으로 밝혀졌다. 이 검출은 ELISA(100pM)에 비해 4배 향상되었습니다. 또한, 희석된 인간 혈청에서 FIX 검출이 입증되었다(도 7b). 이 실험을 위해 인간 혈청을 1:80에서 1:1280으로 희석했습니다. 그림에서 볼 수 있듯이 1:1280의 희석(빨간색 곡선)은 3σ 추정으로 기준선(검은색 곡선)과 명백한 차이를 보여 1:1280의 희석으로 인간 혈청에서 FIX의 명백한 검출이 일치함을 나타냅니다. ELISA 결과(1:640에서 감지). 희석도가 낮은 IDE에서 감지하면 감도가 증가합니다.

아 Limit of detection of FIX-conjugated GNP on IDE sensing surface. FIX was titrated from 25 to 400 pM. The limit of detection was found to be 25 pM. ㄴ Detection of FIX in human serum on the IDE sensing surface. Human serum was diluted from 1:80 to 1:1280. FIX was detected in human serum diluted 1:1280